CN111905146B

CN111905146B - 一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶及其制备方法

Info

Publication number: CN111905146B
Application number: CN202010763854.0A
Authority: CN
Inventors: 蔡晴; 左大为; 易蜜; 杨小平
Original assignee: Beijing Oya Borui Science & Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Oya Borui Science & Technology Co ltd
Priority date: 2020-08-01
Filing date: 2020-08-01
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2040-08-01
Also published as: CN111905146A

Abstract

本申请公开了一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶及其制备方法，属于组织工程中骨再生修复材料领域。本申请的有机‑无机复合水凝胶是以同种或异种来源的皮质骨或松质骨为原材料，经过脱脂、脱细胞、脱钙处理保留不同程度的天然骨矿、酶解消化、纯化处理后，调节溶液的pH和盐浓度至生理条件后得到预凝胶液，使用时升温至37±1℃经自组装形成的水凝胶。本申请骨组织脱细胞外基质水凝胶有效保留了骨基质中的天然羟基磷灰石成分，且羟基磷灰石与胶原纤维结合良好，分散均匀，可作为温敏性可注射型水凝胶应用于骨组织工程，具有良好的应用前景。

Description

一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶及其制备方法

技术领域

本申请涉及组织工程中骨再生修复材料领域，特别涉及一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶及其制备方法。

背景技术

目前，由创伤、感染、肿瘤或先天性疾病引起的关键性骨缺损的临床治疗，仍倾向于基于自体或同种异体骨移植物。然而，严重的供体部位发病率、高度的感染风险和运输等问题，阻碍了它们成为可持续发展的骨修复材料。

基于生物可降解多孔支架的组织工程技术，被认为是进行骨再生修复的可行和有效替代策略。如今，已被广泛应用于骨组织工程支架的材料多为人工合成的可降解脂肪族聚酯，如聚乳酸、聚（乳酸-羟基乙酸）、聚己内酯等。此合成材料往往缺乏生物活性成分，需要通过改性或添加外源性生物活性成分如生长因子、生物活性陶瓷来达到促进骨再生的目的。即便如此，骨组织的修复是一个包括多种生物活性因子协同作用的复杂过程，通过人工合成生物材料负载外源性生物活性成分来仿生模拟骨再生修复对其天然微环境的各种需求仍是一个巨大的挑战。

细胞外基质（ECM）是细胞周围由多种大分子组成的复杂网络，包括胶原蛋白、非胶原蛋白、弹性蛋白以及糖胺聚糖，ECM来源的材料由于其极大程度地保留了细胞生存和功能表达所需的活性因子，无疑是一种比合成材料更加利于损伤组织修复再生的组织工程支架材料。通过脱细胞技术可以将供体ECM中具有免疫原性的细胞脱除，以避免材料植入后引起免疫排斥反应和潜在的疾病传染。目前已有很多商品化的脱细胞外基质产品，如脱细胞真皮组织（Alloderm®; LifeCell），脱细胞猪心脏瓣膜（Synergraft®; Cryolife）和脱细胞猪膀胱（Urinary bladder matrix; ACell）等，已用于临床治疗，这些ECM材料中富含的胶原、糖胺聚糖以及生物活性因子等，能够显著促进组织再生和功能重建。

外科临床手术操作呈现微创化趋势，对于可注射性植入材料的需求越来越旺盛。研究发现，脱细胞外基质的预凝胶溶液常表现出温敏性凝胶的特点，即在低温（4 ℃）下具有良好的流动性，可搭载种子细胞，但在人体温度37 ℃下可快速凝胶。由此，具有良好的生物相容性、生物活性和可注射性的ECM水凝胶，注射到损伤部位后可迅速在原位凝胶化，具有良好的临床应用前景。已有证据证明，采用同源性的ECM支架对相应组织进行修复和重建，相比于其他组织来源的ECM材料，能更有效地促进组织再生修复。所以来自骨组织的ECM材料无疑是最适用于骨组织再生的天然材料。特别是复合有生物活性陶瓷的有机无机复合ECM材料，能为骨组织再生提供更为仿生的微环境。不同于其他组织的ECM，天然骨ECM中除了富含I型胶原、骨基质蛋白、糖胺聚糖和生长因子等有机成分外，更含有高达约70%的无机组分，主要成分是羟基磷灰石。在ECM水凝胶制备的现有技术中，常规脱脂和脱细胞处理后，会使用消化酶将ECM中的胶原纤维酶解，得到胶原蛋白三螺旋分子的水溶液；由于胃蛋白酶的消化效率高，所以消化酶最常选用胃蛋白酶，另外为了充分发挥胃蛋白酶的活性，体系的pH通常采用盐酸/乙酸溶液调节至2.0左右。然而在酸性的、胃蛋白酶的消化条件下，碱性的羟基磷灰石是无法保留在最终形成的ECM水凝胶中的。所以，现有的文献制备的ECM水凝胶全都由完全脱钙、脱细胞的骨基质进行酶解制得。如果要获得有机-无机复合ECM水凝胶用于骨再生修复，通常只能通过向ECM水凝胶中共混添加羟基磷灰石、用模拟体液矿化ECM凝胶或凝胶与羟基磷灰石共沉淀生成等方式引入羟基磷灰石成分来实现，但这些制备方法往往存在羟基磷灰石易团聚、分散不均匀以及添加量有限等不足，限制了其临床使用。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本申请的目的一是提供一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶，水凝胶中羟基磷灰石与胶原纤维结合良好，分散均匀，可作为温敏性可注射型水凝胶应用于骨组织工程。

本申请的目的二是提供一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，采用一步消化酶解法便可制备获得保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶，易于操作。

本申请的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶，所述水凝胶含有天然骨组织细胞外基质的羟基磷灰石、胶原、糖胺聚糖以及成骨生物活性因子；所述水凝胶中保留的羟基磷灰石含量≤60 wt%。

通过采用上述技术方案，本申请的保留羟基磷灰石脱细胞骨基质水凝胶含有天然骨细胞外基质中的主要有机成分I型胶原、糖胺聚糖和成骨生物活性因子，以及无机成分羟基磷灰石。与不含羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶相比，由于本申请的保留羟基磷灰石脱细胞骨基质水凝胶更接近骨细胞微环境，可以更好的诱导成骨相关细胞分化成骨，成骨作用强。与向ECM水凝胶中共混添加羟基磷灰石、用模拟体液矿化ECM凝胶或凝胶与羟基磷灰石共沉淀等方式向水凝胶中引入羟基磷灰石相比，本申请的保留羟基磷灰石脱细胞骨基质水凝胶的羟基磷灰石在凝胶中分布均匀，并与胶原纤维结合紧密，不会发生明显的沉降和团聚。本申请的保留羟基磷灰石脱细胞骨基质水凝胶取材广，具有良好的生物相容性和生物可降解性，结构上具有与天然羟基磷灰石结合良好的胶原纤维三维网络结构，生物学性能上具有诱导成骨相关细胞如骨髓间充质干细胞成骨分化的潜力，具有良好的临床应用前景。

本申请的目的二是：提供一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

a.选用同种或异种来源的骨组织，用水反复冲洗去除骨髓，冷冻干燥、粉碎、筛分得到粒径小于1 mm的骨粉，骨粉灭菌处理后用PBS缓冲液洗涤1~6 h；

b.用体积比为1:0.5-2的氯仿和甲醇混合液浸泡步骤a处理得到的骨粉1-3 h后，用PBS缓冲液洗涤；再用pH 7.4 10 mM Tris-HCl缓冲液浸泡骨粉10-14h，得到脱脂骨粉；

c.将步骤b制备的脱脂骨粉浸泡在pH 7.4含SDS的10 mM Tris-HCl缓冲液中18-30h，用PBS缓冲液洗涤；然后在37 ℃下，用pH 7.4含DNase I和RNase A的10 mM Tris-HCl缓冲液继续浸泡3-6 h，再用PBS缓冲液洗涤并冷冻干燥，得到脱细胞骨粉；

d.将饱和磷酸与磷酸钙盐混合，搅拌18-30h，制备pH 2.2~2.8的磷酸-磷酸盐饱和溶液，过滤；

e.在30℃条件下，向步骤d中制备的磷酸-磷酸盐饱和溶液中加入步骤c制备的脱细胞骨粉和胃蛋白酶，所述胃蛋白酶的添加量为溶液体积的0.05-0.5%，消化12~36 h；

f.将步骤e获得液体转移到透析袋中，0-4℃条件下用去离子水透析4-6 d，向透析后的溶液中加入PBS缓冲液调节溶液盐浓度到生理条件，加入NaOH溶液调节pH到7.4，得到预凝胶液；

g.使用时，将步骤f的预凝胶液升温到37±1℃，保温≥10 min，即可得到保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶。

通过采用上述技术方案，本申请将原材料先后通过洗去骨髓、用甲醇/氯仿混合溶液脱脂、用低渗溶液使细胞膜破裂、用洗涤剂SDS脱除细胞以及用DNase和RNase酶解残余的核酸片段来脱细胞，制备获得的脱细胞骨基质不仅保留了骨基质中的羟基磷灰石、I型胶原、糖胺聚糖以及成骨生物活性因子，同时具有低免疫原性。

本申请使用pH 2.2~2.8的饱和磷酸-磷酸盐胃蛋白酶溶液对骨基质进行消化，尤其是pH 2.6的饱和磷酸-磷酸盐胃蛋白酶溶液，是为了避免骨基质中的羟基磷灰石在酶解过程中溶解，从而可尽可能多地在酶解消化的溶液中保留骨基质中的天然羟基磷灰石成分。胃蛋白酶必须在较低pH下才能维持较高的催化活性，但溶液pH值越低，磷酸-磷酸盐饱和溶液中的盐浓度就越高，而高浓度的盐溶液会显著降低胃蛋白酶的催化效率。因此，既要体系pH较低以催化胃蛋白酶对ECM的酶解，又要求pH不可过低，以免高浓度的盐降低胃蛋白酶的催化效率。通过上述操作可使原始骨基质中的羟基磷灰石聚集体，随着胶原分子的酶解，而逐渐解离为在凝胶中分布均匀的微粒，并与胶原纤维结合紧密，不会发生明显的沉降和团聚。

所得到的骨基质消化液采用去离子水进行透析纯化，可有效地去除可溶性钙盐，以确保获得无机物含量可控的保留天然羟基磷灰石脱细胞骨基质水凝胶。骨基质酶解消化液经过透析纯化以及调节pH和盐浓度至生理条件后得到的溶液，在4 ℃下可长期保存不会发生凝胶化，具有很好的贮存稳定性，且具有良好的可注射性。

当该溶液被注射到37±1℃环境中，由于胶原蛋白三螺旋分子的自组装，其可在10min后失去流动性，呈现凝胶态，这为实施微创注射治疗提供了合适的手术操作时间。

综上，本申请有效的解决了用富含羟基磷灰石的天然骨基质直接脱细胞、酶解制备有机-无机水凝胶过程中，传统酸性条件下进行酶消化时，骨基质中的羟基磷灰石易溶解且在后续纯化过程中易溶出，使制备获得的ECM水凝胶中无机成分含量有限或完全丢失的问题。本申请用饱和磷酸-磷酸盐溶液替代传统的盐酸/乙酸溶液作为酶消化的介质，以最大程度地保留天然骨基质中的羟基磷灰石，得到的保留天然羟基磷灰石脱细胞骨基质水凝胶与常规有机-无机复合水凝胶相比，水凝胶内羟基磷灰石不团聚、分散均匀，羟基磷灰石含量≤60 wt%。

优选的，在步骤c和e之间增加如下步骤：将步骤c制备的脱细胞骨粉用pH 7.4 0.1M EDTA溶液浸泡1~4 h，每间隔1 h更换新鲜EDTA溶液后，用PBS缓冲液洗涤并冷冻干燥，得到具有不同羟基磷灰石含量的脱细胞骨粉。

通过采用上述技术方案，与使用强酸脱除无机物不同，EDTA为金属螯合剂，选用螯合型的EDTA水溶液进行脱钙，可温和脱钙而不损伤细胞外基质，可以更大程度保留ECM中的主要成分，EDTA较为缓慢的脱钙速度则更方便通过控制EDTA的脱钙处理时间，来改变骨基质中的钙含量。本申请通过EDTA溶液对脱细胞骨基质进行不同时间的脱钙处理，可得到不同无机盐含量的骨基质，可以拓展材料的应用范围，更好的满足临床需要。

优选的，步骤a中，所述骨组织为同种骨或异种骨的皮质骨或松质骨，异种骨来源为羊、牛或猪等中的一种。经粉碎、筛分后得到的骨粉粒径范围控制小于1mm，更优选的，骨粉粒径范围控制小于0.1mm。

通过采用上述技术方案，本申请的骨组织取材广，原料获取容易，降低了制备获得的保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的成本。另外，粉碎后的骨粉粒径限制在小于1mm，保证了胃蛋白酶的消化效率，骨粉粒径越小，消化的效率就越高，使制备获得的水凝胶中天然羟基磷灰石的分散性和均一性更好。

优选的，步骤a中，灭菌处理的方法为将骨粉在75%乙醇浸泡0.5-1.5h。

通过采用上述技术方案，本申请将粉碎后的骨粉在75%乙醇浸泡从而实现灭菌操作，一方面操作简单，灭菌效果好；另一方面，采用乙醇浸泡不影响后续的操作，保证了保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的成功制备。

优选的，步骤c中，SDS的浓度为0.5~1 % w/v。

通过采用上述技术方案，本申请采用0.5~1 % w/v 的SDS脱除细胞，降低了制备获得的水凝胶的免疫原性，以避免材料植入后引起免疫排斥反应和潜在的疾病传染。

优选的，步骤c中，所述DNase I的浓度为50~100 U/mL；RNase A的浓度为5~10 U/mL。

通过采用上述技术方案，本申请采用50~100 U/mL DNase I和5~10 U/mL RNaseA，可以酶解体系内残余的核酸片段，从而进一步降低水凝胶的免疫原性，进一步提高注射材料的生物安全性。

优选的，步骤d中，磷酸钙盐选用羟基磷灰石、磷酸三钙和磷酸一氢钙中的一种或多种。更优选的，磷酸钙盐选用羟基磷灰石。

通过采用上述技术方案，本申请的磷酸钙盐选用羟基磷灰石、磷酸三钙和磷酸一氢钙中的一种或多种，它们均可制备成饱和磷酸-磷酸盐溶液来有效催化胃蛋白酶酶解保留羟基磷灰石的骨基质，避免了骨基质中的羟基磷灰石在酶解过程中溶解。另外，本申请只需限定磷酸-磷酸盐饱和溶液的pH 值即可制备磷酸-磷酸盐饱和溶液，这是因为磷酸-磷酸盐饱和溶液是一个饱和体系，只需要用浓磷酸调节过饱和的磷酸-磷酸钙溶液至目标pH，再过滤去除多余的磷酸钙盐沉淀即可。

优选的，步骤e中，所述胃蛋白酶的添加量为溶液体积的0.1%。

通过采用上述技术方案，本申请对胃蛋白酶与骨粉的加入量进行了限制，从而很好的控制胃蛋白酶的消化效率。

优选的，步骤e中，骨粉的添加量为溶液体积的0.5-5 %。更优选的，骨粉的添加量为溶液体积的3 %。

通过采用上述技术方案，本申请将骨粉的添加量（质量）限定为磷酸-磷酸盐饱和溶液体积的0.5-5 %，从而限定了水凝胶中胶原的浓度。如果胶原含量过低，预凝胶液会无法形成凝胶；如果胶原含量过高，需要消化大量的骨粉，一方面降低了消化效率，另一方面形成预凝胶的粘度较大，失去可注射性。

优选的，步骤f中，透析袋的截留分子量为3500~5000da。

通过采用上述技术方案，本申请选用截留分子量为3500~5000da的透析袋，可以有效的对骨基质消化液进行纯化，使可溶性钙盐穿过透析袋，并截留溶解后的骨基质中的蛋白，达到纯化的效果。

优选的，步骤f中，向透析纯化后的溶液中加入1/9体积的10×PBS溶液。

优选的，步骤f中，NaOH溶液的浓度为0.01~1 M。更优选的，NaOH溶液的浓度为0.1M。

优选的，步骤a-g中，所用到的溶液均通过0.22 μm微孔滤膜过滤进行无菌处理。

通过采用上述技术方案，本申请制备方法中的所有操作均为无菌操作，且所有溶液均通过0.22 μm微孔滤膜过滤进行无菌处理，从而保证制备获得的保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶无杂菌污染，保证了水凝胶用于临床上的安全性。

优选的，步骤a-g中，除了步骤c中用DNase I和RNase A酶脱细胞在37℃进行、步骤f中用含胃蛋白酶的磷酸-磷酸钙盐饱和溶液消化骨粉在30℃进行、步骤g中透析纯化及调节体系盐浓度和pH的过程在0-4℃下进行以及步骤h中升温诱导胶原自组装凝胶在37℃±1下进行外，在其余制备步骤均在室温下进行。

综上所述，本申请具有以下有益效果：

1、在结构上，本申请水凝胶中的羟基磷灰石可与胶原纤维良好结合，在羟基磷灰石与胶原纤维形成的三维网络结构中均匀分散；在生物学性能上，本申请水凝胶具有诱导成骨相关细胞如骨髓间充质干细胞成骨分化的潜力；

2、本申请的预凝胶液在4 ℃下可长期保存不会发生凝胶化，具有良好的贮存稳定性和可注射性，当预凝胶液被注射到37±1℃环境中，可在10 min后失去流动性，呈现凝胶态，为实施微创注射治疗提供了合适的手术操作时间；

3、本申请采用一步消化酶解法制备获得保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶，操作方法简单，适合大规模制备。

附图说明

图1是本申请实施例1制备的BM和对比例2制备的DBM的预凝胶溶液和水凝胶宏观图和SEM图；

图2是本申请实施例1冷干后的天然骨基质和制备获得的BM水凝胶中无机物含量对比图；

图3是本申请0.1 M EDTA溶液间隔1 h换液脱钙处理后的天然骨基质骨粉中的无机物含量图；

图4是本申请实施例1制备的BM预凝胶溶液注射植入大鼠背部皮下时的表观图；

图5是本申请实施例1制备的BM预凝胶溶液和对比例2制备的DBM预凝胶溶液注射植入大鼠背部皮下后的表观图；

图6是本申请实施例1制备的BM凝胶和对比例2制备的DBM凝胶2天后的宏观解剖视图；

图7是植入大鼠皮下7天时实施例1制备的BM和对比例2制备的DBM凝胶材料区域的H&E染色图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。

实施例1

一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

a.选用新鲜羊皮质骨，用高速水流反复冲洗去除骨髓，冷冻干燥24h、粉碎、筛分得到粒径小于0.1 mm的骨粉，将骨粉在75%乙醇浸泡1h灭菌处理，用PBS缓冲液洗涤3 h；

b.用体积比为1:1的氯仿和甲醇混合液浸泡步骤a处理得到的骨粉2 h，骨粉与氯仿/甲醇混合溶液的比例为1:25（w/v），用PBS缓冲液洗涤3次；再用pH 7.4 10 mM Tris-HCl缓冲液浸泡骨粉12h，骨粉与Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:25（w/v），得到脱脂骨粉；

c.将步骤b制备的脱脂骨粉浸泡在pH 7.4含0.8% w/v SDS的10 mM Tris-HCl缓冲液中24 h，骨粉与含SDS的Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:25（w/v），用PBS缓冲液洗涤3次；然后在37 ℃下，用pH 7.4含60 U/mL DNase I和6 U/mL RNase A的10 mM Tris-HCl缓冲液继续浸泡4 h，骨粉与缓冲溶液的质量体积比为1:25（w/v），再用PBS缓冲液洗涤3次并冷冻干燥24 h，得到脱细胞骨粉；

d.将3.5 g浓磷酸（85%）与2 g羟基磷灰石共同加入100 mL去离子水中，搅拌24 h，制备pH 2.6的磷酸-磷酸盐饱和溶液，过滤；

e.在30℃条件下，向50 mL磷酸-磷酸钙盐饱和溶液中加入1.5 g骨粉和50 mg胃蛋白酶，消化24 h；

f.将50 mL步骤e获得液体转移到截留分子量为3500~5000da的透析袋中，4℃条件下用去离子水透析5 d，每天更换新鲜的去离子水；向透析后的溶液中加入1/9体积的10×PBS缓冲液调节溶液盐浓度到生理条件，加入0.1 M NaOH溶液调节pH到7.4，得到预凝胶液；

g.使用时，将步骤f的预凝胶液升温到37℃，保温≥10 min，即可得到保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶。

实施例2

a.选用新鲜牛皮质骨，用高速水流反复冲洗去除骨髓，冷冻干燥24 h、粉碎、筛分得到粒径小于1 mm的骨粉，将骨粉在75%乙醇浸泡0.5 h灭菌处理，用PBS缓冲液洗涤6 h；

b.用体积比为1:0.5的氯仿和甲醇混合液浸泡步骤a处理得到的骨粉3 h，骨粉与氯仿/甲醇混合溶液的比例为1:25（w/v），用PBS缓冲液洗涤3次；再用pH 7.4 10 mM Tris-HCl缓冲液浸泡骨粉14h，骨粉与Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:25（w/v），得到脱脂骨粉；

c.将步骤b制备的脱脂骨粉浸泡在pH 7.4含0.5 % w/v SDS的10 mM Tris-HCl缓冲液中30 h，骨粉与含SDS的Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:25（w/v），用PBS缓冲液洗涤3次；然后在37 ℃下，用pH 7.4含100 U/mL DNase I和5U/mL RNase A的10 mM Tris-HCl缓冲液继续浸泡6 h，骨粉与缓冲溶液的质量体积比为1:25（w/v），再用PBS缓冲液洗涤3次并冷冻干燥24h，得到脱细胞骨粉；

d.将步骤c制备的2 g脱细胞骨粉用50 mL pH 7.4 0.1 M EDTA溶液浸泡1 h，每间隔1 h更换新鲜EDTA溶液后，用PBS缓冲液洗涤3次并冷冻干燥24h；

e.将2.5 g浓磷酸（85%）与3.5 g 磷酸一氢钙共同加入100 mL去离子水中，搅拌18h，制备pH 2.4的磷酸-磷酸盐饱和溶液，过滤；

f.在30℃条件下，向50 mL磷酸-磷酸钙饱和溶液中加入0.25 g脱细胞骨粉和250mg胃蛋白酶，消化12h；

g.将50 mL步骤f获得液体转移到截留分子量为3500~5000 da的透析袋中，4℃条件下用2 L去离子水透析6 d，每天更换新鲜的去离子水；向透析后的溶液中加入1/9体积的10×PBS缓冲液调节溶液盐浓度到生理条件，加入0.01 M NaOH溶液调节pH到7.4，得到预凝胶液；

h.使用时，将步骤g的预凝胶液升温到37℃，保温≥10 min，即可得到保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶。

实施例3

a.选用新鲜羊松质骨，用高速水流反复冲洗去除骨髓，冷冻干燥24 h、粉碎、筛分得到粒径小于0.1 mm的骨粉，将骨粉在75%乙醇浸泡1.5 h灭菌处理，用PBS缓冲液洗涤1 h；

b.用体积比为1:2的氯仿和甲醇混合液浸泡步骤a处理得到的骨粉1h，骨粉与氯仿/甲醇混合溶液的比例为1:25（w/v），用PBS缓冲液洗涤3次；再用pH 7.4 10 mM Tris-HCl缓冲液浸泡骨粉10h，骨粉与Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:25（w/v），得到脱脂骨粉；

c.将步骤b制备的脱脂骨粉浸泡在pH 7.4含1 % w/v SDS的10 mM Tris-HCl缓冲液中18 h，骨粉与含SDS的Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:25（w/v），用PBS缓冲液洗涤3次；然后在37 ℃下，用pH 7.4含50 U/mL DNase I和10 U/mL RNase A的10 mM Tris-HCl缓冲液继续浸泡3 h，骨粉与缓冲溶液的质量体积比为1:25（w/v），再用PBS缓冲液洗涤3次并冷冻干燥24h，得到脱细胞骨粉；

d.将步骤c制备的2 g脱细胞骨粉用50 mL pH 7.4 0.1 M EDTA溶液浸泡2 h，每隔1 h更换新鲜EDTA溶液，用PBS缓冲液洗涤3次并冷冻干燥24 h；

e.将14 g浓磷酸（85%）与7 g羟基磷灰石共同加入100 mL去离子水中，搅拌24 h，制备pH 2.2的磷酸-磷酸盐饱和溶液，过滤；

f.在30℃条件下，向50 mL磷酸-磷酸钙盐饱和溶液中加入2.5g骨粉和25mg胃蛋白酶，消化36 h；

g.将50 mL步骤f获得液体转移到截留分子量为3500~5000 da的透析袋中，4℃条件下用2 L去离子水透析4 d，每天更换新鲜的去离子水；向透析后的溶液中加入1/9体积的10×PBS缓冲液调节溶液盐浓度到生理条件，加入1 M NaOH溶液调节pH到7.4，得到预凝胶液；

h.使用时，将步骤g的预凝胶液升温到36℃，保温≥10 min，即可得到保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶。

实施例4

a.选用新鲜猪皮质骨，用高速水流反复冲洗去除骨髓，冷冻干燥24h、粉碎、筛分得到粒径小于0.5 mm的骨粉，将骨粉在75%乙醇浸泡1h灭菌处理，用PBS缓冲液洗涤3 h；

c.将步骤b制备的脱脂骨粉浸泡在pH 7.4含0.8% w/v SDS的10 mM Tris-HCl缓冲液中24 h，骨粉与含SDS的Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:25（w/v），用PBS缓冲液洗涤3次；然后在37 ℃下，用pH 7.4含60 U/mL DNase I和6 U/mL RNase A的10 mM Tris-HCl缓冲液继续浸泡4 h，骨粉与缓冲溶液的质量体积比为1:25（w/v），再用PBS缓冲液洗涤3次并冷冻干燥24h，得到脱细胞骨粉；

d.将步骤c制备的2 g脱细胞骨粉用50 mL pH 7.4 的0.1 M EDTA溶液浸泡3 h，每隔1 h更换新鲜EDTA溶液，用PBS缓冲液洗涤3次并冷冻干燥24 h；

e.将3.5 g浓磷酸（85%）与2 g磷酸三钙共同加入100 mL去离子水中，搅拌25 h，制备pH 2.6的磷酸-磷酸盐饱和溶液，过滤；

f.在30℃条件下，向50 mL磷酸-磷酸钙盐饱和溶液中加入1.5 g骨粉和50 mg胃蛋白酶，消化24 h；

g.将50 mL步骤f获得液体转移到截留分子量为3500~5000 da的透析袋中，4℃条件下用去离子水透析5 d，每天更换新鲜的去离子水；向透析后的溶液中加入1/9体积的10×PBS缓冲液调节溶液盐浓度到生理条件，加入0.1 M NaOH溶液调节pH到7.4，得到预凝胶液；

h.使用时，将步骤g的预凝胶液升温到38℃，保温≥10 min，即可得到保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶。

实施例5

a.选用新鲜牛松质骨，用高速水流反复冲洗去除骨髓，冷冻干燥24h、粉碎、筛分得到粒径小于0.8 mm的骨粉，将骨粉在75%乙醇浸泡1.2 h灭菌处理，用PBS缓冲液洗涤4 h；

b.用体积比为1:1.5的氯仿和甲醇混合液浸泡步骤a处理得到的骨粉1.5h，骨粉与氯仿/甲醇混合溶液的比例为1:25（w/v），用PBS缓冲液洗涤3次；再用pH 7.4 的10 mMTris-HCl缓冲液浸泡骨粉13h，骨粉与Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:25（w/v），得到脱脂骨粉；

c.将步骤b制备的脱脂骨粉浸泡在pH 7.4含0.6 % w/v SDS的10 mM Tris-HCl缓冲液中20 h，骨粉与含SDS的Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1:25（w/v），用PBS缓冲液洗涤3次；然后在37 ℃下，用pH 7.4含80 U/mL DNase I和8 U/mL RNase A的10 mM Tris-HCl缓冲液继续浸泡5h，骨粉与缓冲溶液的质量体积比为1:25（w/v），再用PBS缓冲液洗涤3次并冷冻干燥24h，得到脱细胞骨粉；

d.将步骤c制备的2 g脱细胞骨粉用50 mL pH 7.4 0.1 M EDTA溶液浸泡4h，每隔1h更换新鲜EDTA溶液，用PBS缓冲液洗涤3次并冷冻干燥24h；

e.将1.4 g浓磷酸（85%）与0.8 g磷酸三钙共同加入100 mL去离子水中，搅拌30h，制备pH 2.8的磷酸-磷酸盐饱和溶液，过滤；

f.在30℃条件下，向50 mL磷酸-磷酸钙盐饱和溶液中加入2 g骨粉和100 mg胃蛋白酶，消化30 h；

g.将50 mL步骤f获得液体转移到截留分子量为3500~5000 da的透析袋中，4℃条件下用2 L去离子水透析4.5 d，每天更换新鲜的去离子水；向透析后的溶液中加入1/9体积的10×PBS缓冲液调节溶液盐浓度到生理条件，加入0.5 M NaOH溶液调节pH到7.4，得到预凝胶液；

对比例1

d.在30℃条件下，向50 mL 0.1 M的盐酸溶液中加入1.5 g骨粉和50 mg胃蛋白酶，消化24 h。

对比例2

d. 将步骤c制备的2 g脱细胞骨粉用50 mL pH 7.4的0.1 M EDTA溶液浸泡3 d，每隔1 d更换新鲜EDTA溶液，用PBS缓冲液洗涤3次并冷冻干燥24 h，得完全脱钙的脱细胞骨粉；

e.将3.5 g浓磷酸（85%）与2 g羟基磷灰石共同加入100 mL去离子水中，搅拌24 h，制备pH 2.6的磷酸-磷酸盐饱和溶液，过滤；

f.在30℃条件下，向50 mL磷酸-磷酸钙盐饱和溶液中加入0.5 g骨粉和50 mg胃蛋白酶，消化24 h；

g.将50 mL步骤e获得液体转移到截留分子量为3500~5000da的透析袋中，4℃条件下用去离子水透析5 d，每天更换新鲜的去离子水；向透析后的溶液中加入1/9体积的10×PBS缓冲液调节溶液盐浓度到生理条件，加入0.1 M NaOH溶液调节pH到7.4，得到预凝胶液；

h.使用时，将步骤f的预凝胶液升温到37℃，保温≥10 min，即可得到未保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶。

性能测试

1.凝胶宏观和微观结构

凝胶宏观形貌如图1a和1b所示，图1a为预凝胶溶液，图1b为水凝胶，其中图1a和1b的左侧均为完全脱钙后的脱细胞骨基质（DBM，由对比例2制备），右侧均为未脱钙的脱细胞骨基质（BM，由实施例1制备）。

通过SEM观察BM和DBM凝胶的微观形貌：将成型的凝胶样品放入水/乙醇混合溶液中梯度脱水，乙醇浓度依次为30%、50%、70%、80%、90%和100%，每个梯度浸泡30 min；再用100%叔丁醇置换3次，每次浸泡30 min；叔丁醇置换完成后，加入少量100 %叔丁醇没过样品表面，放入-20 ℃冰箱内冷却1 h，放入冷干机内冷冻干燥12 h；将冻干后样品放入液氮冷却后取出淬断，取断面观察。通过溅射镀膜在样品断面镀上一层金，喷金时间为60 s，在电子加速电压为5 KV下，用SEM观察微观形貌。图1c和1d分别为DBM和BM水凝胶的SEM图像。

在盐酸介质中，对比例1因盐酸被骨基质中羟基磷灰石消耗，体系pH过高，无法消化含钙的骨基质得到均一溶液，从而无法得到含无机物的水凝胶。

2. BM水凝胶中无机物含量测定

将凝胶冷干后放入110℃烘箱内过夜，完全去除水分后称重，再将样品在800℃马弗炉中煅烧4 h去除有机物，冷却后称重，计算凝胶中实际无机物含量。作为对比，脱细胞处理后的骨粉也采用此法确定其无机物含量。

无机物含量=烧结后质量/烧结前质量

实施例1-5、对比例2中无机物含量具体参见表1。

表1和图2的实验结果表明，本申请实施例1中采用煅烧法测得冷干后的脱细胞天然骨基质中的无机物含量为66.15±1.46%。而由这些骨基质酶解获得的BM水凝胶，测得无机物含量为56.68±0.94%。虽然相比于酶解前无机物含量有所下降，但采用胃蛋白酶的磷酸-磷酸盐饱和溶液处理BM，可在最终的水凝胶中保留绝大部分的无机物组分。

表1和图3的实验结果表明，使用0.1 M EDTA溶液每间隔1 h换液进行脱钙，随着骨粉在EDTA溶液中浸泡时间延长，其中的无机物含量逐渐减少，脱钙时间控制在4 h以内，骨基质中的无机物含量呈稳定下降的梯度分布，后续可根据不同应用需求制备含不同天然HA的BM水凝胶。

3.凝胶的生物相容性

（1）SD大鼠背部皮下埋植模型建立

本实验均按照北大口腔医学院实验动物部的规范标准程序，进行动物手术过程。选取16只8周龄雄性SD大鼠进行实验，在SD大鼠腹腔中注射10 %（w/v）的水合氯醛溶液以麻醉，剂量为每100 g体重0.3 mL，待大鼠失去反射反应后，剔除背部两侧毛发，用碘伏消毒，使用26号针头将实施例1制备的BM预凝胶溶液和对比例2制备的DBM的预凝胶溶液注射入大鼠背部皮下，每只SD大鼠背部左右各注射植入1种材料，每个位点注射0.5 mL预凝胶液。

选择植入2 d、7 d的4只SD大鼠进行试验，用CO₂窒息法处死大鼠，将大鼠背部埋植材料处毛发用脱毛膏完全去除后，与完整皮肤一同取出植入物，放入4 %多聚甲醛中固定12h，随后将样品冰冻切片，并进行组织学染色，检测植入凝胶的生物安全性。

（2）冰冻切片

1）将4%多聚甲醛固定12 h后的组织转移到含30%（w/v）蔗糖的PBS溶液中脱水，直到蔗糖-PBS溶液中的组织沉入容器底部；

2）取出材料用滤纸吸干组织表面水分，浸入盛有OCT包埋剂的模具中，将模具放入漂浮在液氮上的塑料盒内，使OCT与组织缓慢凝固；

3）将样品置于托物台，用冰冻切片机切片，切片机内温度设定为-20 ℃，切片厚度设置为10 μm；

4）将切下的组织迅速贴到载玻片上，迅速将载玻片放入乙醚/乙醇（体积比为1:1）的混合溶液中固定10 s；

5）将固定的切片放到37℃的恒温台上，烤片1 h 后，可进行后续染色实验。

（3）H&E染色

1）冰冻切片烤片完成后取出切片，用去离子水浸泡2次去除切片表面OCT，每次15min；

2）将切片置于苏木精染料中对细胞核染色，浸泡10 min后，用自来水小心反复冲洗切片；

3）将切片置于1 %盐酸酒精内分化，浸泡20 s, 用自来水小心反复冲洗切片；

4）将切片置于0.1%氨水溶液中返蓝，浸泡10 min, 用自来水小心反复冲洗切片；

5）将切片置于伊红染液中对细胞质进行染色，浸泡5 min，用自来水小心反复冲洗切片；

6）将切片用乙醇梯度脱水，最后再置于二甲苯中5 min，取出待二甲苯干燥后用中性树脂封片，待中性树脂干燥后用Nanozoomer数字病理切片扫描仪观察。

实验结果如图4、5所示，图4表明本申请实施例1制备的BM预凝胶溶液具有很好的流动性和可注射性，能够很顺利地注射到大鼠皮下，注射推进过程中没有感觉到明显的阻力。图5显示本申请实施例1制备的BM预凝胶溶液注射后很快在皮下注射部位形成凝胶，宏观表现为局部隆起。这表明BM预凝胶溶液在体温环境下具有快速凝胶的特性，符合微创植入的需求（图5中小鼠背部左侧为DBM水凝胶，右侧为BM水凝胶）。

图6为实施例1制备的BM凝胶和对比例2制备的DBM凝胶2 d后的宏观解剖视图，其中图a为BM凝胶，图b为DBM凝胶。实验结果表明，注射植入2 d后，BM和DBM凝胶宏观看无明显炎症，生物相容性良好。

图7为实施例1制备的BM凝胶和对比例2制备的DBM凝胶高分辨率的H&E染色图，其中图a为BM凝胶，图b为DBM凝胶。实验结果表明，当材料植入7 d后，BM和DBM凝胶中观察到的炎症细胞数量较少，机体也未发生严重排斥反应，在植入凝胶周围未观察到明显纤维囊的形成，可以认为酶解制备的天然骨基质凝胶本质上不会引起显著的生物相容性问题。

本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶，其特征在于：所述水凝胶含有天然骨组织细胞外基质的羟基磷灰石、胶原、糖胺聚糖以及成骨生物活性因子；所述水凝胶中保留的羟基磷灰石含量≤60 wt%。

2.一种权利要求1所述的保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

c.将步骤b制备的脱脂骨粉浸泡在pH 7.4含SDS的10 mM Tris-HCl缓冲液中18-30 h，用PBS缓冲液洗涤；然后在37 ℃下，用pH 7.4含DNase I和RNase A的10 mM Tris-HCl缓冲液继续浸泡3-6 h，再用PBS缓冲液洗涤并冷冻干燥，得到脱细胞骨粉；

g.使用时，将步骤f的预凝胶液升温到37±1 ℃，保温≥10 min，即可得到保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶。

3.根据权利要求2所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：在步骤c和e之间增加如下步骤：将步骤c制备的脱细胞骨粉用pH 7.4 0.1M EDTA溶液浸泡1~4 h，每间隔1 h更换新鲜EDTA溶液后，用PBS缓冲液洗涤并冷冻干燥，得到具有不同羟基磷灰石含量的脱细胞骨粉。

4.根据权利要求2或3所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤a中，灭菌处理的方法为将骨粉在75%乙醇浸泡0.5-1.5h。

5.根据权利要求2或3所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤c中，SDS的浓度为0.5~1 % w/v。

6.根据权利要求2或3所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤c中，所述DNase I的浓度为50~100 U/mL；RNase A的浓度为5~10 U/mL。

7.根据权利要求2或3所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤d中，磷酸钙盐选用羟基磷灰石、磷酸三钙和磷酸一氢钙中的一种或多种。

8.根据权利要求2或3所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤e中，骨粉的添加量为溶液体积的0.5-5 %。

9.根据权利要求2或3所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤f中，透析袋的截留分子量为3500~5000Da 。

10.根据权利要求2或3所述的一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤f中，NaOH溶液的浓度为0.01~1 M。