CN105169483A - 一种脱细胞基质凝胶的制备方法及其脱细胞基质凝胶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用脱细胞技术处理天然的组织或器官，经过后续打粉、酶消化处理得到脱细胞基质溶液，通过温和的条件即可将脱细胞基质溶液制备得到各种形状和性质的脱细胞基质凝胶，本发明制备方法制备得的脱细胞基质凝胶可用于可注射凝胶以及可加工成型凝胶两个方面，并且形成的凝胶具有微观的纳米纤维结构，该微观结构对于调节细胞的行为具有积极效应。

Description

一种脱细胞基质凝胶的制备方法及其脱细胞基质凝胶

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，尤其是涉及一种脱细胞基质凝胶的制备方法及其脱细胞基质凝胶。

背景技术

水凝胶因其柔韧、多孔、可随意改变形状和强度可调控的特性越来越多的被用于组织工程中。合成的高分子凝胶虽然具有很好的性质可调控行，但本身均为生物惰性，在组织工程应用中无法为细胞和组织的生长提供促进的生物功能。所以，在组织工程应用中，能提供生物活性的天然高分子会被选择作为主要的组分或活性组分。

天然高分子水凝胶经常会利用到琼脂糖、胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖、纤维蛋白等，按其成型方式又可分为物理作用和化学作用成胶。物理成胶主要是受温度或pH控制的：例如琼脂糖和明胶随着温度的降低而成胶，甲基纤维素和胶原随着温度的升高而成胶，壳聚糖则是随着pH的升高而成胶。化学成胶则是通过化学修饰引入新的功能基团如双键、巯基等，或利用本身自带的羧基或氨基等，再利用化学交联剂，例如先在透明质酸羧基上引入呋喃基团，利用两端修饰马来酰亚胺的PEG与呋喃环化学交联成胶；或是加入光引发剂，例如在明胶上引入双键，再紫外光照下光交联成胶。其中胶原自发形成的物理交联水凝胶和双键修饰的HA光交联水凝胶可以得到微观的纳米纤维结构，这种微观结构对于细胞行为的调控具有积极的意义。但是这些都是单一的组分，无法完全模拟由多种组分混合构成的天然组织，提供的生物学功能也十分有限。

于是，利用脱细胞技术直接去除组织中会引起免疫排斥反应的细胞和DNA，将剩下的保留有天然组织大部分成分的脱细胞基质作为支架材料，在组织工程的各个方面，如神经、肝脏、骨、肌肉、肌腱、心脏等方面的研究逐渐增多。脱细胞基质在皮肤再生/修复、神经修复、防粘连膜、组织填充等方面已经有上市的应用产品。这些脱细胞基质材料虽然保留了主要的活性成分，但在脱细胞的处理过程中和植入体内后难免会发生形变、内部空间坍塌等现象，具有批次差异性，很难实现与患者伤处的匹配。

因此，本发明提供一种温和的脱细胞技术，并且利用后续的打粉、消化处理得到脱细胞基质溶液在人体生理条件即可制备力学性能可控和形状可控，并具有微观纳米纤维网络结构的水凝胶产品。

发明内容

本发明为了克服传统的天然高分子凝胶组分单一，生物功能单一的缺点；克服传统的脱细胞基质材料易变形，批次差异性大，加工性差，难以与患者伤处充分匹配的缺点，提供了一种脱细胞基质凝胶的制备方法及其脱细胞基质凝胶，本发明制备方法是将脱细胞基质经过打粉、消化的后续处理，在人体正常生理条件下温和成胶的技术，该成胶技术可用于可注射凝胶以及可加工成型凝胶两个方面，并且形成的凝胶具有微观的纳米纤维结构，该微观结构对于调节细胞的行为具有积极效应。

本发明的技术方案为：一种脱细胞基质凝胶的制备方法，包括如下步骤：

a、取源于人源或非人源的组织或器官在常温下加入水溶液经震荡、漂洗、萃取，脱去组织中的细胞，洗去可能造成免疫反应的DNA等物质，获得脱细胞基质。

b、将步骤a获得的脱细胞基质冷冻干燥，打碎成粉末，制得脱细胞基质粉末，用胃蛋白酶的盐酸溶液消化脱细胞基质粉末6h-48h，将消化脱细胞基质粉末后所得的消化液进行超速离心，取上清液低温储存待用，获得的上清液即为脱细胞基质预凝胶溶液；

C、用NaOH溶液调节脱细胞基质预凝胶溶液至中性(ph＝7.4)，低温下加入1/9脱细胞基质预凝胶溶液体积的10×PBS(PBS一般使用浓度与生理盐水渗透压相近,10×一般是指原PBS盐浓度的十倍)，37℃下静置培养数分钟后生成凝胶。

所述脱细胞基质的主要来源可分为人源和非人源(猪、狗、兔等哺乳类动物)，其中人源性的脱细胞基质跟人体的组织器官成分更接近，但面临着来源供体有限的问题，所以可考虑从猪等来源广泛供体中提取替代。除了来源以外，脱细胞基质根据提取的组织和器官的不同，基质成分和含量也会有一定区别，主要取自神经、脊髓、肌腱、肌肉、心脏、肝脏、肾脏、软骨等组织，取自不同的组织的脱细胞基质可用于不同的组织修复，当组分的种类和含量接近时也可用于与取材部位不同的组织的修复；经粉碎得到脱细胞基质粉末可以用胃蛋白酶消化得到均一的脱细胞基质的溶液，通过调控脱细胞基质的浓度、消化时间，在正常的生理条件下(37℃，PH＝7.4，1xPBS)，即可以得到强度不同的脱细胞基质凝胶。因此可以以溶液的形式直接注射入体内，原位自发成胶填补缺损区域；也可以在体外加工成型制得特定形状的水凝胶再植入体内应用。

此外，因为脱细胞基质的主要成分为胶原、多糖、蛋白聚糖、生长因子等，因此胶原、多糖等组分在成胶的过程中可以通过自组装的方式得到微观的纳米纤维结构，这种微观的纳米纤维结构已经被证实对于组织修复中细胞的生长、迁移、分化等具有指导和促进作用。可以利用胶原纤维等物理自组装形成的水凝胶的机理，将营养因子(如NGF、NT-3、BDNF等)或促进修复的药物通过物理缠结包裹的作用很好的固定在水凝胶内部，达到一种持续缓释的效果。

所述水溶液包括并不限于蒸馏水、Triton-X100或脱氧胆酸钠水溶液中的一种或多种。

优选地，本发明脱细胞基质凝胶的制备方法包括如下步骤：

(1)取新鲜猪周围组织，剪去表面的脂肪组织和部分外膜，置蒸馏水中震荡、漂洗一定时间后，通过2次循环萃取脱去组织中的细胞并洗去可能造成免疫反应的DNA等物质，获得脱细胞基质；

(2)将脱细胞基质进行冷冻干燥，再用粉碎机把脱细胞基质磨成粉末，获得脱细胞基质粉末；

(3)把适量的胃蛋白酶、脱细胞基质粉末加入0.01mol/LHcl溶液中，在室温(25℃)下保持恒定搅拌6h-48h，超速离心除去未消化的大颗粒物；取上清液低温储存待用，获得脱细胞基质预凝胶溶液；

(4)将低温储存的脱细胞基质预凝胶溶液取出后加入适量的0.1mol/L氢氧化钠调节脱细胞基质预凝胶溶液至中性(ph＝7.4)并加入1/9脱细胞基质预凝胶溶液体积的10×PBS，并用pH值为7.4的PBS调整至溶液所需的体积和浓度，再放置于37℃下静置数分钟即可形成凝胶。

所述2次循环萃取具体过程为：萃取时将组织放入3％的Triton-X100水溶液中振荡12h，然后在蒸馏水中漂洗3次，再放入4％的脱氧胆酸钠水溶液中室温下震荡24h，最后在蒸馏水中漂洗3次，如此一个循环为萃取1次，共进行两次循环萃取。

所述脱细胞基质粉末直径约为200μm，该直径有助于脱细胞基质粉末溶于含有胃蛋白酶的盐酸溶液。

所述低温储存为-40℃—6℃。

本发明制备方法所得的脱细胞基质凝胶，其可以自发的形成纳米纤维网络结构，这种纳米纤维结构对于组织修复具有很好的促进作用。

上述的脱细胞基质凝胶在强度和降解时间上与部分天然组织的模量和修复时间所需时间相比，可能会有不足之处，因此当面对模量较大的组织(心脏、软骨等)和修复时间较长的需求时，可以通过引入交联剂后化学交联的方式增加脱细胞基质凝胶的力学强度和降解时间。

所述交联剂主要包括并不限于：醛类(如戊二醛、甲醛等)、天然提取物(京尼平、玫瑰红等)。

进一步地，一种脱细胞基质凝胶，包括如下组分：脱细胞基质、交联剂、消化液，其具有纳米纤维网络结构。

优选地，本发明脱细胞基质凝胶，包括如下质量百分比的组分：脱细胞基质含量0.01～10％、交联剂0.1％～20％、消化液余量，所述消化液为含有胃蛋白酶的盐酸溶液。

本发明的有益效果为：

1、本发明的脱细胞基质的成分与天然组织成分基本接近，可以提供良好的生物功能；

2、本发明的脱细胞基质凝胶制备方法的成型条件为正常的人体生理条件，适宜体内应用，可直接注射使用，也可体外成型后植入体内使用；

3、本发明的脱细胞基质凝胶的力学性能和降解时间具有可控性，可以通过调节脱细胞基质的含量、消化时间、引入交联剂的方式增大凝胶模量，延长降解时间，来适用不同的组织修复需求；

4、本发明的脱细胞基质凝胶可以自发的形成纳米纤维网络结构，这种纳米纤维结构对于组织修复具有很好的促进作用；

5、本发明的脱细胞基质物理自组装成型的机理可以用来固定营养因子、药物等促进再生和修复的成分，达到一个持续缓释起效的作用。

附图说明

图1为脱细胞基质粉末的微观结构图；

图2为脱细胞基质的预凝胶溶液和凝胶状态图；

图3为脱细胞基质凝胶的SEM图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步阐述。

实例1

一种脱细胞基质凝胶的具体制备方法如下：

(1)取猪新鲜周围神经，剪去表面的脂肪组织和部分神经外膜，置蒸馏水中震荡、漂洗6h，萃取时将神经放入3％的Triton-X100水溶液中振荡12h，然后在蒸馏水中漂洗3次，再放入4％的脱氧胆酸钠水溶液中室温下震荡24h，最后在蒸馏水中漂洗3次，如此一个循环为萃取1次，一共进行2次循环；通过2次循环萃取脱去神经中的细胞并洗去可能造成免疫反应的DNA等物质，获得脱细胞猪神经。

(2)将脱细胞猪神经进行冷冻干燥，再用粉碎机把脱细胞猪神经磨成粉末，粉末直径约为200μm，微观结构如图1所示；把1份胃蛋白酶、10份脱细胞神经加入100份0.01mol/LHcl溶液中，在室温(25℃)下保持恒定搅拌24h，超速离心除去未消化的大颗粒物；取上清液低温储存待用，获得脱细胞猪神经预凝胶溶液；

(3)将步骤(2)获得脱细胞猪神经预凝胶溶液在4℃下加入1/10预凝胶溶液体积的0.1mol/L氢氧化钠调节脱细胞猪神经预凝胶溶液至中性(ph＝7.4)并加入和1/9预凝胶溶液的体积的10×PBS，并在4℃下用pH值为7.4的PBS缓冲溶液调整至溶液所需的体积和浓度，获得脱细胞猪神经凝胶溶液，溶液再放置于37℃下静置数分钟即可形成凝胶，其预凝胶溶液(左)状态和凝胶(右)状态如图2所示。

取不同百分比含量的脱细胞猪神经凝胶在电子扫描显微镜下观察得到的结果如图3所示(a、b为0.5％wt脱细胞基质溶液形成凝胶；c、d为1％wt脱细胞基质溶液形成的凝胶)，可以看出清晰的纳米纤维网络结构，这纳米纤维网络结构主要由脱细胞基质中的胶原组分物理缠结自组装形成，对于后续的体内修复过程具有良好的促进意义。

实例2

一种本发明脱细胞基质凝胶的具体制备方法如下：

(1)取猪新鲜周围肌腱，剪去表面的脂肪组织和部分肌腱外膜，置蒸馏水中震荡、漂洗6h，萃取时将神经放入3％的Triton-X100水溶液中振荡12h，然后在蒸馏水中漂洗3次，再放入4％的脱氧胆酸钠水溶液中室温下震荡24h，最后在蒸馏水中漂洗3次，如此一个循环为萃取1次，一共进行2次循环；通过2次循环萃取脱去神经中的细胞并洗去可能造成免疫反应的DNA等物质，获得脱细胞猪肌腱；

(2)将脱细胞猪肌腱进行冷冻干燥，再用粉碎机把脱细胞猪肌腱磨成粉末，粉末直径约为200μm，把1份胃蛋白酶、10份脱细胞肌腱加入100份0.01mol/LHCl溶液中，在室温(25℃)下保持恒定搅拌24h，超速离心除去未消化大颗粒物；取上清液低温储存待用，获得脱细胞猪肌腱预凝胶溶液；

(3)将步骤(2)获得的脱细胞猪肌腱预凝胶溶液在4℃下加入1/10预凝胶溶液体积的0.1mol/L氢氧化钠调节脱细胞猪肌腱预凝胶溶液至中性(ph＝7.4)并加入和1/9预凝胶溶液的体积的10×PBS，并在4℃下用pH值为7.4的PBS溶液调整溶液至所需的体积和浓度，获得脱细胞猪肌腱凝胶溶液，溶液再放置于37℃下静置数分钟即可形成凝胶。

(4)将制得脱细胞猪肌腱凝胶在电子扫描显微镜下观察得到的结果与实例1类似。

本发明的脱细胞基质凝胶制备技术，成型条件温和，与人体正常生理条件相同，可直接注射体内原位成型使用，也可以体外成型制备特定形状后再植入体内使用。经扫描电镜显示，成型后，具有良好的互穿型微观纳米纤维结构，对于后续的体内修复具有良好的促进作用。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同替换和改进，均应包含在本发明技术方案的保护范围内。

Claims (10)

1.一种脱细胞基质凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

a、取源于人源或非人源的组织或器官在常温下加入水溶液经震荡、漂洗、萃取，脱去组织中的细胞，洗去可能造成免疫反应的DNA等物质，获得脱细胞基质；

b、将步骤a获得的脱细胞基质冷冻干燥，打碎成粉末，制得脱细胞基质粉末，用胃蛋白酶的盐酸溶液消化脱细胞基质粉末6h-48h，将消化脱细胞基质粉末后所得的消化液进行超速离心，取上清液低温储存待用，获得的上清液即为脱细胞基质预凝胶溶液；

C、用NaOH溶液调节脱细胞基质预凝胶溶液至中性(ph＝7.4)，低温下加入1/9脱细胞基质体积的10×PBS(PBS一般使用浓度与生理盐水渗透压相近,10×一般是指原PBS盐浓度的十倍)，37℃下静置培养数分钟后生成凝胶。

2.根据权利要求1所述的脱细胞基质凝胶的制备方法，其特征在于，所述水溶液包括并不限于蒸馏水、Triton-X100或脱氧胆酸钠水溶液中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的脱细胞基质凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取新鲜猪周围组织，剪去表面的脂肪组织和部分外膜，置蒸馏水中震荡、漂洗一定时间后，通过2次循环萃取脱去组织中的细胞并洗去可能造成免疫反应的DNA等物质，获得脱细胞基质；

(2)将脱细胞基质进行冷冻干燥，再用粉碎机把脱细胞基质磨成粉末，获得脱细胞基质粉末；

(3)把适量的胃蛋白酶、脱细胞基质粉末加入0.01mol/LHcl溶液中，在室温(25℃)下保持恒定搅拌6h-48h，超速离心除去未消化的大颗粒物；取上清液低温储存待用，获得脱细胞基质预凝胶溶液；

(4)将低温储存的脱细胞基质预凝胶溶液取出后加入适量的0.1mol/L氢氧化钠调节脱细胞基质预凝胶溶液至中性(ph＝7.4)并加入1/9脱细胞基质预凝胶溶液体积的10×PBS，并用pH值为7.4的PBS调整至溶液所需的体积和浓度，再放置于37℃下静置数分钟即可形成凝胶。

4.根据权利要求3所述的脱细胞基质凝胶的制备方法，其特征在于，所述2次循环萃取具体过程为：萃取时将组织放入3％的Triton-X100水溶液中振荡12h，然后在蒸馏水中漂洗3次，再放入4％的脱氧胆酸钠水溶液中室温下震荡24h，最后在蒸馏水中漂洗3次，如此一个循环为萃取1次，共进行两次循环萃取。

5.根据权利要求3所述的脱细胞基质凝胶的制备方法，其特征在于，所述脱细胞基质粉末直径约为200μm。

6.根据权利要求3所述的脱细胞基质凝胶的制备方法，其特征在于，所述低温储存为-40℃—6℃。

7.根据权利要求1或3所述的脱细胞基质凝胶的制备方法，其特征在于，所述的脱细胞基质凝胶可以自发的形成互穿纳米纤维网络结构。

8.一种脱细胞基质凝胶，其特征在于，包括如下组分：脱细胞基质、交联剂、消化液。

9.根据权利要求8所述的脱细胞基质凝胶，其特征在于，包括如下质量百分比的组分：脱细胞基质含量0.01～10％、交联剂0.1％～20％、消化液余量，所述消化液为含有胃蛋白酶的盐酸溶液。

10.根据权利要求8所述的脱细胞基质凝胶，其特征在于，其具有微观纳米纤维网络结构。