CN109550082A - 一种脱细胞基质凝胶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种脱细胞基质凝胶的制备方法，其除了采用温和的脱细胞法，还在脱细胞基质进行消化后，创新地将消化液在压力为50‑200atm、温度为30‑40℃的二氧化碳气氛下进行处理，发现相较于其它常规处理，所得凝胶对组织的修复能力更好。

Description

一种脱细胞基质凝胶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其是涉及一种脱细胞基质凝胶的制备方法。
背景技术
组织器官的修复与重建是指组织、器官损伤后由临近健康细胞通过再生来修补恢复的过程，由于组织自发愈合过程固有的缺陷，一旦组织和器官出现缺损或功能障碍时，就会造成一定程度上的再生障碍或者是永久性缺损。因此组织器官的修复与重建一直是生物、医学等相关领域的焦点。伴随着对组织再生修复机制及组织工程学研究的开展和深入，寻找及研制各种有应用价值的可吸收并能促进再生的生物物质，已经成为该领域的一个热点。
细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是由动物细胞合成并分泌到细胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要成分包括胶原纤维、糖蛋白、黏蛋白等，其他成分有氨基葡聚糖(透明质酸、硫酸软骨素)等糖类，还有一些脂质和生长因子。这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构，调节组织的发生和细胞的生理活动，在细胞迁移、分化和增殖方面有着重要的作用。
异种或异体细胞抗原由于被宿主认为是外来体，因此引发了宿主的炎性反应和免疫介导的排斥反应。然而细胞外基质是结构蛋白和功能蛋白的复合物，该组分常常在不同物种间保守，并能被异种受体耐受。许多动物组织器官和人体具有相似的细胞外基质成分和结构，通过脱细胞技术获得的ECM生物支架已被广泛应用与人体组织重建，如心脏膜瓣、皮肤、肌腱和硬脑膜等，其三维结构与体内细胞生长的天然环境接近，不仅可以起着支架材料的作用，而且包含多种生长因子，在组织修复和重建中有重要促进作用。
因此，本发明提供一种新型的脱细胞基质凝胶的制备方法，该方法工艺简单，能最大限定的保留细胞外基质成分的活性，安全性高，适用性强，修复人体受损组织器官具有特异性，能够诱导组织再生修复。
发明内容
本发明提供一种脱细胞基质凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1.取新鲜动物周围组织，剪去表面的脂肪组织和部分外膜，置蒸馏水中震荡、漂洗一定时间后，通过2次循环萃取脱去组织中的细胞并洗去会造成免疫反应的物质，然后进行剪碎；
S2.用含去垢剂的PBS缓冲溶液脱除细胞膜脂质成分，脱除处理后采用PBS缓冲液清洗；
S3.用含有生物酶的PBS缓冲液进行脱细胞；
S4.将脱细胞基质置于酸性蛋白酶溶液中消化得消化液；
S5.使消化液在压力为50-200atm、温度为30-38℃的二氧化碳气氛下保持24-48h，即可生成脱细胞基质凝胶。
优选地，S2中所述去垢剂的浓度为0.1～2wt％；去垢剂的种类选自曲拉通X-100、脱氧胆酸钠、平平加，以及十二烷基磺酸钠中的任一种。
优选地，S3中所述生物酶为磷脂酶，浓度为350-5000U/ml。
优选地，S3中所述生物酶为蛋白酶，浓度为100-2000U/ml。
优选地，S4中所述酸性蛋白酶为胃蛋白酶。
优选地，其包括S6采用环氧乙烷进行杀菌。
本发明的创新点是：
(1)制备凝胶的方法简单，条件温和，对细胞外基质中的营养因子和生长因子破坏小，修复效果好；
(2)在脱细胞基质进行消化后，首次将消化液在压力为50-200atm、温度为30-40℃的二氧化碳气氛下进行处理，发现相较于其它常规处理，所得凝胶对组织的修复能力更好；
(3)本发明提供的脱细胞方法也温和有效，通过将动物组织剪碎有利于去垢剂和磷脂酶渗透到组织内部，缩短了脱细胞时间，并且能在更温和的条件下彻底脱除细胞成分，对细胞外基质的成分和超微结构的破坏程度小。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1
一种脱细胞基质凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1.取新鲜动物周围组织，剪去表面的脂肪组织和部分外膜，置蒸馏水中震荡、漂洗一定时间后，通过2次循环萃取脱去组织中的细胞并洗去会造成免疫反应的物质，然后进行剪碎；
S2.用含0.1wt％曲拉通X-100的PBS缓冲溶液脱除细胞膜脂质成分，脱除处理后采用PBS缓冲液清洗；
S3.用含有350U/ml磷脂酶的PBS缓冲液进行脱细胞；
S4.将脱细胞基质置于胃蛋白酶溶液中消化得消化液；
S5.使消化液在压力为50atm、温度为30℃的二氧化碳气氛下保持24h，即可生成脱细胞基质凝胶；
S6.采用环氧乙烷进行杀菌。
实施例2
一种脱细胞基质凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1.取新鲜动物周围组织，剪去表面的脂肪组织和部分外膜，置蒸馏水中震荡、漂洗一定时间后，通过2次循环萃取脱去组织中的细胞并洗去会造成免疫反应的物质，然后进行剪碎；
S2.用含2.0wt％脱氧胆酸钠的PBS缓冲溶液脱除细胞膜脂质成分，脱除处理后采用PBS缓冲液清洗；
S3.用含有5000U/ml磷脂酶的PBS缓冲液进行脱细胞；
S4.将脱细胞基质置于胃蛋白酶溶液中消化得消化液；
S5.使消化液在压力为200atm、温度为38℃的二氧化碳气氛下保持48h，即可生成脱细胞基质凝胶；
S6.采用环氧乙烷进行杀菌。
实施例3
一种脱细胞基质凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1.取新鲜动物周围组织，剪去表面的脂肪组织和部分外膜，置蒸馏水中震荡、漂洗一定时间后，通过2次循环萃取脱去组织中的细胞并洗去会造成免疫反应的物质，然后进行剪碎；
S2.用含1.0wt％平平加的PBS缓冲溶液脱除细胞膜脂质成分，脱除处理后采用PBS缓冲液清洗；
S3.用含有2000U/ml蛋白酶的PBS缓冲液进行脱细胞；
S4.将脱细胞基质置于胃蛋白酶溶液中消化得消化液；
S5.使消化液在压力为100atm、温度为35℃的二氧化碳气氛下保持36h，即可生成脱细胞基质凝胶；
S6.采用环氧乙烷进行杀菌。
实施例4
一种脱细胞基质凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1.取新鲜动物周围组织，剪去表面的脂肪组织和部分外膜，置蒸馏水中震荡、漂洗一定时间后，通过2次循环萃取脱去组织中的细胞并洗去会造成免疫反应的物质，然后进行剪碎；
S2.用含0.1wt％十二烷基磺酸钠的PBS缓冲溶液脱除细胞膜脂质成分，脱除处理后采用PBS缓冲液清洗；
S3.用含有100U/ml蛋白酶的PBS缓冲液进行脱细胞；
S4.将脱细胞基质置于胃蛋白酶溶液中消化得消化液；
S5.使消化液在压力为70atm、温度为37℃的二氧化碳气氛下保持48h，即可生成脱细胞基质凝胶；
S6.采用环氧乙烷进行杀菌。
对比例1
S6中使消化液在37℃孵育48h得脱细胞基质凝胶，其余同实施例1。
对比例2
S6中使消化液在37℃孵育48h得脱细胞基质凝胶，其余同实施例2。
对比例3
S6中使消化液在37℃孵育48h得脱细胞基质凝胶，其余同实施例3。
对比例4
S6中使消化液在37℃孵育48h得脱细胞基质凝胶，其余同实施例4。
性能测试
实施例1-4取牛坐骨神经，将制得的脱细胞基质修复凝胶注入神经导管，用大鼠做了动物评估实验，以注入牛坐骨神经脱细胞基质修复凝胶的神经导管桥接大鼠坐骨神经8mm缺损，术后60天进行组织切片观察，结果表明神经导管内有大量新生神经轴突，大鼠坐骨神经功能恢复良好。
实施例1-4取猪真皮，将制得的猪真皮脱细胞基质修复凝胶涂敷治疗人体皮肤二度烫伤，45天后可见皮肤修复完全，并且不留疤痕。可见猪真皮来源的脱细胞基质修复凝胶对病患皮肤疾病或损伤的治疗确实有效。
对比例1-4分别与实施例1-4的性能测试结果表明，实施例1-4所制备的脱细质基质凝胶，修复速度更快，修复效果更佳。

Claims (6)

1.一种脱细胞基质凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.取新鲜动物周围组织，剪去表面的脂肪组织和部分外膜，置蒸馏水中震荡、漂洗一定时间后，通过2次循环萃取脱去组织中的细胞并洗去会造成免疫反应的物质，然后进行剪醉；
S2.用含去垢剂的PBS缓冲溶液脱除细胞膜脂质成分，脱除处理后采用PBS缓冲液清洗；
S3.用含有生物酶的PBS缓冲液进行脱细胞；
S4.将脱细胞基质置于酸性蛋白酶溶液中消化得消化液；
S5.使消化液在压力为50-200atm、温度为30-38℃的二氧化碳气氛下保持24-48h，即可生成脱细胞基质凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种脱细胞基质凝胶的制备方法，其特征在于，S2中所述去垢剂的浓度为0.1～2wt％；去垢剂的种类选自曲拉通X-100、脱氧胆酸钠、平平加，以及十二烷基磺酸钠中的任一种。
3.根据权利要求1所述的一种脱细胞基质凝胶的制备方法，其特征在于，S3中所述生物酶为磷脂酶，浓度为350-5000U/ml。
4.根据权利要求1所述的一种脱细胞基质凝胶的制备方法，其特征在于，S3中所述生物酶为蛋白酶，浓度为100-2000U/ml。
5.根据权利要求1所述的一种脱细胞基质凝胶的制备方法，其特征在于，S4中所述酸性蛋白酶为胃蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的一种脱细胞基质凝胶的制备方法，其特征在于，其包括S6采用环氧乙烷进行杀菌。
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