CN107684637B - 一种聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架及其构建方法 - Google Patents

一种聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架及其构建方法。将聚乳酸、羟基磷灰石、脱细胞羊膜分步溶解于二氯乙烷、正己烷中，采用非溶剂致相分离法构建复合支架，为大孔包小孔的复合孔结构。本发明以聚乳酸为基体以保证支架的机械强度和生物降解性；复合羟基磷灰石旨在提高支架骨诱导性和骨传导性的同时，缓解代谢环境的酸化；复合脱细胞羊膜以提高支架的吸水性、生物相容性和识别性，促进细胞在支架上的黏附和增殖。该方法制备的复合支架具有孔隙率高且孔连通好、机械性能强、生物相容性好、成骨诱导活性等优点，且对骨组织工程的重要种子细胞‑成骨细胞表现出良好的生物学性能，可作为一种优良的生物医用材料应用到骨组织工程领域。

Description

一种聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架及其构建方法
技术领域
本发明属于组织工程材料领域，特别涉及一种由聚乳酸、羟基磷灰石、脱细胞羊膜三种材料复合、构建组织工程支架及其构建方法。
背景技术
骨组织工程作为一种新型且高效的骨组织缺损的修复方法，近年来逐渐受到广泛关注。骨组织工程修复策略的关键步骤之一，是制备出无毒、可代谢、生物相容性好、具有骨诱导性、且具有适宜机械强度的组织工程支架。但几乎没有一种单一材料能够同时满足以上所有要求，因此需要将不同种类、不同性质的材料进行复合，协同发挥每一种材料的优点和功能，以满足骨修复和骨重建的需求。
聚乳酸(Polylactic acid，PLA)是一种无毒、可代谢的高分子材料，是生物医学领域中最广泛使用的人工合成聚合物之一，具有机械强度高、可塑性好、细胞相容性高、生物降解性等优点，使其成为制备组织工程支架材料的首选材料，适于大规模生产。羟基磷灰石(Nano-Hydroxyapatite，nHAp)是天然骨的主要成分之一，具有良好的骨传导性和骨诱导性，研究发现其能够促进新骨的发生，并会随着新骨的发生和发育而被吸收利用、能够诱导新骨的发生。基于两种材料的优点，聚乳酸和羟基磷灰石复合支架在组织工程领域已得到充分的认可和广泛的研究。
近年来随着脱细胞技术的发展，将组织/器官进行脱细胞处理而制备的脱细胞外基质材料，因其优越的生物相容性和生物识别性在组织工程领域也备受关注。脱细胞羊膜(Human acellular amniotic membrane，HAAM)是应用较为广泛的脱细胞材料之一，脱细胞羊膜具有双层结构，有胶原纤维交错形成的胶原网络构成了脱细胞羊膜的底部的胶原基质层，在上面附着有大量的弹性蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、纤连蛋白等糖蛋白。脱细胞羊膜有着优越的生物相容性、生物识别性、抗微生物、抗炎、瘢痕抑制、低免疫原性，能够刺激新生组织的形成和伤口愈合，已被广泛应用于口腔、皮肤、胃、喉、头颈等相关组织的修复研究。专利CN102716515 A“一种修复半月板撕裂的生物材料及其制备方法”，该方法制备的生物材料由内层的脱细胞基质膜、中间层的多孔结构胶原基质膜、外层的软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片构成。专利CN106075582 A“中组织工程血管化支架及其构建方法”，以医用级聚乳酸、聚乙交酯、聚氨基酸等合成材料，与脱细胞心包膜、脱细胞真皮、脱细胞羊膜等脱细胞基质复合，制备了一种组织工程血管化支架。但将脱细胞羊膜与聚乳酸、羟基磷灰石相复合用于骨组织工程修复则未见相关报道。
基于上述研究现状，本发明以合成高分子聚乳酸与天然材料羟基磷灰石、脱细胞羊膜进行复合，协同发挥每一种材料的优点与功能，采用非溶剂致相分离法制备复合支架，并将成骨细胞接种于复合支架上构建细胞-支架复合物，对成骨细胞在支架上的分布、黏附、增殖和分化情况进行测试，以验证复合支架的生物相容性，为将来应用于临床修复打下基础。因此构建一种生物相容性高的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架，用于骨组织修复领域具有十分重要的意义。
发明内容
聚乳酸和羟基磷灰石复合支架在组织工程领域已得到充分的认可和广泛的研究，但是目前基于脱细胞羊膜的骨组织工程复合支架还未见报道。针对脱细胞羊膜良好的生物相容性、生物识别性和亲水性，发明一种聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架的构建方法，制备具有良好生物相容性和物化特性的骨组织工程支架，以支持成骨细胞的体外增殖和功能实现，是本发明的主要目的。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架的构建方法，包括以下步骤：
(1)在40～60℃条件下，将聚乳酸PLA溶于二氯甲烷溶液中得到PLA二氯甲烷溶液。其中，PLA浓度为4～8g/100mL。
(2)室温下，将步骤(1)制备得到的PLA二氯甲烷溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢滴加与二氯甲烷等量的正己烷，滴加结束后溶液仍保持澄清，获得澄清的含有PLA的二氯甲烷/正己烷溶液A；滴加过程中若出现析出现象需重新配制PLA二氯甲烷溶液，重新滴加正己烷。
(3)室温下，将一定量的羟基磷灰石nHAp加入到步骤(2)制备得到的PLA的二氯甲烷/正己烷溶液A中，在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，超声波振荡器中进一步超声分散混合至nHAp均匀地分散在溶液中，得到含有PLA/nHAp的二氯甲烷/正己烷溶液B。其中，nHAp浓度为1.0～2.5g/100mL。
(4)室温下，将一定量的脱细胞羊膜HAAM粉末加入到步骤(3)制备得到的PLA/nHAp二氯甲烷/正己烷溶液B中，快速搅拌至HAAM均匀分布，得到含有PLA/nHAp/HAAM的二氯甲烷/正己烷溶液C。其中，HAAM浓度为0.5～4g/100mL。
(5)将步骤(4)制备的PLA/nHAp/HAAM二氯甲烷/正己烷溶液C浇注在玻璃模具中，在-20～-40℃条件下，静置分相20～30h；分相结束后弃掉稀相，打碎模具去除浓相胶体后，将支架预产物置于无水甲醇中20～24h将溶剂萃取干净；最后将萃取后的材料置于真空干燥箱中干燥即得到PLA/nHAp/HAAM复合支架材料，即聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架。
所述的真空干燥温度为40～60℃，真空干燥时间为20～24h。
所述的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架中聚乳酸、羟基磷灰石、脱细胞羊膜三种物质的质量比为1:(0.2～1):(0.2～1.5)。
所述的步骤(4)中脱细胞羊膜采用一种高效、低损伤的制备方法得到，具体包括以下步骤：
(1)提取新鲜羊膜
将新鲜羊膜放置于大培养皿中，用生理盐水反复冲洗直至新鲜羊膜表面无明显血迹，利用手术钳和手术镊找到羊膜与绒毛膜的连接处，将羊膜与绒毛膜钝性剥离，剥离过程中不断地使用生理盐水冲洗，将羊膜夹杂的血块冲洗干净。利用手术剪将已经清洗干净的羊膜剪成规则形状。
(2)对羊膜进行脱细胞处理
优选3mol/L高渗盐水、0.25％胰酶/EDTA溶液分别对羊膜进行脱细胞处理。将磷酸盐缓冲液PBS漂洗过的羊膜浸没在3mol/L的NaCl溶液中，放入气浴恒温振荡培养箱中振荡30min；取出后用PBS溶液漂洗干净，然后加入0.25％胰酶/EDTA消化液在37℃下振荡4h；取出后再用PBS溶液漂洗干净得到脱细胞羊膜。所述的0.25％胰酶/EDTA消化液具体为胰酶/EDTA消化液中胰酶的质量分数为0.25％。所述的脱细胞羊膜的吸水率为2083％，具有良好的生物相容性，能够用于骨组织工程支架的制备。
上述构建方法制备得到的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架为大孔包小孔的复合孔结构，大孔直径为200μm，小孔直径为30μm，孔隙率83.6％～85.3％，接触角37.2°～38.7°，吸水率249.7％～276.3％，弹性模量为7.07～8.36MPa，在第12周降解率达到34.59％～39.48％。
上述方案中聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架的制备方法，所制备的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架，对成骨细胞表现出良好的生物学性能，适用于骨组织工程领域。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点和有益效果：
本发明选用聚乳酸为材料基体，复合羟基磷灰石和脱细胞羊膜制备复合多孔支架，实现材料功能优势互补。首先以聚乳酸为基体以保证支架的机械强度和生物降解性；复合以羟基磷灰石在提高支架的骨诱导性和骨传导性的同时，缓解代谢环境的酸化；复合脱细胞羊膜以提高支架的吸水性、生物相容性和生物识别性，促进细胞在支架上的黏附和增殖。
本发明获得的复合支架具有大孔包小孔的复合孔结构，大孔直径在200μm左右，能够为细胞提供足够的增殖空间并适宜于实体骨组织的生成和发育；小孔直径在30μm左右，小孔的存在能够增强支架的传质能力并为细胞提供更丰富的附着位点。
扫描电镜、孔隙率测试、亲水性实验、接触角测试、降解率测试和细胞相容性实验检测都证明了该复合支架材料能够满足骨组织工程对于支架材料的需求。
附图说明
图1为本发明PC12细胞在脱细胞羊膜上复合培养的荧光染色照片；A.培养第2天；B.培养第4天。
图2为本发明聚乳酸/羟基磷灰石(质量比6:3)复合支架电镜图；(a)PLA/nHAp支架，×100；(b)PLA/nHAp支架，×200。
图3为实施例3的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜(质量比6:3:2)复合支架放大500倍的扫描电镜图。
图4为实施例3的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜(质量比6:3:2)复合支架放大2000倍的扫描电镜图。
图5为成骨细胞在聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜(质量比6:3:2)复合支架上的分布及活性；(a)PLA/nHAp/HAAM支架，Calcein-AM染色；(b)PLA/nHAp/HAAM支架，Hochest染色。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明。
实施例1脱细胞羊膜的制备及生物相容性检测
将新鲜羊膜放置于大培养皿中，用生理盐水反复冲洗直至新鲜羊膜表面无明显血迹，利用手术钳和手术镊找到羊膜与绒毛膜的连接处，将羊膜于绒毛膜钝性剥离，在剥离过程中不断地使用生理盐水冲洗，将羊膜夹杂的血块冲洗干净。利用手术剪将已经清洗干净的羊膜剪成6cm×6cm的正方形。将PBS漂洗过的羊膜浸没在3mol/L的NaCl溶液中，放入气浴恒温振荡培养箱中振荡30min。取出后用PBS溶液漂洗干净，然后加入0.25％胰酶/EDTA消化液在37℃下振荡4h。取出后再用PBS溶液漂洗干净。
对优选方法制备的脱细胞羊膜进行生物相容性检测，通过Calcein-AM荧光染色可以发现，PC12分布均匀，形态正常，细胞间突触相连形成了细胞网络，说明接种在脱细胞羊膜上的PC12保持了良好的增殖活性和形态特征。另外，通过MTT法对细胞活率进行检测，结果发现，细胞在第3天增殖最快，在第4天细胞数目达到顶峰，从定量的角度说明本发明制备的脱细胞羊膜具有良好的生物相容性，能够用于骨组织工程支架的制备。
实施例2聚乳酸/羟基磷灰石复合支架制备(作为对比例)
称量6.0g的聚乳酸(PLA)加入到100mL二氯甲烷中，在50℃水浴中磁力搅拌，直至PLA在二氯甲烷中完全溶解至澄清，获得PLA二氯甲烷溶液；将PLA二氯甲烷溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，用滴液漏斗缓慢滴加与二氯甲烷等量的正己烷，如果出现析出的现象需重新配制PLA溶液，最后以滴加正己烷后溶液仍保持澄清为准，获得PLA二氯甲烷/正己烷溶液；之后向PLA二氯甲烷/正己烷溶液中加入3.0g羟基磷灰石(nHAp)，在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，再在超声波振荡器中进一步混合直至nHAp均匀地分散在溶液中，获得PLA/nHAp的二氯甲烷/正己烷溶液；将制备好的PLA/nHAp的二氯甲烷/正己烷溶液浇注在玻璃模具中，置于-20℃冰箱中静置分相20h。分相结束后弃掉稀相，打碎模具去除浓相胶体，将材料置于无水甲醇中20h将溶剂萃取干净。将萃取后的材料置于真空干燥箱中40℃下干燥24h即得到PLA/nHAp复合支架材料。
实施例3聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架制备
称量6.0g的聚乳酸PLA加入到100mL二氯甲烷中，在50℃水浴中磁力搅拌，直至PLA在二氯甲烷中完全溶解至澄清，获得PLA二氯甲烷溶液。将PLA二氯甲烷溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，用滴液漏斗缓慢滴加与二氯甲烷等量的正己烷，如果出现析出的现象需重新配制PLA溶液，最后以滴加正己烷后溶液仍保持澄清为准，获得PLA二氯甲烷/正己烷溶液；之后向PLA二氯甲烷/正己烷溶液中加入3.0g羟基磷灰石nHAp，在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，再在超声波振荡器中进一步混合直至nHAp均匀地分散在溶液中，获得PLA/nHAp的二氯甲烷/正己烷溶液；向PLA/nHAp的二氯甲烷/正己烷溶液中加入2.0g脱细胞羊膜HAAM粉末，进行快速搅拌，至HAAM均匀分布，获得PLA/nHAp/HAAM的二氯甲烷/正己烷溶液；将制备好的PLA/nHAp/HAAM的二氯甲烷/正己烷溶液浇注在玻璃模具中，置于-30℃冰箱中静置分相24h。分相结束后弃掉稀相，打碎模具去除浓相胶体，将材料置于无水甲醇中20h将溶剂萃取干净。将萃取后的材料置于真空干燥箱中50℃下干燥22h即得到PLA/nHAp/HAAM复合支架材料。
上述构建方法制备得到的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架为大孔包小孔的复合孔结构，大孔直径为200μm，小孔直径为30μm，孔隙率83.6％，接触角38.7°，吸水率249.7％，弹性模量为7.07MPa。
实施例4聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架制备
称量8.0g的聚乳酸PLA加入到100mL二氯甲烷中，在60℃水浴中磁力搅拌，直至PLA在二氯甲烷中完全溶解至澄清，获得PLA二氯甲烷溶液；将PLA二氯甲烷溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，用滴液漏斗缓慢滴加与二氯甲烷等量的正己烷，如果出现析出的现象需重新配制PLA溶液，最后以滴加正己烷后溶液仍保持澄清为准，获得PLA二氯甲烷/正己烷溶液；之后向PLA二氯甲烷/正己烷溶液中加入2.0g羟基磷灰石nHAp，在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，再在超声波振荡器中进一步混合直至nHAp均匀地分散在溶液中，获得PLA/nHAp的二氯甲烷/正己烷溶液；向PLA/nHAp的二氯甲烷/正己烷溶液中加入4.0g脱细胞羊膜HAAM粉末，进行快速搅拌，至HAAM均匀分布，获得PLA/nHAp/HAAM的二氯甲烷/正己烷溶液；将制备好的PLA/nHAp/HAAM的二氯甲烷/正己烷溶液浇注在玻璃模具中，置于-40℃冰箱中静置分相30h。分相结束后弃掉稀相，打碎模具去除浓相胶体，将材料置于无水甲醇中24h将溶剂萃取干净。将萃取后的材料置于真空干燥箱中60℃下干燥20h即得到PLA/nHAp/HAAM复合支架材料。
上述构建方法制备得到的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架为大孔包小孔的复合孔结构，大孔直径为200μm，小孔直径为30μm，孔隙率84.3％，接触角37.2°，吸水率256.1％，弹性模量为7.17MPa。
实施例5聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架制备
称量4.0g的聚乳酸PLA加入到100mL二氯甲烷中，在40℃水浴中磁力搅拌，直至PLA在二氯甲烷中完全溶解至澄清，获得PLA二氯甲烷溶液；将PLA二氯甲烷溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，用滴液漏斗缓慢滴加与二氯甲烷等量的正己烷，如果出现析出的现象需重新配制PLA溶液，最后以滴加正己烷后溶液仍保持澄清为准，获得PLA二氯甲烷/正己烷溶液；之后向PLA二氯甲烷/正己烷溶液中加入3.0g羟基磷灰石nHAp，在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，再在超声波振荡器中进一步混合直至nHAp均匀地分散在溶液中，获得PLA/nHAp的二氯甲烷/正己烷溶液；向PLA/nHAp的二氯甲烷/正己烷溶液中加入3.0g脱细胞羊膜HAAM粉末，进行快速搅拌，至HAAM均匀分布，获得PLA/nHAp/HAAM的二氯甲烷/正己烷溶液；将制备好的PLA/nHAp/HAAM的二氯甲烷/正己烷溶液浇注在玻璃模具中，置于-30℃冰箱中静置分相24h。分相结束后弃掉稀相，打碎模具去除浓相胶体，将材料置于无水甲醇中20h将溶剂萃取干净。将萃取后的材料置于真空干燥箱中40℃下干燥24h即得到PLA/nHAp/HAAM复合支架材料。
上述构建方法制备得到的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架为大孔包小孔的复合孔结构，大孔直径为200μm，小孔直径为30μm，孔隙率85.1％，接触角37.7°，吸水率252.3％，弹性模量为7.29MPa。
实施例6聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架制备
称量6.0g的聚乳酸PLA加入到100mL二氯甲烷中，在60℃水浴中磁力搅拌，直至PLA在二氯甲烷中完全溶解至澄清，获得PLA二氯甲烷溶液；将PLA二氯甲烷溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，用滴液漏斗缓慢滴加与二氯甲烷等量的正己烷，如果出现析出的现象需重新配制PLA溶液，最后以滴加正己烷后溶液仍保持澄清为准，获得PLA二氯甲烷/正己烷溶液；之后向PLA二氯甲烷/正己烷溶液中加入4.0g羟基磷灰石nHAp，在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，再在超声波振荡器中进一步混合直至nHAp均匀地分散在溶液中，获得PLA/nHAp的二氯甲烷/正己烷溶液；向PLA/nHAp的二氯甲烷/正己烷溶液中加入8.0g脱细胞羊膜HAAM粉末，进行快速搅拌，至HAAM均匀分布，获得PLA/nHAp/HAAM的二氯甲烷/正己烷溶液；将制备好的PLA/nHAp/HAAM的二氯甲烷/正己烷溶液浇注在玻璃模具中，置于-40℃冰箱中静置分相30h。分相结束后弃掉稀相，打碎模具去除浓相胶体，将材料置于无水甲醇中24h将溶剂萃取干净。将萃取后的材料置于真空干燥箱中60℃下干燥20h即得到PLA/nHAp/HAAM复合支架材料。
上述构建方法制备得到的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架为大孔包小孔的复合孔结构，大孔直径为200μm，小孔直径为30μm，孔隙率84.6％，接触角38.1°，吸水率271.3％，弹性模量为8.36MPa。
实施例7聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架制备
称量6.0g的聚乳酸PLA加入到100mL二氯甲烷中，在50℃水浴中磁力搅拌，直至PLA在二氯甲烷中完全溶解至澄清，获得PLA二氯甲烷溶液；将PLA二氯甲烷溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，用滴液漏斗缓慢滴加与二氯甲烷等量的正己烷，如果出现析出的现象需重新配制PLA溶液，最后以滴加正己烷后溶液仍保持澄清为准，获得PLA二氯甲烷/正己烷溶液；之后向PLA二氯甲烷/正己烷溶液中加入2.0g羟基磷灰石nHAp，在磁力搅拌器上快速搅拌进行预混，再在超声波振荡器中进一步混合直至nHAp均匀地分散在溶液中，获得PLA/nHAp的二氯甲烷/正己烷溶液；向PLA/nHAp的二氯甲烷/正己烷溶液中加入2.0g脱细胞羊膜HAAM粉末，进行快速搅拌，至HAAM均匀分布，获得PLA/nHAp/HAAM的二氯甲烷/正己烷溶液；将制备好的PLA/nHAp/HAAM的二氯甲烷/正己烷溶液浇注在玻璃模具中，置于-30℃冰箱中静置分相24h。分相结束后弃掉稀相，打碎模具去除浓相胶体，将材料置于无水甲醇中2 0h将溶剂萃取干净。将萃取后的材料置于真空干燥箱中50℃下干燥24h即得到PLA/nHAp/HAAM复合支架材料。
上述构建方法制备得到的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架为大孔包小孔的复合孔结构，大孔直径为200μm，小孔直径为30μm，孔隙率84.7％，接触角37.9°，吸水率256.3，弹性模量为7.87MPa。
实施例3的复合支架PLA/nHAp/HAAM(质量比6:3:2)性能测试
(1)支架形貌电镜观察
用薄刀片将支架材料切成1mm×1mm的薄片，用导电胶固定在载物台上，用氮气吹扫样品表面，吹去表面杂质，真空喷金，置于钨丝灯扫描电子显微镜下观察支架形貌。
结果表明，PLA/nHAp支架具有通透的孔结构，孔径在200μm左右，为成骨细胞的黏附、增殖和向骨分化提供了充足的空间，适宜于实体骨组织的生长。放大观察后发现，在大孔的孔壁上有直径在30μm左右的微孔结构，这些微孔结构能够提高支架材料的传质性能，利于营养物质和代谢废物的传递，为细胞提供平衡的生长环境。复合HAAM之后的PLA/nHAp/HAAM支架，微孔结构仍然存在，并可以观察到在孔壁的边缘出现大量外伸的纤维状边缘，这说明HAAM已经成功的掺杂到了支架当中。这种参差不齐的纤维状外伸能够进一步增加支架表面的附着位点，HAAM优越的吸水性也能够提高支架负载营养物质的能力，为细胞的增殖分化提供营养储备。
(2)支架孔隙率测试
将支架用薄刀片切成边长为0.5cm的均匀立方体，将其浸入体积为V1的无水乙醇中，利用超声震荡除去支架中的气泡，使材料完全被无水乙醇浸润，这时支架和无水乙醇的总体积记为V2。将支架从无水乙醇中移除，剩余无水乙醇的体积记为V3。由此可求得，支架干体积为(V2-V1)，支架孔隙中所含无水乙醇的体积，即孔体积，为(V1-V3)，支架的表观体积为(V2-V1)+(V1-V3)＝V2-V3。支架的孔隙率可用如下公式计算。
结果表明，PLA/nHAp支架的孔隙率为85.3％；加入HAAM之后，HAAM的片状结构会对支架的孔结构产生一定的遮挡和堵塞，从而降低PLA/nHAp/HAAM支架的孔隙率至83.6％，但是从统计学上来看这种降低并没有显著性。
(3)支架吸水率测试
将支架材料在干燥条件下称重，记为m1，置于24孔板中，向孔中注入二次蒸馏水，用移液枪缓慢吹打直至支架沉于底部，也可以将支架置于真空干燥箱中抽取气泡使其下沉。在37℃环境中浸泡一段时间，用样品夹轻轻夹取支架，注意不要用力以避免支架中水分流失，用吸水纸擦去支架外表面水分，电子天平称重，记为m2。材料的吸水率可通过如下公式计算而得
结果表明，PLA/nHAp支架的吸水率为118.5％；加入HAAM之后，PLA/nHAp/HAAM支架的吸水率有了很大的提高，高达249.7％。HAAM的主要成分是胶原、层粘连蛋白等蛋白质，有很强的吸水性，使得纯HAAM的吸水率高达20.83倍，因此支架中加入HAAM会极大地提高支架的吸水率。
(4)支架接触角测试
通过测量支架与水的接触角来表征其亲水性能。为了避免多孔支架中孔道的毛细作用对接触角的影响，用薄刀片将支架切成薄片，并进一步进行压片处理制成复合薄片再进行接触角的测量。将支架置于测量仪针头正下方，调整升降台高度使针头出现在视野中央而支架在视野下部三分之一处，调整焦距使图像清晰。设置水滴体积为6μL，使液滴缓慢滴出至支架中央，快速进行图像捕捉，并利用图像分析软件得出接触角。
结果表明，PLA/nHAp接触角为75.67°；加入的HAAM之后，PLA/nHAp/HAAM(质量比6:3:2)接触角降低至38.7°；但进一步加入HAAM之后，发现PLA/nHAp/HAAM支架(质量比6:3:8)接触角的变化不大。说明虽然HAAM能够改善材料的亲水性，但是根据扫描电镜的观察发现HAAM与PLA基体是高度嵌合的，HAAM吸水膨胀会受到PLA骨架的限制，所以进一步添加HAAM并不会在很大程度上提升材料的亲水性。
(5)支架弹性模量测试
利用万能实验机分别测支架的弹性模量与强度，样品规格为支架上下截面要尽量平整，以避免表面凸起造成的压强异常。根据其结果绘制支架的负荷位移图，支架材料的位移控制加载速度为1mm/min。根据所获得的数据计算复合支架的弹性模量，公式如下。式中，L1、L2为线性段开始前后的压力负载，S、h分别代表材料的截面积和高，D1、D2代表材料位移。
结果表明，PLA/nHAp支架的弹性模量为10.27MPa，PLA/nHAp/HAAM支架的弹性模量为7.07MPa。HAAM的加入使得支架的机械强度有所降低。nHAp是天然骨的主要成分之一，且为纳米尺度能够在支架中均匀分散，对PLA支架起到了加固的作用。但HAAM加入之后嵌在PLA支架结构中，这在一定程度上影响了支架原有的应力状态，使支架的机械强度有所下降。
(6)支架降解性能测试
本发明使用模拟体液，在37℃恒温培养箱中进行支架的体外降解实验，并对复合支架的质量降解率进行分析。取干净的烧杯，按表1中的配方将各种药品加入烧杯中，加入400mL的三次蒸馏水，充分搅拌直至完全溶解，得溶液A。称取6.1188g三羟甲基氨基甲烷(Tris)于锥形瓶中，再加入适量的1mol/L盐酸，磁力搅拌直至完全溶解，将Tris的盐酸溶液倒入溶液A中。加入400mL溶解有0.292g的CaCl2的溶液，搅拌均匀。用1mol/L的盐酸将上述混合溶液的pH调节到7.4左右。加入三次蒸馏水，容量瓶中定容至1000mL。将复合支架置于24孔板中，加入模拟体液，使模拟体液将复合支架完全浸泡。将装有复合支架的24孔板置于37℃恒温培养箱中进行培养。
表1模拟体液配方
将复合支架浸泡在模拟体液24h后，擦去表面液体，再进行称重，记为m0。在之后的2、4、6、8、10、12周取出支架，称重，记为mt。则复合支架的质量降解率Dt可用以下公式计算得到。
结果表明，PLA/nHAp支架的降解率为30.59％，PLA/nHAp/HAAM支架降解速率最快，在第12周降解率达到39.48％。在加入HAAM之后降解速率有较大提升，HAAM具有较好的吸水性，嵌入孔壁的HAAM在降解过程中充分吸水从而促进了水分与PLA的接触。另外，支架中复合的HAAM呈片状结构，且在降解的过程中会掉落，这有利于PLA的细化与分散从而加快了降解的进程。
实施例3的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架细胞相容性检测
本发明从出生24h的SD大鼠新生鼠颅盖骨中提取原代成骨细胞，其生长状态良好，呈多边形和长梭形，细胞之间存在突触相连，且具有良好的体外成骨能力和矿化能力。
成骨细胞-支架复合物的体外构建：将复合支架切成0.5cm2，厚度为2mm的薄片，放入离心管中用75％乙醇浸泡12h，浸泡结束后将支架在超净工作台中转移至干净无菌的96孔板中，再用含有1％双抗的PBS浸泡24h，抽去PBS后紫外线照射12h，风干支架，加入少量培养基浸泡支架1h，确保支架沉底，抽去培养基后风干支架，准备接种。消化成骨细胞制成细胞悬液，利用血球计数板调节细胞密度为106cells/mL，向支架上均匀滴加100μL细胞悬液，将96孔板置于培养箱(37℃，5％CO2)中培养，定期置于显微镜下观察，视细胞生长情况决定是否换液。
对细胞-支架进行扫描电镜观察发现，成骨细胞在支架上贴壁良好，且观察到细胞间存在细胞突触的连接。经过Hochest染色和Calcein-AM染色发现，细胞在复合支架上分布均匀，细胞大量存活且具有良好的活性，其中细胞在PLA/nHAp/HAAM支架上的活性要高于PLA/nHAp支架。
对细胞支架复合物进行MTT检测之后发现，细胞在各组支架上均能保持较好的增殖活性。另外ALP定量检测发现，在3周内成骨细胞在各组支架上分泌的ALP持续增加，且HAAM和nHAp的加入均能够明显促进ALP的分泌，说明复合支架中HAAM和nHAp的加入能够促进成骨细胞的分化，增强分泌能力。
对各组支架测定4h细胞黏附率后发现，HAAM的黏附率为92.33％，高于PLA/nHAp支架，证明了HAAM良好的细胞黏附能力；PLA/nHAp支架和PLA/nHAp/HAAM支架的黏附率分别为56.34％和83.67％，说明nHAp和HAAM的加入能够促进成骨细胞在支架上的快速黏附。成骨细胞在PLA/nHAp/HAAM支架上的增殖率和4h黏附率均高于PLA/nHAp支架，说明HAAM的加入能够促进细胞的增殖和快速黏附。

Claims (9)

1.一种聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架的构建方法，其特征在于以下步骤：
(1)在40～60℃条件下，将聚乳酸PLA溶于二氯甲烷溶液中得到PLA二氯甲烷溶液；
(2)室温下，将步骤(1)制备得到的PLA二氯甲烷溶液在搅拌过程中缓慢滴加与二氯甲烷等量的正己烷，滴加结束后溶液仍保持澄清，得到含有PLA的二氯甲烷/正己烷溶液A；滴加过程中若出现析出现象需重新配制PLA二氯甲烷溶液，重新滴加正己烷；
(3)室温下，将羟基磷灰石nHAp加入到步骤(2)得到的二氯甲烷/正己烷溶液A中，搅拌进行预混、超声分散混合至nHAp均匀地分散在溶液中，得到含有PLA/nHAp的二氯甲烷/正己烷溶液B；
(4)室温下，将脱细胞羊膜HAAM粉末加入到步骤(3)得到的二氯甲烷/正己烷溶液B中，搅拌至HAAM均匀分布，得到含有PLA/nHAp/HAAM的二氯甲烷/正己烷溶液C，其中，HAAM浓度为0.5～4g/100mL；
(5)将步骤(4)制备的二氯甲烷/正己烷溶液C浇注在玻璃模具中，在-20～-40℃条件下，静置分相20～30h；分相结束后弃掉稀相，打碎模具去除浓相胶体后，将支架预产物置于无水甲醇中20～24h将溶剂萃取干净；最后将萃取后的材料真空干燥后得到PLA/nHAp/HAAM复合支架材料，即聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架。
2.根据权利要求1所述的一种聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架的构建方法，其特征在于所述的步骤(4)中脱细胞羊膜的制备方法包括以下步骤：
(1)提取新鲜羊膜
将新鲜羊膜放置于培养皿中，用生理盐水反复冲洗至新鲜羊膜表面无明显血迹，将羊膜与绒毛膜剥离，剥离过程中不断用生理盐水冲洗，最后将清洗干净的羊膜剪成规则形状，待用；
(2)对羊膜进行脱细胞处理
将磷酸盐缓冲液PBS漂洗过的羊膜浸没在高渗盐水中，放入气浴恒温振荡培养箱中振荡30min；取出后用PBS溶液漂洗干净，加入0.25％胰酶/EDTA消化液在37℃下振荡4h；取出后再用PBS溶液漂洗干净得到脱细胞羊膜；
所述的胰酶/EDTA消化液中胰酶的质量分数为0.25％；所述的高渗盐水的浓度为3mol/L。
3.根据权利要求1或2所述的一种聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架的构建方法，其特征在于，所述的步骤(1)PLA二氯甲烷溶液中PLA浓度为4～8g/100mL。
4.根据权利要求1或2所述的一种聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架的构建方法，其特征在于，所述的步骤(3)二氯甲烷/正己烷溶液B中nHAp浓度为1.0～2.5g/100mL。
5.根据权利要求3所述的一种聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架的构建方法，其特征在于，所述的步骤(3)二氯甲烷/正己烷溶液B中nHAp浓度为1.0～2.5g/100mL。
6.根据权利要求1或2或5所述的一种聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架的构建方法，其特征在于，所述的步骤(5)中的真空干燥温度为40～60℃，真空干燥时间为20～24h。
7.根据权利要求3所述的一种聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架的构建方法，其特征在于，所述的步骤(5)中的真空干燥温度为40～60℃，真空干燥时间为20～24h。
8.根据权利要求4所述的一种聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架的构建方法，其特征在于，所述的步骤(5)中的真空干燥温度为40～60℃，真空干燥时间为20～24h。
9.采用权利要求1至8任一所述的构建方法得到的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架，其特征在于，所述的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架对成骨细胞具有良好的生物学性能，适用于骨组织工程领域，为大孔包小孔的复合孔结构，大孔直径为200μm，小孔直径为30μm，孔隙率83.6％～85.3％，接触角37.2°～38.7°，吸水率249.7％～276.3％，弹性模量为7.07～8.36MPa，在第12周降解率达到34.59％～39.48％；
所述的聚乳酸/羟基磷灰石/脱细胞羊膜复合支架中聚乳酸、羟基磷灰石、脱细胞羊膜三种物质的质量比为1:0.2～1:0.2～1.5。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111905146B (zh) * 2020-08-01 2021-11-16 北京欧亚铂瑞科技有限公司 一种保留天然羟基磷灰石的脱细胞骨基质水凝胶及其制备方法
CN114525630A (zh) * 2022-02-28 2022-05-24 中国人民解放军东部战区总医院 一种复合纤维支架及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105797217A (zh) * 2016-03-15 2016-07-27 深圳市汉强医用材料有限公司 一种多孔微球骨修复材料及其制备方法
CN106075582A (zh) * 2016-06-27 2016-11-09 暨南大学 一种组织工程血管化支架及其构建方法
CN106693066A (zh) * 2017-02-22 2017-05-24 福州市大福瑞生物科技有限公司 一种胶原‑羟基磷灰石人工骨的制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9005286B2 (en) * 2012-02-21 2015-04-14 Thierry Giorno PLGA/HA hydroxyapatite composite bone grafts and method of making

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105797217A (zh) * 2016-03-15 2016-07-27 深圳市汉强医用材料有限公司 一种多孔微球骨修复材料及其制备方法
CN106075582A (zh) * 2016-06-27 2016-11-09 暨南大学 一种组织工程血管化支架及其构建方法
CN106693066A (zh) * 2017-02-22 2017-05-24 福州市大福瑞生物科技有限公司 一种胶原‑羟基磷灰石人工骨的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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二级三维多孔天然胶原—羟基磷灰石骨组织工程复合支架材料的体外构建及其生物性能研究;赵洪石;《山东大学博士学位论文》;20111215;全文

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