CN109939262A - 一种bFGF水凝胶的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学工程领域，尤其是一种bFGF水凝胶的制备方法及其应用，所述bFGF水凝胶的制备方法，包括以下步骤：S1、向纤维环组织中加胰蛋白酶消化得混合物；S2、向混合物中加核糖酶消化后用Trizon处理得沉淀物；S3、制备脱细胞纤维环基质溶液；S4、制备壳聚糖溶液；S5、制备京尼平溶液；S6、制备脱细胞纤维环基质/壳聚糖混合液；S7、制得bFGF缓冲液；S8、总混合得bFGF水凝胶。本发明提出的制备方法，操作简单，制得的水凝胶组织相容性好，机械性能优越，能连续释放bFGF，持续时间长，对胶原蛋白1、胶原蛋白2以及聚糖的合成具有促进作用，能够应用在在纤维环组织工程中。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域，尤其涉及一种bFGF水凝胶的制备方法及其在纤维环组织工程中的应用。
背景技术
椎间盘退变性疾病引起腰部疼痛，严重影响中老年患者的生活质量。有报道称，仅美国每年用于治疗该病的花费在160亿美元左右。椎间盘退变性疾病引起的腰部疼痛在全球广泛流行并带来了巨大的经济损失。目前，常规治疗方法包括保守治疗和外科手术治疗。通过外科手术能够显著改善患者病情，但是术后脊柱生物力学的改变会引起相邻节段的退化从而引起严重的脊柱病变。纤维环组织工程是治疗椎间盘退变性疾病的一个热点，部分专家和学者尝试使用组织工程椎间盘替换病变的椎间盘，纤维环机构和功能的完整性是维持髓核初始形态位置以及盘内生理压力的关键。有研究表明，维持纤维环的完整性在椎间盘退变性疾病的治疗中起着关键作用。胶原和黏多糖在纤维环的机械性伸缩过程中起主要作用。然而，早先的研究里基质中的胶原和黏多糖完全异于自然组织，这也导致了研究的失败。从显微结构上模拟自然组织是成功构造仿生纤维环的最大挑战。
普遍来讲理想的手术支架需要拥有较好的组织相容性、适当的降解速率，与自然组织拥有相似的结构和机械性能。近年来，随着去细胞技术的发展，原生组织支架被广泛研究。通过化学、生物酶或者机械方法去除细胞内组分同时保留细胞外基质的方法可以获得脱细胞基质。脱细胞基质不仅能减少机体的免疫排斥，同时能很好的维持初始器官的生物学功能，有利于细胞的黏着、增殖和分化。脱细胞技术已经被运用于人体的肌腱重建、皮肤移植和血管工程。目前，鲜有脱细胞纤维环基质应用于纤维环组织工程的报道。虽然脱细胞纤维环基质拥有很多优势，但较差的机械性能影响了该技术在纤维环组织中的应用。与此相反，壳聚糖拥有很好的机械性能，同时壳聚糖膜十分硬和脆。京尼平是一种毒性低的天然交联物，被作为重要的交联物。有研究表明，京尼平在机体内具有抗炎能力。此外，生长因子是纤维环组织种子细胞中促进细胞增殖、分化以及细胞外基质代谢的重要成分之一。目前，多种生长因子(如：bFGF、TGF-β1,TGF-β3、IGF-1等)已被广泛应用于纤维环组织工程学。其中，bFGF能够影响间充质干细胞的成纤维分化，促进成纤维的分化以及间充质干细胞的增殖和自我更新。然而，bFGF半衰期只有相当短的90s。简单添加生长因子的培养基不能长期调控种子细胞的代谢，对研究者而言如何让基质持续分泌生长因子是个难题。基于上述陈述，本发明旨在提出了一种bFGF水凝胶的制备方法及其在纤维环组织工程中的应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中纤维环功能替代组件组织相容性差、降解速率过快，机械性能不理想，且添加有bFGF的水凝胶其bFGF的有效时间短，不能达到持续释放，作用效果不明显的问题，而提出的一种bFGF水凝胶的制备方法及其应用。
一种bFGF水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、取纤维环组织，并将纤维环组织切成1mm×1mm×1mm大小的纤维环组织块，将纤维环组织块置于研钵中，加入液氮后捣碎，再加入0.25％胰蛋白酶溶液，置于24℃的恒温振荡器中振荡24小时，得混合物；
S2、将步骤S1得到的混合物用PBS溶液清洗三次，然后加入核糖酶溶液，并在37℃的恒温振荡器中消化12小时；消化完成后用100ml Trizon处理24小时，然后每8小时用PBS溶液处理一次至8次为止，静置得沉淀物；
S3、用醋酸水溶液溶解步骤S2得到的沉淀物，待沉淀物溶解完全即得脱细胞纤维环基质溶液，并将脱细胞纤维环基质溶液贮存在4℃冰箱内待用；
S4、取壳聚糖并加入醋酸水溶液，机械搅拌溶解，得壳聚糖溶液；
S5、取京尼平并加入乙醇水溶液，机械搅拌溶解，得京尼平溶液；
S6、将步骤S4制得的壳聚糖溶液、步骤S3制得的脱细胞纤维环基质溶液和步骤S5制得的京尼平溶液混合均匀即得脱细胞纤维环基质/壳聚糖混合液；
S7、取bFGF添加到5nM的tris缓冲液中，混合均匀即得bFGF缓冲液；
S8、将步骤S7制得的bFGF缓冲液与步骤S6制得的脱细胞纤维环基质/壳聚糖混合液混合均匀，置于孔板上，再置于冷冻干燥器干燥24小时即得bFGF水凝胶。
优选的，步骤S1中，所述纤维环组织由兔纤维环组织中的髓核和外侧筋膜脂肪组织经PBS溶液清洗三次而得。
优选的，步骤S1中，所述0.25％胰蛋白酶溶液每4小时更换一次。
优选的，所述醋酸水溶液中醋酸的质量分数为3％。
优选的，步骤S4中，所述壳聚糖和醋酸水溶液的添加量，按照每1.5g壳聚糖加入100ml醋酸水溶液进行计算。
优选的，步骤S5中，所述京尼平和乙醇水溶液的添加量，按照每1g京尼平加入100ml乙醇水溶液进行计算。
优选的，所述乙醇水溶液中乙醇的质量分数为70～80％。
优选的，步骤S6中，所述壳聚糖溶液、脱细胞纤维环基质溶液和京尼平溶液的体积比为3：3：1。
优选的，所述bFGF、tris缓冲液和脱细胞纤维环基质/壳聚糖混合液的添加量，按照bFGF 2微克对应tris缓冲液333微升、对应脱细胞纤维环基质/壳聚糖混合液6.7～7.3ml进行计算。
上述的一种bFGF水凝胶的制备方法所制得的bFGF水凝胶在纤维环组织工程中的应用。
本发明提出的一种bFGF水凝胶的制备方法，具有以下有益效果：
1、本发明提出的制备方法再京尼平的交联作用下，将bFGF成功添加到脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶中，且显著改善了脱细胞纤维环基质/壳聚糖水凝胶的组织相容性，提高水凝胶的机械性能，使其与自然组织拥有相似的结构和机械性能，拓展水凝胶在在纤维环组织工程中的应用，并能保证bFGF在使用过程中连续释放，同时对胶原蛋白1、胶原蛋白2以及聚糖的合成具有促进作用，能够应用在在纤维环组织工程中，并能有效解决现有技术中纤维环功能替代组件组织相容性差、降解速率过快，机械性能不理想，且添加有bFGF的水凝胶其bFGF的有效时间短，不能达到持续释放，作用效果不明显的问题。
2、本发明通过原生的纤维组织进行非细胞处理获得脱细胞纤维环基质溶液，不仅保存了类似于自然纤维环组织的网状结构，同时又保存了与调节种子细胞生长相关的生长因子和细胞因子，起到双重作用。
3、本发明制得的bFGF水凝胶具有良好的渗透性，较低的接触角，优异的亲水性，能使细胞更易粘附在支架表面，促进细胞的附着生长，有利于bFGF水凝胶的应用，且bFGF水凝胶具有多孔结构，有利于营养的运输，加快细胞的生长速度。
附图说明
图1为bFGF水凝胶扫描电子显微镜的表面(A)和横截面(B)图；
图2为bFGF水凝胶(B)和对照水凝胶(A)的接触角图；
图3为bFGF水凝胶中bFGF的释放曲线图；
图4为bFGF水凝胶(B)和对照水凝胶(A)扫描电子显微镜图；
图5为bFGF水凝胶、对照水凝胶和TCPS组细胞增殖水平图；
图6为bFGF水凝胶、对照水凝胶和TCPS组细胞骨架染色后细胞形态图；
图7为bFGF水凝胶和对照水凝胶实时定量PCR图；
图8为bFGF水凝胶和对照水凝胶细胞外基质成分分析图。
其中，图1中的标尺为100μm；图4中的标尺为50μm；图6中的标尺为400μm。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例
本发明提出的一种bFGF水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、取新西兰大白兔纤维环组织中的髓核和外侧筋膜脂肪组织，用PBS溶液清洗三次，得纤维组织环，将纤维环组织切成1mm×1mm×1mm大小的纤维环组织块，将纤维环组织块置于研钵中，加入液氮后捣碎，再加入0.25％胰蛋白酶溶液，置于24℃的恒温振荡器中振荡24小时，且0.25％胰蛋白酶溶液每4小时更换一次，振荡结束得混合物；
S2、将步骤S1得到的混合物用PBS溶液清洗三次，然后加入核糖酶溶液，并在37℃的恒温振荡器中消化12小时；消化完成后用100ml Trizon处理24小时，然后每8小时用PBS溶液处理一次至8次为止，静置得沉淀物；
S3、用醋酸水溶液溶解步骤S2得到的沉淀物，待沉淀物溶解完全即得脱细胞纤维环基质溶液，并将脱细胞纤维环基质溶液贮存在4℃冰箱内待用；
S4、取1.5g壳聚糖并加入100ml醋酸水溶液，机械搅拌溶解，得壳聚糖溶液；
S5、取0.1g京尼平并加入10ml乙醇水溶液，机械搅拌溶解，得京尼平溶液，所述乙醇水溶液中乙醇的质量分数为5％；
S6、将3ml步骤S4制得的壳聚糖溶液、3ml步骤S3制得的脱细胞纤维环基质溶液和1ml步骤S5制得的京尼平溶液混合均匀即得脱细胞纤维环基质/壳聚糖混合液；
S7、取2微克bFGF添加到333微升5nM的tris缓冲液中，混合均匀即得bFGF缓冲液；
S8、将步骤S7制得的bFGF缓冲液与步骤S6制得的脱细胞纤维环基质/壳聚糖混合液混合均匀，置于孔板上，再置于冷冻干燥器干燥24小时即得bFGF水凝胶。
本发明中，醋酸水溶液中醋酸的质量分数为3％。
实验证明：
1)bFGF水凝胶性能特征：
参照图1，从扫描电子显微镜的图像可以看出，本发明实施例得到的bFGF水凝胶成疏松多孔的三维网状结构。
2)bFGF水凝胶的亲水性
参照图2，对实施例制备得到的bFGF水凝胶和对照水凝胶(即未添加bFGF的水凝胶)进行测试，将bFGF水凝胶和对照水凝胶分别在37.8°±1.4°and 36.1°±1.3°进行测量。
结果表明：两种水凝胶在接触角上不存在差异，均呈现较低的接触角，且低接触角表面两种混合凝胶具有良好的亲水性，适合作为细胞粘附支架。
3)bFGF水凝胶的蛋白释放动力学研究
参照图3，通过Elisa方法测量bFGF的浓度，结果显示累积释放在7天后趋于稳定，表明本发明制备得到的bFGF水凝胶能够维持bFGF释放一周。
4)bFGF水凝胶的细胞增殖与形态学研究
参照图4-6，将实施例制备得到的bFGF水凝胶和对照水凝胶(即未添加bFGF的水凝胶)培养3天后利用细胞骨架染色和扫描电子显微镜进行观察细胞形态，明显可以发现两种水凝胶上纤维环干细胞扩散良好。
分别将实施例制备得到的bFGF水凝胶、对照水凝胶(即未添加bFGF的水凝胶)以及TCPS组在同等条件下进行培养，并在培养的第1、3、5、7天后用CCK-8分析细胞增殖情况，发现两组水凝胶中细胞的增殖速度明显快于TCPS组，但两组水凝胶之间细胞增殖水平差异不显著，利用细胞骨架染色进行细胞形态学分析显示在两种水凝胶中纤维环干细胞扩散、增殖良好。
5)bFGF水凝胶的基因表达分析
参照图7，用实时定量PCR对实施例制备的bFGF水凝胶和对照水凝胶(即未添加bFGF的水凝胶)分别进行检测，时间为2周，检测结果显示：实施例中纤维环干细胞中的胶原蛋白1和胶原蛋白2和聚糖表达量几乎是对照水凝胶的两倍，表明通过本发明提出的制备方法得到的bFGF水凝胶中纤维环干细胞的基质主成分(包括胶原蛋白1、胶原蛋白2和聚糖)较普通水凝胶高，并且差异显著(p<0.05)。
6)bFGF水凝胶细胞外基质成分分析
参照图8，对实施例制备得到的bFGF水凝胶和对照水凝胶(即未添加bFGF的水凝胶)的纤维环干细胞的生化指标进行测定，用Elisa检测出bFGF水凝胶中的纤维环干细胞的胶原蛋白1的含量为4.68±0.07ng/ug DNA，远高于对照水凝胶中的3.56±0.16ng/ugDNA；bFGF水凝胶中的纤维环干细胞的胶原蛋白2含量为11.95±0.19ng/ug，远高于对照水凝胶中的10.42±0.22ng/ug；bFGF水凝胶中的纤维环干细胞的聚糖含量为1022.23±50.83pg/ug DNA，远高于对照水凝胶中的790.95±97.89pg/ug DNA，且bFGF水凝胶中粘多糖的含量为4.43±0.26ug/ug DNA，对照水凝胶中粘多糖的含量为2.28±0.2ug/ug DNA，两组之间胶原蛋白1、胶原蛋白2、聚糖和粘多糖的含量差异显著(p<0.05)。
上述实验结果表明：本发明制备得到的bFGF水凝胶能够逐渐吸收和释放生长因子bFGF。从释放曲线我们可以看出，bFGF的吸收量到第7天达到最高值，并保持释放超过一周，bFGF的持续释放能够影响间充质干细胞的生长，由于bFGF的作用，胶原蛋白1、胶原蛋白2以及聚糖相关的基因表达量显著上升。此外，本发明得到的bFGF水凝胶较未添加bFGF的水凝胶分泌了更多的胶原蛋白1、胶原蛋白2以及聚糖。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种bFGF水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取纤维环组织，并将纤维环组织切成1mm×1mm×1mm大小的纤维环组织块，将纤维环组织块置于研钵中，加入液氮后捣碎，再加入0.25％胰蛋白酶溶液，置于24℃的恒温振荡器中振荡24小时，得混合物；
S2、将步骤S1得到的混合物用PBS溶液清洗三次，然后加入核糖酶溶液，并在37℃的恒温振荡器中消化12小时；消化完成后用100ml Trizon处理24小时，然后每8小时用PBS溶液处理一次至8次为止，静置得沉淀物；
S3、用醋酸水溶液溶解步骤S2得到的沉淀物，待沉淀物溶解完全即得脱细胞纤维环基质溶液，并将脱细胞纤维环基质溶液贮存在4℃冰箱内待用；
S4、取壳聚糖并加入醋酸水溶液，机械搅拌溶解，得壳聚糖溶液；
S5、取京尼平并加入乙醇水溶液，机械搅拌溶解，得京尼平溶液；
S6、将步骤S4制得的壳聚糖溶液、步骤S3制得的脱细胞纤维环基质溶液和步骤S5制得的京尼平溶液混合均匀即得脱细胞纤维环基质/壳聚糖混合液；
S7、取bFGF添加到5nM的tris缓冲液中，混合均匀即得bFGF缓冲液；
S8、将步骤S7制得的bFGF缓冲液与步骤S6制得的脱细胞纤维环基质/壳聚糖混合液混合均匀，置于孔板上，再置于冷冻干燥器干燥24小时即得bFGF水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种bFGF水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述纤维环组织由兔纤维环组织中的髓核和外侧筋膜脂肪组织经PBS溶液清洗三次而得。
3.根据权利要求1所述的一种bFGF水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述0.25％胰蛋白酶溶液每4小时更换一次。
4.根据权利要求1所述的一种bFGF水凝胶的制备方法，其特征在于，所述醋酸水溶液中醋酸的质量分数为3％。
5.根据权利要求1所述的一种bFGF水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述壳聚糖和醋酸水溶液的添加量，按照每1.5g壳聚糖加入100ml醋酸水溶液进行计算。
6.根据权利要求1所述的一种bFGF水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S5中，所述京尼平和乙醇水溶液的添加量，按照每1g京尼平加入100ml乙醇水溶液进行计算。
7.根据权利要求1或6所述的一种bFGF水凝胶的制备方法，其特征在于，所述乙醇水溶液中乙醇的质量分数为70～80％。
8.根据权利要求1所述的一种bFGF水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S6中，所述壳聚糖溶液、脱细胞纤维环基质溶液和京尼平溶液的体积比为3：3：1。
9.根据权利要求1所述的一种bFGF水凝胶的制备方法，其特征在于，所述bFGF、tris缓冲液和脱细胞纤维环基质/壳聚糖混合液的添加量，按照bFGF 2微克对应tris缓冲液333微升、对应脱细胞纤维环基质/壳聚糖混合液6.7～7.3ml进行计算。
10.根据权利要求1～9任意一项所述的一种bFGF水凝胶的制备方法所制得的bFGF水凝胶在纤维环组织工程中的应用。
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