CN110652611A - 京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组织修复技术领域，具体而言，涉及京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法；该制备方法包括混合纤维环脱细胞胶和京尼平，并进行孵育；本发明的方法制备的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶具有较佳的机械强度，满足治疗椎间盘退变(IVDD)的需求。

Description

京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织修复技术领域，具体而言，涉及京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法。
背景技术
椎间盘退变(IVDD)是导致腰痛的主要原因；相关技术用于治疗椎间盘退变(IVDD)的材料存在机械强度低的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法，其制备的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶具有较佳的机械强度，满足治疗椎间盘退变(IVDD)的需求。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，包括：混合纤维环脱细胞胶和京尼平，并进行孵育。
在可选的实施方式中，孵育的温度为35-40℃。
在可选的实施方式中，混合纤维环脱细胞胶和京尼平后，京尼平的终浓度为0.01％(w/v)-0.04％(w/v)。
在可选的实施方式中，纤维环脱细胞胶的制备方法包括：用消化溶液消化脱细胞纤维环。
在可选的实施方式中，消化溶液包括胃蛋白酶盐酸溶液和乙酸溶液中的至少一种。
在可选的实施方式中，用消化溶液消化脱细胞纤维环之前还包括：将脱细胞纤维环和乙醇分别盛装于不同的容器，并放入培养箱中对脱细胞纤维环灭菌后；再将脱细胞纤维环转移至无菌操作台，在紫外照射下，挥发乙醇。
在可选的实施方式中，脱细胞纤维环的制备方法包括：
混合细胞工作液和纤维环，然后反复冻融；
震荡、离心后弃上清液；
添加去污剂，混合后离心；
弃上清液，添加核酸内切酶，混合后离心；
弃上清液，加水洗涤后，干燥。
在可选的实施方式中，每次冻融包括用液氮冷冻8-12min，在水浴锅解冻25-35min。
在可选的实施方式中，细胞工作液包括：Tris-HCl、Triton X-100、EDTA和抑肽酶中的至少一种；
去污剂包括：十二烷基磺酸钠和胰蛋白酶溶液中的至少一种。
第二方面，本发明实施例提供一种京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶，其是由前述实施方式任一项的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法制备的。
本发明实施例的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法的有益效果包括：纤维环脱细胞胶和京尼平混合孵育后，能够形成京尼平交联的纤维环脱细胞凝胶结构，该结构中的孔隙较少，具有致密的结构，且与京尼平交联后还能提高凝胶组织的储存模量；由此可见，本发明提供的制备方法能够改善制得的尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的机械强度，能够满足治疗椎间盘退变(IVDD)的需求。
本发明实施例的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的有益效果包括：本发明提供的尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶具有较佳的机械强度，能够满足治疗椎间盘退变(IVDD)的需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为发明实施例中京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法的流程图；
图2为对实施例2的脱细胞纤维环(DAF)和新鲜的纤维环组织(FAF)进行HE染色和DAPI染色的结果；
图3为实施例2-1的纤维环脱细胞胶(DAF-G)和京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)进行电镜观察结果；
图4为实施例2的脱细胞纤维环和新鲜的纤维环组织的DNA和GAG含量图；
图5为各种不同京尼平含量的纤维环脱细胞水凝胶的储存模量结果图；
图6为实施例2-1、2-2、2-3的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)以及京尼平的终含量为0％的纤维环脱细胞基质水凝胶进行细胞活力检测的结果；
图7为实施例2-1、2-2、2-3的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)以及京尼平的终含量为0％的纤维环脱细胞基质水凝胶的LDH细胞毒性测试的结果；
图8为将细胞接种于ColI以及实施例2-1提供的纤维环脱细胞胶(DAF-G)和京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)的结果图；
图9ColI以及实施例2-1提供的纤维环脱细胞胶(DAF-G)和京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向纤维环细胞方向分化的检测结果图；
图10为实施例2-1提供的纤维环脱细胞胶(DAF-G)和京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)用于进行大鼠纤维环缺损模型体内修复能力检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下对本发明的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法作进一步的详细描述。
图1为发明实施例中京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法的流程图；请参照图1。
本发明的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法包括：混合纤维环脱细胞胶和京尼平，并进行孵化；这样一来，可以形成京尼平交联的纤维环脱细胞凝胶结构，该结构中的孔隙较少，具有致密的结构，且与京尼平交联后还能提高凝胶组织的储存模量；由此可见，本发明提供的制备方法能够改善制得的尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的机械强度，能够满足治疗椎间盘退变(IVDD)的需求。
本发明的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法还包括：
调节纤维环脱细胞水凝胶的pH值，使得纤维环脱细胞水凝胶的pH值为7.0-7.4；调节纤维环脱细胞水凝胶的方法例如可以是：取一定量的纤维环脱细胞水凝胶至于离心管中，利用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH，例如：再向离心管中加入1/100纤维环脱细胞水凝胶体积的1M的氢氧化钠溶液震荡混匀，再用0.1M的氢氧化钠溶液和0.1M的盐酸溶液交替滴加于离心管中并震荡混匀，直到管内溶液的pH值达到7.0-7.4。
需要说明的是，在调节纤维环脱细胞水凝胶之前还可以先取少量(例如：300ul)用于制备纤维环脱细胞水凝胶的脱细胞基质预成胶，并调整预成胶的pH，记录调整pH时，使用的酸碱比例，以便于后续调整纤维环脱细胞水凝胶的pH值时快速开展工作，并减少浪费。
在调整pH后，添加10X磷酸盐缓冲溶液于调整过pH的纤维环脱细胞水凝胶中，混匀后，在37℃左右下孵育构建纤维环脱细胞胶(DAF-G)。
在制得了纤维环脱细胞胶(DAF-G)后，先添加10X磷酸盐缓冲溶液，在加入京尼平，使得京尼平的终浓度为0.01％(w/v)-0.04％(w/v)，混匀后，在37℃左右条件下孵育，即可构建京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)。
在较优的实施例中，京尼平的终浓度为0.02％(w/v)。
上述磷酸盐缓冲溶液的用量可以是纤维环脱细胞水凝胶体积的九分之一左右；上述在37℃左右条件下孵育可以是在35-40℃条件下孵育。
需要说明的是，按照上述方法成胶时使用的离心管的体积可以是2ml等，在此不做具体限定。
本发明提供的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法还包括制备脱细胞纤维环，脱细胞纤维环的制备方法包括：混合细胞工作液和纤维环，然后反复冻融；震荡、离心后弃上清液；添加去污剂，混合后离心；弃上清液，添加核酸内切酶，混合后离心；弃上清液，加水洗涤后，干燥。
上述脱细胞纤维环的制备方法具体包括：将牛尾椎间盘的髓核和纤维环分离，弃髓核，将分离出的纤维环切片、剪碎，装入离心管，且每个离心管内的纤维环的体积不超过离心管容积的一半；向上述离心管中添加细胞工作液，且使得细胞工作液能够刚好盖过离心管内的纤维环，摇匀，使纤维环与细胞工作液充分接触，在用液氮和37℃左右的水浴锅进行反复的冻融，每次冷冻的时间为8-12min，解冻的时间为25-35min。
进一步地，上述细胞工作液包括：Tris-HCl、Triton X-100、EDTA和抑肽酶中的至少一种。
再进一步地，细胞工作液包括50mM Tris-HCl、0.15％-3％Triton X-100、0.1-0.2％EDTA和10kIU/ml抑肽酶中的至少一种。
上述反复冻融的次数可以在5次左右。
在反复冻融后可以用细胞工作液补足离心管剩余的空间，然后在温度为4-18℃的摇床震荡72h左右，例如：70-75h。
脱细胞纤维环的制备方法具体还包括：在上述震荡后，离心，弃上清液，用去污剂补足离心管内的空间，摇匀，在温度为18℃左右放置24小时左右，例如：在15-20℃，放置20-28h。
然后，再次离心，弃上清液，在离心管中添加核酸内切酶，摇匀后，在温度为37℃左右放置24-48h。
然后，再次离心，弃上清液，向离心管中添加蒸馏水，补满离心管，摇匀后，再离心弃上清液，并重复上述步骤，以完成洗涤过程。用蒸馏水洗涤的次数可以是2次、3次、4次等，在此不作具体限定。
将洗涤后的脱细胞材料放入培养皿中，-20℃过夜后抽真空冷冻干燥，即可得到脱细胞纤维环(DAF-P)。
需要说明的是，制得的脱细胞纤维环可以用研磨棒研磨或者研磨机研磨成颗粒待用。
上述离心的转速可以是1000-1500r/min，离心的时间可以是3-7min。
上述去污剂包括十二烷基磺酸钠和胰蛋白酶溶液中的至少一种；进一步地，去污剂包括质量浓度为0.1-1％的十二烷基磺酸钠和质量浓度为0.5％的胰蛋白酶溶液。
上述核酸内切酶包括脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)和核糖核酸酶A(RNaseA)；进一步地，核酸内切酶包括0.2mg/ml DNaseI和0.2μg/mlRNaseA，或720U/ml DNaseI和720U/mlRNaseA。
需要说明的是，制备脱细胞纤维环时使用的离心管的容积可以是50ml等，在此不作具体限定。
本发明的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法中还包括制备纤维环脱细胞基质水凝胶，制备纤维环脱细胞基质水凝胶的方法包括：
将制备的脱细胞纤维环和乙醇分别盛装于不同的容器，并将盛装了脱细胞纤维环和乙醇的容器均放入培养箱中，在对脱细胞纤维环灭菌后；再将脱细胞纤维环转移至无菌操作台，在紫外照射下，待挥发乙醇。需要说明的是，在乙醇挥发期间，可以打开风机也可不开。
进一步地，上述乙醇可以是质量浓度为95％左右的乙醇，用于盛装脱细胞纤维环和乙醇的容器可以是培养皿或烧杯等，给脱细胞纤维环灭菌时培养箱的温度控制为35-39℃，乙醇灭菌时间可以在2h左右；在无菌台上挥发脱细胞纤维环中的乙醇时，可以同时开启风机，以加速除去脱细胞纤维环的乙醇。
需要说明的是，在无菌台上挥发脱细胞纤维环的乙醇时，按照上述方法在室温下保持大致6-8h即可。
制备纤维环脱细胞基质水凝胶的方法还包括：用消化溶液消化脱细胞纤维环，具体包括：用胃蛋白酶盐酸溶液和乙酸溶液中的至少一种消化灭菌后的脱细胞纤维环。
上述胃蛋白酶盐酸溶液可以是用pH为2的盐酸溶解胃蛋白酶得到的，且该溶液的浓度可以是1mg/ml。上述乙酸的质量浓度可以大致为3％。
需要说明的是，上述胃蛋白酶盐酸溶液和乙酸溶液均可以采用滤器滤菌，以确保制备纤维环脱细胞基质水凝胶时不会引入杂菌。
进一步地，将灭菌后的脱细胞纤维环加入滤菌后的消化溶液后，得到的水凝胶的质量浓度为1.5％。
制备纤维环脱细胞基质水凝胶的方法还包括：在将灭菌后的脱细胞纤维环加入滤菌后的消化溶液后，在室温下持续搅拌大致48-72h，以肉眼看到脱细胞纤维环完全溶解为宜。
需要说明的是，制备好的纤维环脱细胞基质水凝胶可以置于-20℃的条件下低温保存。
以下结合实施例对本发明的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法作进一步的详细描述。
实施例1
在pH为7.2的纤维环脱细胞胶中添加10X的磷酸盐缓冲溶液(PBS)，磷酸盐缓冲溶液的添加量是纤维环脱细胞胶体积的九分之一，混匀后，在37℃条件下，孵育得到纤维环脱细胞胶(DAF-G)。
再添加10X的磷酸盐缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液的添加量是纤维环脱细胞胶体积的九分之一；加入京尼平，并使京尼平的终浓度为0.02％(w/v)，混匀，在37℃条件下孵育即可构建京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶。
实施例2
一、脱细胞处理(牛尾椎间盘)
1、分离髓核和纤维环，弃髓核，将纤维环切片、剪碎，将剪碎的纤维环分装于50ml的离心管，且离心管中装入的材料不超过25ml。
向离心管中添加质量浓度为2％的TritonX-100，使得细胞工作液刚好盖过离心管内的材料，摇匀；采用液氮和37℃的水浴锅反复冻融5次，每次冻的时间为10min，解冻的时间为30min。
2、用1％的TritonX-100补满离心管，在18℃的摇床震荡72h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
3、在离心管中添加质量浓度为0.1％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)，并补满离心管，摇匀，在温度为18℃条件下放置24h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
4、在离心管中添加0.2mg/ml DNaseI和0.2μg/mlRNaseA，并补满离心管，摇匀，在温度为37℃条件下放置24h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
5、在离心管中添加蒸馏水补满，摇匀，在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液，并重复3次。
6、将上述步骤5中最后得到的离心沉淀物放入培养皿中，在-20℃条件下过夜后抽真空干燥。用研磨棒研磨成颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)。
二、制备水凝胶
1、将上述颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)放入一个无盖培养皿中，并与装满质量浓度为95％乙醇的无盖培养皿一并放入铁盒，密封，在温度为37℃的培养箱中灭菌2h；然后将盛装脱细胞纤维环的无盖培养皿转移至无菌操作台，在紫外照射下同时开启风机将乙醇挥发，挥发乙醇时保持室温即可，挥发的时间为6h。
2、用pH为2的盐酸溶解胃蛋白酶，制得质量浓度为1mg/ml的胃蛋白酶盐酸溶液，用滤器滤菌；用该胃蛋白酶盐酸溶液消化灭菌后的脱细胞纤维环，并在室温下持续搅拌48h，肉眼可见脱细胞纤维环全部溶解，制得质量浓度为1.5％的纤维环脱细胞水凝胶。
三、成胶
1、取一定量的纤维环脱细胞水凝胶于2ml的离心管中，利用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH，直到水凝胶的pH为7.2。
2、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，混匀，在37℃条件下孵育，构建纤维环脱细胞胶(DAF-G)。
3、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，加入京尼平，其中，实施例2-1的京尼平的终浓度为0.02％(w/v)、实施例2-2的京尼平的中浓度为0.01％(w/v)、实施例2-3的京尼平的中浓度为0.04％(w/v)，混匀，在37℃条件下孵育，构建京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)。
实施例3
一、脱细胞处理(牛尾椎间盘)
1、分离髓核和纤维环，弃髓核，将纤维环切片、剪碎，将剪碎的纤维环分装于50ml的离心管，且离心管中装入的材料不超过25ml。
向离心管中添加质量浓度为1％的Triton X-100，使得细胞工作液刚好盖过离心管内的材料，摇匀；采用液氮和37℃的水浴锅反复冻融4次，每次冻的时间为12min，解冻的时间为35min。
2、用2％的Triton X-100补满离心管，在4℃的摇床震荡75h；然后在1300r/min转速下，离心4min，弃上清液。
3、在离心管中添加质量浓度为1％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)，并补满离心管，摇匀，在温度为19℃条件下放置23h；然后在1300r/min转速下，离心4min，弃上清液。
4、在离心管中添加720U/ml DNaseI和720U/ml RNaseA，并补满离心管，摇匀，在温度为37℃条件下放置48h；然后在1300r/min转速下，离心4min，弃上清液。
5、在离心管中添加蒸馏水补满，摇匀，在1300r/min转速下，离心4min，弃上清液，并重复4次。
6、将上述步骤5中最后得到的离心沉淀物放入培养皿中，在-20℃条件下过夜后抽真空干燥。用研磨机研磨成颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)。
二、制备水凝胶
1、将上述颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)放入一个无盖培养皿中，并与装满质量浓度为96％乙醇的无盖培养皿一并放入铁盒，密封，在温度为37.3℃的培养箱中灭菌2.4h；然后将盛装脱细胞纤维环的无盖培养皿转移至无菌操作台，在紫外照射下同时开启风机将乙醇挥发，挥发乙醇时保持室温即可，挥发的时间为8h。
2、用pH为2的盐酸溶解胃蛋白酶，制得质量浓度为1mg/ml的胃蛋白酶盐酸溶液，用滤器滤菌；用该胃蛋白酶盐酸溶液消化灭菌后的脱细胞纤维环，并在室温下持续搅拌72h，肉眼可见脱细胞纤维环全部溶解，制得质量浓度为1.5％的纤维环脱细胞水凝胶。
三、成胶
1、取一定量的纤维环脱细胞水凝胶于2ml的离心管中，利用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH，直到水凝胶的pH为7.4。
2、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，混匀，在37℃条件下孵育，构建纤维环脱细胞胶(DAF-G)。
3、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，加入京尼平，使得京尼平的终浓度为0.01％(w/v)，混匀，在37℃条件下孵育，构建京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)。
实施例4
一、脱细胞处理(牛尾椎间盘)
1、分离髓核和纤维环，弃髓核，将纤维环切片、剪碎，将剪碎的纤维环分装于50ml的离心管，且离心管中装入的材料不超过25ml。
向离心管中添加质量浓度为3％的TritonX-100，使得细胞工作液刚好盖过离心管内的材料，摇匀；采用液氮和37℃的水浴锅反复冻融6次，每次冻的时间为8min，解冻的时间为25min。
2、用3％的TritonX-100补满离心管，在16℃的摇床震荡75h；然后在1100r/min转速下，离心6min，弃上清液。
3、在离心管中添加质量浓度为0.5％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)，并补满离心管，摇匀，在温度为18.5℃条件下放置24h；然后在1100r/min转速下，离心6min，弃上清液。
4、在离心管中添加0.2mg/ml DNaseI和0.2μg/mlRNaseA，并补满离心管，摇匀，在温度为37.2℃条件下放置36h；然后在1100r/min转速下，离心6min，弃上清液。
5、在离心管中添加蒸馏水补满，摇匀，在1100r/min转速下，离心6min，弃上清液，并重复2次。
6、将上述步骤5中最后得到的离心沉淀物放入培养皿中，在-20℃条件下过夜后抽真空干燥。用研磨棒研磨成颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)。
二、制备水凝胶
1、将上述颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)放入一个无盖培养皿中，并与装满质量浓度为93％乙醇的无盖培养皿一并放入铁盒，密封，在温度为37℃的培养箱中灭菌3h；然后将盛装脱细胞纤维环的无盖培养皿转移至无菌操作台，在紫外照射下同时开启风机将乙醇挥发，挥发乙醇时保持室温即可，挥发的时间为7h。
2、用滤器滤菌质量浓度为3％乙酸；用乙酸消化灭菌后的脱细胞纤维环，并在室温下持续搅拌60h，肉眼可见脱细胞纤维环全部溶解，制得质量浓度为1.5％的纤维环脱细胞水凝胶。
三、成胶
1、取一定量的纤维环脱细胞水凝胶于2ml的离心管中，利用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH，直到水凝胶的pH为7.3。
2、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，混匀，在37℃条件下孵育，构建纤维环脱细胞胶(DAF-G)。
3、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，加入京尼平，使得京尼平的终浓度为0.04％(w/v)，混匀，在37.3℃条件下孵育，构建京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)。
实施例5
一、脱细胞处理(牛尾椎间盘)
1、分离髓核和纤维环，弃髓核，将纤维环切片、剪碎，将剪碎的纤维环分装于50ml的离心管，且离心管中装入的材料不超过25ml。
向离心管中添加质量浓度为0.15％的TritonX-100，使得细胞工作液刚好盖过离心管内的材料，摇匀；采用液氮和37℃的水浴锅反复冻融5次，每次冻的时间为11min，解冻的时间为32min。
2、用0.15％的TritonX-100补满离心管，在15℃的摇床震荡70h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
3、在离心管中添加质量浓度为0.5％胰蛋白酶，并补满离心管，摇匀，在温度为17.8℃条件下放置24h；然后在1100r/min转速下，离心6min，弃上清液。
4、在离心管中添加0.2mg/ml DNaseI和0.2μg/mlRNaseA，并补满离心管，摇匀，在温度为36.9℃条件下放置40h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
5、在离心管中添加蒸馏水补满，摇匀，在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液，并重复3次。
6、将上述步骤5中最后得到的离心沉淀物放入培养皿中，在-20℃条件下过夜后抽真空干燥。用研磨棒研磨成颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)。
二、制备水凝胶
1、将上述颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)放入一个无盖培养皿中，并与装满质量浓度为95％乙醇的无盖培养皿一并放入铁盒，密封，在温度为36.8℃的培养箱中灭菌2.5h；然后将盛装脱细胞纤维环的无盖培养皿转移至无菌操作台，在紫外照射下同时开启风机将乙醇挥发，挥发乙醇时保持室温即可，挥发的时间为6.5h。
2、用滤器滤菌质量浓度为3％乙酸；用乙酸消化灭菌后的脱细胞纤维环，并在室温下持续搅拌58h，肉眼可见脱细胞纤维环全部溶解，制得质量浓度为1.5％的纤维环脱细胞水凝胶。
三、成胶
1、取一定量的纤维环脱细胞水凝胶于2ml的离心管中，利用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH，直到水凝胶的pH为7.0。
2、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，混匀，在37.2℃条件下孵育，构建纤维环脱细胞胶(DAF-G)。
3、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，加入京尼平，使得京尼平的终浓度为0.03％(w/v)，混匀，在37.1℃条件下孵育，构建京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)。
实施例6
一、脱细胞处理(牛尾椎间盘)
1、分离髓核和纤维环，弃髓核，将纤维环切片、剪碎，将剪碎的纤维环分装于50ml的离心管，且离心管中装入的材料不超过25ml。
向离心管中添加50mM Tris-HCl，使得细胞工作液刚好盖过离心管内的材料，摇匀；采用液氮和37℃的水浴锅反复冻融5次，每次冻的时间为10min，解冻的时间为30min。
2、用50mM Tris-HCl补满离心管，在18℃的摇床震荡72h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
3、在离心管中添加质量浓度为1％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)，并补满离心管，摇匀，在温度为18℃条件下放置24h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
4、在离心管中添加720U/ml DNaseI和720U/ml RNaseA，并补满离心管，摇匀，在温度为37℃条件下放置48h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
5、在离心管中添加蒸馏水补满，摇匀，在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液，并重复5次。
6、将上述步骤5中最后得到的离心沉淀物放入培养皿中，在-20℃条件下过夜后抽真空干燥。用研磨机研磨成颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)。
二、制备水凝胶
1、将上述颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)放入一个无盖培养皿中，并与装满质量浓度为95％乙醇的无盖培养皿一并放入铁盒，密封，在温度为37℃的培养箱中灭菌2h；然后将盛装脱细胞纤维环的无盖培养皿转移至无菌操作台，在紫外照射下同时开启风机将乙醇挥发，挥发乙醇时保持室温即可，挥发的时间为8h。
2、用pH为2的盐酸溶解胃蛋白酶，制得质量浓度为1mg/ml的胃蛋白酶盐酸溶液，用滤器滤菌；用该胃蛋白酶盐酸溶液消化灭菌后的脱细胞纤维环，并在室温下持续搅拌48h，肉眼可见脱细胞纤维环全部溶解，制得质量浓度为1.5％的纤维环脱细胞水凝胶。
三、成胶
1、取一定量的纤维环脱细胞水凝胶于2ml的离心管中，利用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH，直到水凝胶的pH为7.2。
2、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，混匀，在37℃条件下孵育，构建纤维环脱细胞胶(DAF-G)。
3、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，加入京尼平，使得京尼平的终浓度为0.01％(w/v)，混匀，在37℃条件下孵育，构建京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)。
实施例7
一、脱细胞处理(牛尾椎间盘)
1、分离髓核和纤维环，弃髓核，将纤维环切片、剪碎，将剪碎的纤维环分装于50ml的离心管，且离心管中装入的材料不超过25ml。
向离心管中添加质量浓度为0.1％的EDTA，使得细胞工作液刚好盖过离心管内的材料，摇匀；采用液氮和37℃的水浴锅反复冻融5次，每次冻的时间为10min，解冻的时间为30min。
2、用质量浓度为0.1％的EDTA补满离心管，在18℃的摇床震荡72h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
3、在离心管中添加质量浓度为1％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)，并补满离心管，摇匀，在温度为18℃条件下放置24h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
4、在离心管中添加720U/ml DNaseI和720U/ml RNaseA，并补满离心管，摇匀，在温度为37℃条件下放置48h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
5、在离心管中添加蒸馏水补满，摇匀，在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液，并重复5次。
6、将上述步骤5中最后得到的离心沉淀物放入培养皿中，在-20℃条件下过夜后抽真空干燥。用研磨机研磨成颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)。
二、制备水凝胶
1、将上述颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)放入一个无盖培养皿中，并与装满质量浓度为95％乙醇的无盖培养皿一并放入铁盒，密封，在温度为37℃的培养箱中灭菌2h；然后将盛装脱细胞纤维环的无盖培养皿转移至无菌操作台，在紫外照射下同时开启风机将乙醇挥发，挥发乙醇时保持室温即可，挥发的时间为8h。
2、用pH为2的盐酸溶解胃蛋白酶，制得质量浓度为1mg/ml的胃蛋白酶盐酸溶液，用滤器滤菌；用该胃蛋白酶盐酸溶液消化灭菌后的脱细胞纤维环，并在室温下持续搅拌48h，肉眼可见脱细胞纤维环全部溶解，制得质量浓度为1.5％的纤维环脱细胞水凝胶。
三、成胶
1、取一定量的纤维环脱细胞水凝胶于2ml的离心管中，利用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH，直到水凝胶的pH为7.2。
2、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，混匀，在37℃条件下孵育，构建纤维环脱细胞胶(DAF-G)。
3、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，加入京尼平，使得京尼平的终浓度为0.01％(w/v)，混匀，在37℃条件下孵育，构建京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)。
实施例8
一、脱细胞处理(牛尾椎间盘)
1、分离髓核和纤维环，弃髓核，将纤维环切片、剪碎，将剪碎的纤维环分装于50ml的离心管，且离心管中装入的材料不超过25ml。
向离心管中添加质量浓度为0.2％的EDTA，使得细胞工作液刚好盖过离心管内的材料，摇匀；采用液氮和37℃的水浴锅反复冻融5次，每次冻的时间为10min，解冻的时间为30min。
2、用质量浓度为0.2％的EDTA补满离心管，在18℃的摇床震荡72h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
3、在离心管中添加质量浓度为1％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)，并补满离心管，摇匀，在温度为18℃条件下放置24h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
4、在离心管中添加720U/ml DNaseI和720U/ml RNaseA，并补满离心管，摇匀，在温度为37℃条件下放置48h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
5、在离心管中添加蒸馏水补满，摇匀，在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液，并重复5次。
6、将上述步骤5中最后得到的离心沉淀物放入培养皿中，在-20℃条件下过夜后抽真空干燥。用研磨机研磨成颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)。
二、制备水凝胶
1、将上述颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)放入一个无盖培养皿中，并与装满质量浓度为95％乙醇的无盖培养皿一并放入铁盒，密封，在温度为37℃的培养箱中灭菌2h；然后将盛装脱细胞纤维环的无盖培养皿转移至无菌操作台，在紫外照射下同时开启风机将乙醇挥发，挥发乙醇时保持室温即可，挥发的时间为8h。
2、用pH为2的盐酸溶解胃蛋白酶，制得质量浓度为1mg/ml的胃蛋白酶盐酸溶液，用滤器滤菌；用该胃蛋白酶盐酸溶液消化灭菌后的脱细胞纤维环，并在室温下持续搅拌48h，肉眼可见脱细胞纤维环全部溶解，制得质量浓度为1.5％的纤维环脱细胞水凝胶。
三、成胶
1、取一定量的纤维环脱细胞水凝胶于2ml的离心管中，利用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH，直到水凝胶的pH为7.2。
2、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，混匀，在37℃条件下孵育，构建纤维环脱细胞胶(DAF-G)。
3、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，加入京尼平，使得京尼平的终浓度为0.01％(w/v)，混匀，在37℃条件下孵育，构建京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)。
实施例9
一、脱细胞处理(牛尾椎间盘)
1、分离髓核和纤维环，弃髓核，将纤维环切片、剪碎，将剪碎的纤维环分装于50ml的离心管，且离心管中装入的材料不超过25ml。
向离心管中添加10kIU/ml抑肽酶，使得细胞工作液刚好盖过离心管内的材料，摇匀；采用液氮和37℃的水浴锅反复冻融5次，每次冻的时间为10min，解冻的时间为30min。
2、用10kIU/ml抑肽酶补满离心管，在18℃的摇床震荡72h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
3、在离心管中添加质量浓度为1％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)，并补满离心管，摇匀，在温度为18℃条件下放置24h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
4、在离心管中添加720U/ml DNaseI和720U/ml RNaseA，并补满离心管，摇匀，在温度为37℃条件下放置48h；然后在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液。
5、在离心管中添加蒸馏水补满，摇匀，在1200r/min转速下，离心5min，弃上清液，并重复5次。
6、将上述步骤5中最后得到的离心沉淀物放入培养皿中，在-20℃条件下过夜后抽真空干燥。用研磨机研磨成颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)。
二、制备水凝胶
1、将上述颗粒状的脱细胞纤维环(DAF-P)放入一个无盖培养皿中，并与装满质量浓度为95％乙醇的无盖培养皿一并放入铁盒，密封，在温度为37℃的培养箱中灭菌2h；然后将盛装脱细胞纤维环的无盖培养皿转移至无菌操作台，在紫外照射下同时开启风机将乙醇挥发，挥发乙醇时保持室温即可，挥发的时间为8h。
2、用pH为2的盐酸溶解胃蛋白酶，制得质量浓度为1mg/ml的胃蛋白酶盐酸溶液，用滤器滤菌；用该胃蛋白酶盐酸溶液消化灭菌后的脱细胞纤维环，并在室温下持续搅拌48h，肉眼可见脱细胞纤维环全部溶解，制得质量浓度为1.5％的纤维环脱细胞水凝胶。
三、成胶
1、取一定量的纤维环脱细胞水凝胶于2ml的离心管中，利用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调节pH，直到水凝胶的pH为7.2。
2、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，混匀，在37℃条件下孵育，构建纤维环脱细胞胶(DAF-G)。
3、向离心管添加水凝胶九分之一体积的10X磷酸盐缓冲液(PBS)，加入京尼平，使得京尼平的终浓度为0.01％(w/v)，混匀，在37℃条件下孵育，构建京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)。
一、对实施例2的脱细胞纤维环(DAF)和新鲜的纤维环组织(FAF)进行HE染色和DAPI染色，得到图2。
根据图2中的A部分的HE染色可以分析出，新鲜的纤维环组件的细胞成分较多，而脱细胞纤维环的细胞成分很少，但是细胞外基质仍然相当丰富。根据图2中的B部分的DAPI染色可以看出，新鲜的纤维环组件的荧光强度较高，二脱细胞纤维环的荧光强度明显较弱。说明本发明的脱细胞方法可以充分脱去组织中的细胞成分并保留细胞外基质。
二、对的纤维环脱细胞胶(DAF-G)和京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)进行电镜观察；在此提供实施例2-1的结果图为例，见图3。
根据图3的结果可知，在电镜显示下纤维环脱细胞胶(DAF-G)具有更大的孔隙结构，而京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)的孔隙明显更小，纤维排列更加致密，进而京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)具有较强的机械性能，更能治疗椎间盘退变(IVDD)的需求。
三、对实施例2的纤维环脱细胞胶(DAF-G)和新鲜的纤维环组织(FAF)的DNA含量和GAG含量，结果见图4。
根据图4的结果可知，脱细胞后显著减少了组织的DNA含量，去除率可以达到(89.1±4.16)％，并保留(86.91±4.29)％的GAG。进而可以判断本发明的方法得到的脱细胞纤维环仍然接近天然的未处理的纤维环组织。
四、检测京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)的储存模量以及京尼平的终含量为0％的纤维环脱细胞基质水凝胶的储存模量，在此提供实施例2-1、2-2、2-3的结果图为例，见图5。
根据图5的结果可知，京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)中京尼平的含量分别为0％，0.01％，0.02％，0.04％的储存模量分别为465.5±9.4Pa，2.5±0.12MPa，3.29±0.24MPa，4.3±0.21MPa；而天然的纤维环组织的储存模量约为200kPa左右，京尼平交联后可达到甚至超过天然的纤维环组织的强度，说明京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)具有足够的机械强度，能够满足治疗椎间盘退变(IVDD)的需求。
五、对京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)以及京尼平的终含量为0％的纤维环脱细胞基质水凝胶进行细胞活力检测，对照组为细胞培养板(图中的Control)，在此提供实施例2-1、2-2、2-3的结果图为例，见图6。
根据图6的结果可知，细胞直接接种于细胞培养板上较接种于不同浓度的脱细胞基质水凝胶上具有更高的细胞活力。
六、对京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)以及京尼平的终含量为0％的纤维环脱细胞基质水凝胶进行LDH细胞毒性测试，对照组为细胞培养板(图中的Control)，在此提供实施例2-1、2-2、2-3的结果图为例，见图7。
根据图7的结果可知，京尼平浓度为0.04％时细胞释放的LDH含量较其他组显著升高，提示0.04％京尼平对细胞毒性较其他组高，并且还可以得出京尼平浓度为0.02％时对细胞毒性较低，京尼平的浓度为0.02％为较优实施例。
七、将细胞接种于ColI以及纤维环脱细胞胶(DAF-G)和京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)，在此提供实施例2-1结果图为例，见图8的死/活染色荧光图，图中白点部分原本为荧光绿色，代表活细胞。
根据图8可知，细胞接种于ColI(胶原I购自美国Corning公司)以及实施例2提供的纤维环脱细胞胶(DAF-G)和京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)均没有死亡，且第21天细胞密度增高，说明细胞可以在本发明提供的材料上增殖，本发明提供的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)具有良好的生物相容性。
八、将BMSCs接种于Col I、纤维环脱细胞胶(DAF-G)和京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)，第21天，纤维环细胞标志(Col1a1，Col5a1，FBLN1，TNMD，IBSP)的含量变化，在此提供实施例2-1结果图为例，见表8。
根据图9的结果可知，第21天，α1-I型胶原基因(Col1a1)，Col5a1，衰老关键蛋白1(FBLN1)，人腱调蛋白(TNMD)，骨唾液酸蛋白(IBSP)较Col I组明显升高。
另外，除了Col5a1，FBLN1，g-DAF-G相比于DAF-G可以增加Col1a1，TNMD，IBSP的表达水平，说明京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)相比于未交联的纤维环脱细胞基质水凝胶具有更好的诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成熟的纤维环细胞分化的能力。
九、将纤维环脱细胞胶(DAF-G)和京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶(g-DAF-G)用于进行大鼠纤维环缺损模型体内修复能力检测，方法包括：首先麻醉大鼠后，利用20G(外径约为0.91mm)的针头在大鼠尾椎第7/8纤维环穿刺，刺入深度约为1mm，避免穿破纤维环损伤髓核，并将针头旋转360度，保持30s，而后将ColI，DAF-G，g-DAF-G分别注射进纤维环缺损的部位；利用MRI的T2相观察在第四周(4W)和第八周(8W)时，大鼠的髓核含水量；在此提供实施例2-1结果图为例，见图10。
根据图10的结果可知，第四周和第八周时，DAF-G，g-DAF-G组大鼠髓核含水量均显著高于Col I，且g-DAF-G含水量较DAF-G更高。说明纤维环脱细胞胶具有体内修复纤维环缺损的能力，京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的体内修复能力更强，即京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶具有良好的纤维环体内修复能力，能够满足治疗椎间盘退变(IVDD)的需求。
综上所述，本发明的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法，通过在纤维环脱细胞交联京尼平，得到孔隙更小、致密结构，且与京尼平交联后还能提高凝胶组织的储存模量；由此可见，本发明提供的制备方法能够改善制得的尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的机械强度，能够满足治疗椎间盘退变(IVDD)的需求。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，包括：混合纤维环脱细胞胶和京尼平，并进行孵育。
2.根据权利要求1所述的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为35-40℃。
3.根据权利要求1所述的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，混合所述纤维环脱细胞胶和所述京尼平后，所述京尼平的终浓度为0.01％(w/v)-0.04％(w/v)。
4.根据权利要求1所述的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，所述纤维环脱细胞胶的制备方法包括：用消化溶液消化脱细胞纤维环。
5.根据权利要求4所述的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，所述消化溶液包括胃蛋白酶盐酸溶液和乙酸溶液中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，用所述消化溶液消化所述脱细胞纤维环之前还包括：将所述脱细胞纤维环和乙醇分别盛装于不同的容器，并放入培养箱中对所述脱细胞纤维环灭菌后；再将所述脱细胞纤维环转移至无菌操作台，在紫外照射下，挥发乙醇。
7.根据权利要求4所述的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，所述脱细胞纤维环的制备方法包括：
混合细胞工作液和纤维环，然后反复冻融；
震荡、离心后弃上清液；
添加去污剂，混合后离心；
弃上清液，添加核酸内切酶，混合后离心；
弃上清液，加水洗涤后，干燥。
8.根据权利要求7所述的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，每次冻融包括用液氮冷冻8-12min，在水浴锅解冻25-35min。
9.根据权利要求7所述的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法，其特征在于，所述细胞工作液包括：Tris-HCl、Triton X-100、EDTA和抑肽酶中的至少一种；
所述去污剂包括：十二烷基磺酸钠和胰蛋白酶溶液中的至少一种。
10.一种京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶，其特征在于，其是由权利要求1-9任一项所述的京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶的制备方法制备的。
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