CN101954123A - 一种人工椎间盘复合体组织及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组织工程领域，公开了一种人工椎间盘复合体组织及其制备方法。本发明所述人工椎间盘复合体组织包括髓核和纤维环，所述纤维环由脱钙脱细胞的骨基质环构成，所述髓核由髓核细胞及纤维环细胞在II型胶原、透明质酸和硫酸软骨素构成的髓核纤维环复合体支架上生长形成。其外形及大小均与天然椎间盘类似，外层纤维环组织致密，内层髓核呈半透明凝胶状。生化成分的检测结果表明，本发明所述人工椎间盘复合体组织DNA、蛋白多糖和羟脯氨酸的含量随时间显著增加，在12周时与天然椎间盘的含量相似。胶原的基因表达分析结果也表明组织工程复合椎间盘与天然椎间盘相似，显示本发明所述人工椎间盘复合体组织具有良好的生物学功能，具有广泛的应用前景。

Description

一种人工椎间盘复合体组织及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种人工椎间盘复合体组织及其制备方法。
背景技术
组织工程(Tissue Engineering)是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。组织工程研究主要包括四个方面：种子细胞、生物材料、构建组织和器官的方法和技术以及组织工程的临床应用。
组织工程的基本原理和方法是：将体外培养扩增的正常组织细胞作为种子细胞，吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物支架材料上形成复合物，将细胞-支架材料复合物植入机体组织、器官的病损部位，种子细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。采用组织工程学技术修复缺损的组织器官，具有移植材料来源广泛、移植物可以在体外成行、避免或降低了免疫排斥反应和感染性疾病的播散等优点。目前采用组织工程技术已成功构建皮肤、膀胱、肌腱、骨、软骨等组织。
椎间盘退变性疾病是现代社会中一种常见病和多发病，其中以椎间盘突出症最为常见，是引起腰腿痛的常见病因，严重影响患者生活质量。组织工程修复椎间盘退行性变是近年来脊柱外科领域基础研究的热点，研究开发符合椎间盘结构与功能的移植物，对退变椎间盘进行功能重建，已成为治疗椎间盘退变性疾病比较理想的解决方案。
椎间盘包括软骨板以及位于软骨板之间的髓核和纤维环，髓核与纤维环是两个发育上和形态上分离的区域，在细胞和基质构成和作用方面各不相同。而目前组织工程椎间盘的研究主要采用单一成分的组织工程髓核或组织工程纤维环移植物，将两者复合构建组织工程椎间盘复合物是一个难点和关键点，主要体现在以下几个方面：1、如何选择符合髓核和纤维环生物学特性的生物材料，目前用于组织工程椎间盘研究的支架材料种类很多，但迄今仍没有具有优异生物学的类人体组织理想的替代和修复材料；2、如何在体外构建组织工程椎间盘复合组织，其中如何将组织工程髓核支架材料和纤维环支架材料复合并使复合组织具有更好的生物性能；3、种子细胞能否粘附纤维环支架内部并增殖和行使功能。
发明内容
本发明目的针对现有技术中仅有单一成分的组织工程髓核或组织工程纤维环移植物的缺陷，提供一种人工椎间盘复合体组织，其将髓核支架材料和纤维环支架材料复合在一起，且具有更好的生物学性能。
本发明所述人工椎间盘复合体组织，包括髓核和纤维环，其外层为纤维环细胞在脱矿脱细胞骨基质环生长构成的纤维环，内层为髓核细胞以及II型胶原、透明质、硫酸软骨素构成的髓核，是由髓核细胞及纤维环细胞在II型胶原、透明质、硫酸软骨素以及由脱钙脱细胞的骨基质环构成的纤维环复合体支架上生长形成。
作为优选，所述骨基质环为兔股骨髁部制备的骨基质环。
更优选地，所述髓核细胞及纤维环细胞来源于3周龄新西兰大白兔。
本发明还提供一种人工椎间盘复合体组织的构建方法，包含以下步骤：
步骤1：将除骨膜、除骨髓的兔股骨髁部，进行脱细胞脱钙处理后修整成形制备纤维环支架；
步骤2：将II型胶原和透明质酸按体积比9∶1混合注入步骤1制备的纤维环支架内，冷冻干燥后浸泡于pH为5.5含50-55mmol/l MES的40-45％乙醇溶液中30分钟后，浸泡于含50-55mmol/l MES、24-27mmol/l EDC、3-5mmol/l琥珀酰胺和2-3wt％硫酸软骨素的40-45％乙醇溶液中交联形成髓核纤维环复合体支架；
步骤3：使髓核细胞及纤维环细胞于所述髓核纤维环复合体支架内，加培养液培养。
作为优选，步骤1所述脱细胞采用Courtman的中性去污剂-酶四步脱细胞方法进行。
作为优选，步骤1所述脱钙为将兔股骨髁部在4℃0.6-0.8mol/LHCl中处理48-72小时。
作为优选，，步骤2所述交联为20-25℃下交联24-36h。
作为优选，步骤3所述培养液为pH7.4-7.6含10-15％FBS的DMEM/F12培养液。
作为优选，步骤3所述髓核细胞及所述纤维环细胞来源于3周龄新西兰大白兔，其浓度为1×105-2×105个/ml。
更优选地，步骤3所述髓核细胞及纤维环细胞制备成混悬液，髓核细胞及纤维环细胞计数为1×105-2×105个/ml，与50-55mmol/L CaCl2、20-22U/ml凝血酶按体积比1∶2∶7比例混合制备的细胞悬液于所述髓核纤维环复合体支架内加培养液培养。
本发明所述人工椎间盘复合体组织外形及大小均与天然椎间盘类似，外层由纤维环细胞在脱矿脱细胞骨基质环生长构成的组织工程纤维环区域组织致密，内层由髓核细胞以及CII/HyA-CS构成的组织工程髓核区域呈半透明凝胶状。裸鼠皮下植入4周后，细胞-支架复合体仍保持原有外形和大小，并有大量细胞外基质形成，但纤维环和髓核交界区仍较清晰。到12周，随着组织工程椎间盘复合体有丰富的细胞外基质形成，纤维环和髓核的交界区已难以辨认。
本发明所述人工椎间盘复合体组织学观察结果显示，与天然椎间盘相比，HE及番红O染色结果提示进展性的组织形成。复合体支架的纤维环区域为不均一的孔隙结构，而髓核区域为相对较小、更均一的孔隙结构。裸鼠皮下植入4周后，组织工程椎间盘复合体的孔隙逐渐被新产生的细胞外基质填充；到12周，更多的细胞外基质形成使得复合体组织更加致密，组织工程椎间盘的纤维环和髓核区域更加地整合在一起，参见图3。
组织工程椎间盘复合体的细胞外基质形成情况通过检测羟脯氨酸和GAG含量来反映。随着植入时间的增加，复合椎间盘的细胞外基质分泌量也显著增加，在12周时，与天然椎间盘的含量相似。DNA含量检测可以反映椎间盘的细胞量，结果表明，随植入时间的增加，本发明所述人工椎间盘复合体组织的DNA含量也显著增加，到12周时接近正常椎间盘组织水平。
本发明所述人工椎间盘复合体组织的大体形态和组织学观察结果与天然椎间盘组织相似，形态学观察结果纤维环和髓核区域得到良好的整合，外层纤维环组织致密，内层髓核呈半透明凝胶状。。生化成分的检测结果表明，DNA、蛋白多糖和羟脯氨酸的含量随时间显著增加，在12周时与天然椎间盘的含量相似。胶原的基因表达分析结果也表明组织工程复合椎间盘与天然椎间盘相似，可开发为符合椎间盘结构与功能的移植物，对退变椎间盘进行功能重建以及治疗椎间盘退行性变具有重要的意义。
附图说明：
图1示本发明所述人工椎间盘复合体组织构建流程图；
图2示本发明所述人工椎间盘复合体组织大体形态学观察结果；NP：髓核，AF：纤维环；
图3示本发明所述人工椎间盘复合体组织组织学观察结果；NP：髓核，AF：纤维环；
图4示本发明所述人工椎间盘复合体组织羟脯氨酸含量检测结果；NP：髓核，AF：纤维环；
图5示本发明所述人工椎间盘复合体组织GAG含量检测结果；NP：髓核，AF：纤维环；
图6示本发明所述人工椎间盘复合体组织DNA含量检测结果，NP：髓核，AF：纤维环。
具体实施方式：
本发明公开了一种人工椎间盘复合体组织及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
实施例1：纤维环脱钙脱细胞骨基质环的制备
取材：取新西兰大耳白兔双侧股骨髁部，剔除骨膜，并用PBS清洗除去骨髓，将骨修整成椭圆形的骨块。
脱细胞方法：根据Courtman的中性去污剂-酶四步脱细胞方法进行制备(参见Courtman DW，Pereira C，Kashef V，et al.Development of apericardial acellular matrix biomaterial：Biochemical and mechanical effectsof cell extraction.J Biomed Materials Res，1994，28：655-666)。将骨块置入酶抑制剂工作液(购自美国sigma公司)，4℃恒温震荡3d；骨块置入去污剂酶抑制剂工作液(购自美国sigma公司)中，4℃恒温震荡3d；去离子水连续冲洗12h后，加入DNAse、RNAse消化液37℃恒温下消化12h；重复将骨块置入去污剂酶抑制剂工作液(购自美国sigma公司)中，4℃恒温震荡3d。
骨块脱钙方法：取出材料骨，用去离子水冲洗，然后在4℃0.6mol/LHCl中处理48小时；产物比照纤维环形状塑形，然后经去离子水充分冲洗后。
实施例2：髓核细胞支架的构建
将猪II型胶原蛋白CII溶于0.01mol/l HCl(pH 2.3)，4℃下搅拌，制成1.25％(w/v)的CII溶液，调整CII溶液的pH值至1-2。继续4℃搅拌的条件下，按9∶1(v/v)比例逐滴加入以超纯水溶解的4℃、1.25％HyA(透明质酸)溶液，速度控制在0.5ml/min。混合后，4℃下300r/min搅拌4h，3000r/min、4℃离心15min去除气泡，将混合溶液倾入一次性培养皿中，轻轻震摇，使液面平整，立即置于-70℃冰箱冷冻。
实施例3：髓核纤维环复合体支架的构建
将CII/HyA混合溶液注入实施例1制备的中空的纤维环支架内，冷冻干燥。干燥后的复合体按每50mg干重浸泡于20ml含50mmol/l 2-吗啉乙烷磺酸(MES pH＝5.5)的40％乙醇溶液中30分钟(室温)，然后浸泡在20ml含50mmol/l MES、24mmol/l EDC、5mmol/l琥珀酰胺(NHS)和2wt％6-CS硫酸软骨素的40％乙醇溶液中，室温(20-25℃)下交联24h。将此复合体支架在0.1mol/l Na2HPO4中清洗2次，共1h；1mol/l NaCl中清洗2次，共2h；2mol/l NaCl中清洗24h(期间更换6次)，用超纯水清洗十次，冷冻干燥机中两次冻干得到复合体支架。经钴60照射消毒灭菌后-20℃保存备用。
实施例4：本发明椎间盘复合组织的构建
髓核纤维环复合体支架用细胞培养基DMEM(含10％胎牛血清、青霉素10万U/L、链霉素10万U/L，20mmol/L HEPES，pH7.2)在培养箱内浸泡1周，换液2次。接种时取出支架PBS液体洗涤后尽量吸出水分，浸入人纤维蛋白原溶液(2mg/ml)中30min，无菌纱布吸去多余液体，静置4h。分别将来源于3周龄新西兰大白兔的原代培养髓核细胞及纤维环细胞，以0.25％胰蛋白酶消化、离心，用DMEM/F12(pH 7.0)混悬细胞，计数制成含细胞1×105个/ml，按9∶1体积加入PBS液体配置的凝血酶(20U/ml)；按1∶2∶7比例混合50mmol/L CaCl2、凝血酶20U/ml细胞悬液。将混合物滴加至支架材料内，静置30min。然后加培养液(含15％FBS的DMEM/F12，pH 7.4)至2ml，置于37℃、5％CO2温箱中培养。
实施例5：组织工程椎间盘复合体裸鼠皮下移植
取裸鼠30只，随机分为4、8、12周组，皮下注射戊巴比妥钠麻醉，于背部切开皮肤并皮下植入复合体，缝合皮肤。术后常规清洁级饲养。
实施例6：大体形态学观察：
取实施例1-4制备的人工椎间盘复合体组织观察，结果见图：组织工程椎间盘复合体(图2A)外形及大小均与天然椎间盘类似(图2B)，外层由脱矿脱细胞骨基质环构成的组织工程纤维环区域组织致密，内层由CII/HyA-CS构成的组织工程髓核区域呈半透明凝胶状。裸鼠皮下植入4周后，细胞-支架复合体仍能保持原有外形和大小，并有大量细胞外基质形成，但纤维环和髓核交界区仍较清晰(图2C)。到12周，随着组织工程椎间盘复合体有丰富的细胞外基质形成，纤维环和髓核的交界区已难以辨认(图2D)。
实施例7：组织学观察
4％多聚甲醛固定液固定24小时，常规石蜡包埋切片，行HE及番红O染色。光镜观察。实施例1-4制备的人工椎间盘复合体组织组织学观察结果显示：与天然椎间盘相比(图3G，H)，HE及番红O染色结果提示进展性的组织形成。复合体支架的纤维环区域为不均一的孔隙结构，而髓核区域为相对较小、更均一的孔隙结构(图3A，B)。裸鼠皮下植入4周后，组织工程椎间盘复合体的孔隙逐渐被新产生的细胞外基质填充(图3C，D)。到12周，更多的细胞外基质形成使得复合体组织更加致密，组织工程椎间盘的纤维环和髓核区域更加地整合在一起，这与大体观察结果相一致(图3E，F)。
实施例8：生化指标检测
本发明所述椎间盘复合体的细胞外基质形成情况，通过检测羟脯氨酸和GAG含量来反映。羟脯氨酸含量、氨基葡聚糖(GAG)含量、DNA含量依相应参考文献方法进行检测。
取实施例1-4制备的人工椎间盘复合体组织进行生化成分检测，结果显示：随着植入时间的增加，复合椎间盘的细胞外基质分泌量也显著增加，在12周时，与天然椎间盘的含量相似，见图4和图5。
DNA含量检测可以反映组织工程椎间盘的细胞量。结果表明，随植入时间的增加，组织工程椎间盘复合体的DNA含量也显著增加，到12周时接近正常水平，见图6。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种人工椎间盘复合体组织，其外层为纤维环细胞在脱矿脱细胞骨基质环生长构成的纤维环，内层为髓核细胞以及II型胶原、透明质、硫酸软骨素构成的髓核，是由髓核细胞及纤维环细胞在II型胶原、透明质、硫酸软骨素以及由脱钙脱细胞的骨基质环构成的纤维环复合体支架上生长形成。
2.根据权利要求1所述的人工椎间盘复合体组织，其特征在于，所述骨基质环为兔股骨髁部制备的骨基质环。
3.根据权利要求1所述的人工椎间盘复合体组织，其特征在于，所述髓核细胞及纤维环细胞来源于3周龄新西兰大白兔。
4.一种人工椎间盘复合体组织的构建方法，包含以下步骤：
步骤1：将除骨膜、除骨髓的兔股骨髁部，进行脱细胞脱钙处理后修整成形制备纤维环支架；
步骤2：将II型胶原和透明质酸按体积比9∶1混合注入步骤1制备的纤维环支架内，冷冻干燥后浸泡于pH为5.5含50-55mmol/l MES的40-45％乙醇溶液中30分钟后，浸泡于含50-55mmol/l MES、24-27mmol/l EDC、3-5mmol/l琥珀酰胺和2-3wt％硫酸软骨素的40-45％乙醇溶液中交联形成髓核纤维环复合体支架；
步骤3：加培养液使髓核细胞及纤维环细胞于所述髓核纤维环复合体支架内生长至12周。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述脱细胞采用Courtman的中性去污剂-酶四步脱细胞方法进行。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述脱钙为将兔股骨髁部在4℃0.6-0.8mol/L HCl中处理48-72小时。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述交联为20-25℃下交联24-36h。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述培养液为pH7.4-7.6含10-15％FBS的DMEM/F12培养液。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述髓核细胞及所述纤维环细胞来源于3周龄新西兰大白兔，其浓度为1×105-2×105个/ml。
10.根据权利要求4-9任一项所述制备方法制备的人工椎间盘复合体组织。
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