CN103007352A - 脱细胞纤维环基质的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脱细胞纤维环基质的制备方法，属于动物细胞或组织领域。本发明是取健康成年猪的脊柱纤维环，经无菌生理盐水充分漂洗；放入浓度为10mM，含0.05～0.5%EDTA、5～50KIU/ml抑肽酶的Tris缓冲液中4℃振荡；再放入含1～5%TritonX-100的上述Tris缓冲液，室温振荡；放入含0.05～0.5mg/ml脱氧核糖核酸酶、5～50ug/ml核糖核酸酶A的Tris缓冲液中，振荡；最后，无菌生理盐水振荡清洗，放在无菌PBS缓冲液中4℃保存。本发明的制备过程简单，细胞去除彻底，结构保留完整，基质含量及力学性能与天然纤维环相近，是一种良好的组织工程纤维环支架材料。

Description

脱细胞纤维环基质的制备方法

技术领域

本发明涉及动物细胞或组织领域，具体是一种脱细胞纤维环基质的制备方法。

背景技术

椎间盘退变是一类常见病，严重影响人们的生活，也是骨科治疗难题之一。组织工程技术的出现为椎间盘疾病的治疗提供了新的思路和方法，有望为椎间盘修复或置换提供永久替代产品，其中，纤维环的再生修复是椎间盘组织工程首先要解决的问题，只有纤维环得到修复才能让髓核组织保持在椎间隙，进而对退变髓核实施下一步治疗。

近年来，用于构建组织工程纤维环的支架材料研究较多。如取向性电纺丝纳米支架，虽然结构规则、孔隙均匀，但成分与天然纤维环相差很大，生物相容性差；取向性藻酸盐/壳聚糖复合支架，其力学性能与天然纤维环相差甚远；聚已酸内酯苹果酸三醇/脱钙骨基质明胶双相纤维环支架，双相支架的内外层结合不牢、容易脱落，且生物相容性差；国内潘勇等用脱矿脱细胞骨基质环作为纤维环支架，细胞相容性好，但其可塑性差，结构与天然纤维环的斜交叠层复杂结构相差甚远。综上，纤维环细胞外基质(ECM)生化成分与结构复杂，呈斜交叠层排列，而目前国内外无论人工合成还是天然仿生材料，很难真正模仿椎间盘复杂的天然结构、组成成分及生物力学特性。

近年，脱细胞基质引起了国内外学者的广泛关注，脱细胞基质去除了细胞和可溶性蛋白等引起免疫反应的物质，保留了组织的天然成分和复杂结构，具有与体内组织相近的力学性能，因此，脱细胞基质是一种理想的支架载体，已得到广泛应用，并且异体脱细胞真皮基质、猪脱细胞心瓣膜、猪脱细胞膀胱已被批准应用于临床。目前尚无用脱细胞纤维环基质作为纤维环支架的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中，组织工程纤维环支架在材料成分、结构、力学性能的不足，而提供一种与天然纤维环十分接近的脱细胞纤维环基质的制备方法。

一种脱细胞纤维环基质的制备方法，是按以下步骤进行的：

（1）取健康成年猪的脊柱纤维环，无菌生理盐水充分漂洗； 

（2）浓度为10mM含0.05～0.5% EDTA、5～50 KIU/ml 抑肽酶的Tris缓冲液中4℃振荡48 h；

（3）浓度为10mM含0.05～0.5% EDTA、5～50 KIU/ml 抑肽酶的Tris缓冲液中，加入1～5% 的TritonX-100后，室温振荡12～96 h；

（4）放入含0.05～0.5 mg/ml脱氧核糖核酸酶、5～50 ug/ml核糖核酸酶A的Tris缓冲液，37℃振荡12～36 h；

（5）无菌生理盐水振荡清洗24h，放在无菌PBS缓冲液中4℃保存。

所述的健康成年猪为6～7月龄，雌雄不限。

所述的脊柱纤维环是外径为5～20 mm，厚度为2～7 mm的尾椎纤维环。

所述的振荡频率均为 80～250 r/min。

本发明的主要优点如下： 

①本发明所采用的纤维环材料属于天然生物材料，具有良好的生物相容性和可降解性，且材料来源广泛，可批量生产。

②通过脱细胞系列处理去处抗原成分，避免发生免疫排斥反应、传播疾病。

③本发明的组成成分、结构、力学性能都与天然纤维环十分接近，为种子细胞提供一个与体内纤维环十分接近的生长环境。

附图说明

图1是正常纤维环HE染色图；

图2是脱细胞纤维环基质HE染色图；

图3是正常纤维环Hochest33258染色图；

图4是脱细胞纤维环基质Hochest33258染色图；

图5是正常纤维环甲苯胺蓝染色图；

图6是脱细胞纤维环基质甲苯胺蓝染色图；

图7是正常纤维环Ⅰ型胶原免疫荧光图；

图8是脱细胞纤维环基质Ⅰ型胶原免疫荧光图；

图9是正常纤维环扫描电镜图；

图10是脱细胞纤维环基质扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。

1、脱细胞纤维环基质的制备方法

（1）取材：取6～7月龄(雌雄不限)健康成年猪的尾椎间盘，无菌生理盐水冲洗干净，去除中央髓核及外周肌肉组织，选取直径及厚度相近的尾椎纤维环，外径9～11 mm，平均10 mm；厚度4.5～5.5 mm，平均5 mm，用无菌生理盐水充分漂洗；

（2）脱细胞处理：将上述处理后的纤维环组织放入10mM含0.1% EDTA、10 KIU/ml 抑肽酶的Tris缓冲液中，4℃ 150r/min振荡48 h进行低渗处理，去离子水冲洗干净；用含3% TritonX-100的Tris缓冲液（含0.1% EDTA、10 KIU/ml 抑肽酶）室温150r/min振荡72 h，每24 h换液一次，去离子水冲洗干净；用含0.2 mg/ml脱氧核糖核酸酶 (DNaseⅠ)、20 ug/ml核糖核酸酶A (RNase A)的Tris缓冲液37℃ 150r/min振荡24 h，去离子水冲洗干净；

（3）清洗：用无菌生理盐水 150r/min振荡24h进行清洗，清洗完后将脱细胞纤维环基质放在PH 7.30 无菌PBS缓冲液中保存。

经上述处理的脊柱纤维环不含纤维环外周肌肉组织及纤维环/髓核交界区。

本发明采用性质比较温和的去垢剂Triton X－100对天然纤维环进行脱细胞处理,去除了天然纤维环的细胞成分，但没有改变纤维环组织的组成、结构及力学性能。

2、正常纤维环及脱细胞纤维环基质的组织学及电镜观察

HE染色放大100倍可见大量细胞均匀的分布在正常纤维环基质中，脱细胞纤维环基质中无细胞及细胞碎屑残留（见图1、2）。Hochest33258染色放大100倍可见正常纤维环中细胞呈点状荧光，脱细胞纤维环基质呈阴性（见图3、4）。甲苯胺蓝染色放大100倍正常纤维环及脱细胞纤维环基质均呈蓝色（见图5、6）。Ⅰ型胶原免疫荧光放大100倍正常纤维环及脱细胞纤维环基质均为阳性，呈红色荧光（见图7、8）。扫面电镜可见正常纤维环放大200倍及脱细胞纤维环基质放大80倍均排列有序，微观结构无差别（见图9、10）。

3、正常纤维环及脱细胞纤维环基质的生化成分分析

胶原及氨基葡聚糖(GAG)是纤维环的主要组成成分，经测定脱细胞纤维环基质的胶原含量为（150.83±2.43）ug/mg，与正常纤维环的胶原含量（143.99±4.86）ug/mg相比无统计学意义；脱细胞纤维环基质的GAG含量分别为（41.07 ±2.54）ug/mg，稍低于正常纤维环的GAG含量（54.01± 2.84）%。

4、正常纤维环脱及细胞纤维环基质的生物力学测定

经测定脱细胞纤维环基质的极限载荷为（24.52±3.83）N，极限应力为（6.02±0.83）MPa，极限应变为（0.41±0.05）%，韧度为（15.58±1.62）N/mm，弹性模量为（28.89±5.50）MPa，断裂功耗为（30.85±5.15）×10^-3J；与对照组的极限载荷（22.98±2.10）N，极限应力（5.86±1.13）MPa，极限应变（0.34±0.05）%，韧度（17.00±2.89）N/mm，弹性模量（30.71±5.47）MPa，断裂功耗（29.62±5.26）×10^-3J相比均无统计学差异。

Claims (4)

1.一种脱细胞纤维环基质的制备方法，其是按以下步骤进行的：

（1）取健康成年猪的脊柱纤维环，无菌生理盐水充分漂洗； 

（2）在浓度为10mM，含0.05～0.5% EDTA、5～50 KIU/ml 抑肽酶的Tris缓冲液中4℃振荡48 h；

（3）在浓度为10mM，含0.05～0.5% EDTA、5～50 KIU/ml 抑肽酶的Tris缓冲液中，加入1～5% 的TritonX-100后，室温振荡12～96 h；

（4）放入含0.05～0.5 mg/ml 脱氧核糖核酸酶、5～50 ug/ml核糖核酸酶A的Tris缓冲液，37℃振荡12～36 h；

（5）无菌生理盐水振荡清洗24 h，放在无菌PBS缓冲液中4℃保存。

2.按照权利要求1所述的脱细胞纤维环基质的制备方法，其特征在于：所述的健康成年猪为6～7月龄，雌雄不限。

3.按照权利要求1所述脱细胞纤维环基质的制备方法，其特征在于：所述的脊柱纤维环是外径为5～20 mm，厚度为2～7 mm的尾椎纤维环。

4.按照权利要求1所述的脱细胞纤维环基质的制备方法，其特征在于：所述振荡频率均为80～250 r/min。

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