CN115581806B - 一种可促进牙周组织再生的3d打印生物支架及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种可促进牙周组织再生的3D打印生物支架及其制备方法与应用。所述生物支架为贯通多孔结构，由生物墨水材料经3D打印后通过光交联固化而成；所述生物墨水材料的组分包括光引发剂、生物活性玻璃、甲基丙烯酰化明胶。本发明通过计算机拓扑设计确定支架结构，使用生物活性玻璃颗粒与生物胶原材料制备打印墨水，利用3D打印技术制备生物支架，制备过程简便、快速，生物支架内部孔隙均匀，利于细胞定植，生物胶原材料使得支架生物相容性可靠，而生物活性玻璃颗粒的添加强化了支架的物理性能，不同的材料梯度改变能够满足“牙骨质‑牙周膜‑牙槽骨“一体化再生的要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，特别是一种可促进牙周组织再生的3D打印生物支架及其制备方法与应用。
背景技术
牙周组织再生工程是将支架材料与种子细胞相结合的工程技术，近年来诸多研究尝试使用复合的支架材料、改变支架的孔隙和结构或是加入生长因子等方式来取得更近似天然牙周的再生牙周组织，但产生的牙周组织在纤维排列方向、组织架构与功能行使等诸多方面与天然牙周组织相比仍存在差异。据研究发现，不同孔隙结构、不同材料的仿生支架，其力学性能、降解性能以及诱导牙周组织生长的效能均不同，因此对仿生支架来说，制造工艺以及材料的选择尤为重要。
在支架加工制造方面，新技术有静电纺丝技术、冷冻铸造技术等。静电纺丝技术可制备纳米级直径的纤维细丝，纤维间相互交错、支架表面积大大提高，利用静电纺丝技术制备出的支架有良好的定向细胞生长引导功能，适合种子细胞的生长。但是其在如何调控材料的孔隙大小并制成可使细胞在材料内部更好生长分化的三维支架方面，还需要进一步研究。冷冻铸造法可制备孔隙形状不同、孔隙率可控的多孔支架，具有高强度、低弹性模量的性能，但是其制备支架的结构不可控。
3D打印作为一种新兴的材料制造技术，在医学再生领域已多有应用，如打印人体骨组织、心脏等。相比较以上提及的支架制造技术，3D打印既能控制支架形状，也能精细调整不同的孔隙大小和结构。通过计算机拓扑结构设计和加入相应的生物材料，3D打印制造出个性化且精细的仿生支架能满足牙周组织再生多样化的需求。3D打印出的结构复杂的多相支架能诱导牙周组织“牙骨质-牙周膜-牙槽骨”复合结构再生，满足其不同软硬组织所需的再生条件，在牙周软硬组织再生应用方面有广阔前景。
在材料应用方面，目前常用的支架材料可以分为三类，分别是天然材料、人工合成材料和复合材料。天然材料如壳聚糖、胶原等，是动植物体内自然存在的材料，故具有良好的生物相容性和可降解性，其缺点是机械强度较低。而人工合成材料如碳酸钙陶瓷、磷酸三钙等的优点是可在体内降解代谢，生物相容性和化学稳定性好，具有骨诱导和骨传导性，骨组织的良好替代材料，缺点是体内降解慢、脆性高、延展性差等。
因此，现有材料和技术还有待于改进和发展。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可促进牙周组织再生的3D打印生物支架及其制备方法与应用。
为达到此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一方面提供一种可促进牙周组织再生的3D打印生物支架，具体技术方案如下：
一种可促进牙周组织再生的3D打印生物支架，所述生物支架为贯通多孔结构，由生物墨水材料经3D打印后通过光交联固化而成；所述生物墨水材料的组分包括光引发剂、生物活性玻璃、甲基丙烯酰化明胶。
在本发明的一些实施方式中，所述生物支架为三维多层结构，每层由呈直角S型排列的纤维丝构成，相邻两层间的纤维丝构成纵横交错的网格矩阵。
在本发明的一些实施方式中，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂。
在本发明的一些实施方式中，所述生物活性玻璃为纳米生物活性玻璃颗粒。
在本发明的一些实施方式中，所述生物活性玻璃与甲基丙烯酰化明胶的质量配比为 1:5～200。
在本发明的一些实施方式中，所述光引发剂与甲基丙烯酰化明胶的质量配比为1:20～60。
本发明的第二方面提供一种可促进牙周组织再生的3D打印生物支架的制备方法，包括以下步骤：
第一步、根据人正常牙周组织生物学结构，设计并建立生物支架三维模型并保存；
第二步、向光引发剂溶液中加入生物活性玻璃，混合均匀后，再加入甲基丙烯酰化明胶，水浴至混合均匀，得到3D打印生物墨水材料；
第三步、将第一步得到的生物支架三维模型导入3D打印机的控制系统，采用第二步得到的3D打印生物墨水材料进行3D打印，紫外光交联固化，即得可促进牙周组织再生的3D 打印生物支架。
本发明提供的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架的制备方法，第一步中设计并建立生物支架三维模型包括设定生物支架的孔隙率、线径、形状以及表面积。
本发明提供的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架的制备方法，第一步中生物支架三维模型保存为stl或stp格式。
本发明提供的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架的制备方法，第三步3D打印机料仓温度设置为20～25℃，喷头移动速度为5～15mm/s，挤出压力为0.3～0.6MPa，打印平台温度为10～20℃。
本发明提供的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架的制备方法，第三步中紫外光波长405nm，光照强度为200～300mw/cm2，照射时间为40～60s。
本发明提供的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架的制备方法，第二步中根据人牙周组织不同细胞的生长需求，调节所述生物活性玻璃与甲基丙烯酰化明胶的质量配比，得到一系列不同组分配比的3D打印生物墨水材料。
本发明的第三方面提供一种上述可促进牙周组织再生的3D打印生物支架或上述制备方法制备得到的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架在促进牙周组织再生方面的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、本发明提供可促进牙周组织再生的3D打印生物支架为贯通多孔结构，由经3D打印形成的纤维丝以直角S型排列，内部孔隙均匀，利于细胞定植，采用生物胶原材料使得支架生物相容性可靠，而纳米生物活性玻璃颗粒的添加能增加支架的强度和力学性能，满足牙周组织再生的需求，解决现有制备技术不足、生物材料单一而不利于牙周软硬组织一体化再生的问题。
2、本发明提供的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架，基于3D打印技术，通过计算机拓扑设计确定支架结构，能快速简便制备，能够从组成、结构和力学性能上实现牙周软硬组织的高度仿生，可以根据材料梯度改变满足“牙骨质-牙周膜-牙槽骨“一体化再生的要求。
附图说明
图1为本发明可促进牙周组织再生的3D打印生物支架的制备方法的流程图。
图2为本发明可促进牙周组织再生的3D打印生物支架的三维模型图。
图3为实施例1～实施例3及对比例1制得的生物支架的实物图，a1、a2分别为对比例1 制得的生物支架的正面和侧面图；b1、b2分别为实施例3制得的生物支架的正面和侧面图；c1、c2分别为实施例2制得的生物支架的正面和侧面图；d1、d2分别为实施例1制得的生物支架的正面和侧面图。
图4为实施例1～实施例3及对比例1制得的生物支架的扫描电镜图，a1、a2、a3分别为对比例1制得的生物支架在30x，75x，300x下的扫描电镜图；b1、b2、b3分别为实施例3制得的生物支架在30x，75x，300x下的扫描电镜图；c1、c2、c3分别为实施例2制得的生物支架在30x，75x，300x下的扫描电镜图；d1、d2、d3为实施例1制得的生物支架在30x，75x， 300x下的扫描电镜图。
图5为实施例1～实施例3及对比例1制得的生物支架的孔隙分析结果，a1、a2、a3分别为对比例1制得的生物支架的孔隙分析结果；b1、b2、b3分别为实施例3制得的生物支架的孔隙分析结果；c1、c2、c3分别为实施例2制得的生物支架的孔隙分析结果；d1、d2、d3为实施例1制得的生物支架的孔隙分析结果，图中比例尺为1mm。
图6为实施例1制得的生物支架的X射线光谱分析结果，a1、a2、a3、a4分别为实施例1制得的生物支架200x，1.0kx，10.0kx，100kx；b1为a3中左边方形框中的成分分析图；b2为 a3中右侧方形框中的成分分析图。
图7为实施例1～实施例3及对比例1制得的生物支架的机械性能测试结果(0：对比例1； 0.1％：实施例3；0.5％：实施例2；1％：实施例1)，A为实施例1～实施例3及对比例1制得的生物支架的应力应变曲线；B为实施例1～实施例3及对比例1制得的生物支架形变90％处的压缩强度；C为实施例1～实施例3及对比例1制得的生物支架的弹性模量；D为纳米生物活性玻璃的扫描电镜图，图中比例尺为20nm。
图8为实施例1～实施例3及对比例1制得的生物支架的降解性能测试，A为体外降解行为测试，各组支架在不同天数时的降解率曲线(0：对比例1；0.1％：实施例3；0.5％：实施例2；1％：实施例1)；B为将各组支架在37℃下浸泡于PBS缓冲液中各组支架在1天和7 天时降解液中的钙离子浓度；C为将各组支架在37℃下浸泡于PBS缓冲液中各组支架在1 天和7天时降解液中的硅离子浓度；D将各组支架在37℃下浸泡于PBS缓冲液中各组支架在1天和7天时降解液中的磷离子浓度。
图9为人牙周膜细胞接种于生物支架上培养3天后，细胞活力测定结果(注：BLK：平板组)。
图10为将人牙周膜干细胞培养在生物支架上24小时，电镜下观察3D打印生物支架上的细胞生长状态，A、B、C、D为30x，a1、b1、c1、d1为75x，a2、b2、c2、d2为500x下生物支架外表面上的细胞生长形态，a3、b3、c3、d3为支架孔内细胞生长形态；a4-5、b4-5、c4-5、 d4-5为5000倍下方形框中细胞放大图，其中A以及a1-a5为对比例1制得的生物支架；B以及 b1-b5为实施例3制得的生物支架；C以及c1-c5为实施例2制得的生物支架；D以及d1-d5为实施例1制得的生物支架。
图11为生物支架上的人牙周膜细胞的成骨、成牙骨质分化，A为人牙周膜细胞接种在生物支架上7天、14天和21天时的碱性磷酸酶染色以及茜素红S钙结节染色；B为人牙周膜细胞接种在生物支架上7天后，提取RNA进行成骨和成牙骨质相关基因的PCR测定，N＝3， **p＜0.01,*p＜0.05。
图12为不同BG浓度生物支架使用ImageJ对染色后图片进行灰度值分析的结果。
具体实施方式
下面详细说明本发明可促进牙周组织再生的3D打印生物支架及其制备方法与应用。
本发明的第一方面提供一种可促进牙周组织再生的3D打印生物支架，所述生物支架为贯通多孔结构(如图2所示)，由生物墨水材料经3D打印后通过光交联固化而成；所述生物墨水材料的组分包括光引发剂、生物活性玻璃、甲基丙烯酰化明胶。本发明所述生物支架为贯通多孔结构，不仅为细胞粘附提供表面和空间，而且还能减少细胞生长所需的氧气及营养物质输送障碍。
在本发明的一些优选实施例中，所述生物支架为三维多层结构，每层由呈直角S型排列的纤维丝构成，相邻两层间的纤维丝构成纵横交错的网格矩阵。其中，纵向纤维丝与横向纤维丝构成交叉点，所述交叉点为直接十字交叉点(如图2所示)或星形十字交叉点。实际应用时，可根据人牙周组织的缺损情况及再生需要，设计生物支架的层数，每层所用的生物墨水材料的组分配比可根据牙周软硬组织再生需求调配。
在本发明的一些优选实施例中，所述纤维丝直径为300～600μm，纤维丝间距为1.0～2.0 mm，通过控制纤维丝直径与间距达到调节生物支架孔径的作用，而生物支架孔径可以调节细胞生物学行为，包括成骨、成软骨以及血管化。本发明生物支架引入大孔结构，不仅为细胞粘附提供了表面和空间，而且促进细胞的粘附、扩散、增殖，增加细胞间的接触，高孔隙率的互连多孔结构也有利于氧气及营养物质输送，促进细胞的成骨化和血管化。
在本发明的一些优选实施例中，所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂。苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)，是一种新型的水性紫外光引发剂，用于引发不饱和预聚体系的水性UV聚合反应，特别适用于水性的丙烯酸酯和不饱和聚酯类树脂。本发明中选用LAP光引发剂，固化时间较短，制备效率高。
生物活性玻璃(BG)是一类能对机体组织进行修复、替代与再生、具有能使组织和材料之间形成键合作用的材料，常用于人工骨、人工关节、人工种植牙的可降解材料。本发明选用生物活性玻璃作为支架组分，不仅生物相容性好，而且能增加支架的强度和力学性能，诱导骨再生，能够满足牙周硬组织再生的需求。本发明中，所述生物活性玻璃优选为纳米生物活性玻璃颗粒。更优选地，所述纳米生物活性玻璃颗粒的直径为85.97±7.60nm，比表面积、孔容积和介孔大小分别为134.84m2/g，0.51cm3/g，9.10nm。
胶原是细胞外基质的组成部分，具有安全性高、能促进组织愈合等优点。甲基丙烯酰化明胶(GelMA)是一种光敏性的生物材料，配合光引发剂使用时能在蓝光或紫外光下迅速交联固化，形成具有一定强度的三维结构，结构上具有细胞黏附位点及基质金属蛋白酶水解位点，可良好支持细胞的增殖及迁移，可负载肿瘤细胞、心肌细胞、软骨细胞等多种细胞。本发明选用甲基丙烯酰化明胶作为生物支架的主要组分，能够赋予生物支架优良的生物效能。
在本发明的一些优选实施例中，所述生物活性玻璃与甲基丙烯酰化明胶的质量配比为 1:10～200。在本发明的一些更优选实施例中，所述生物活性玻璃与甲基丙烯酰化明胶的质量配比为1:10，此配比制得的生物支架形态结构稳定，机械性能优异，能够快速降解并释放硅离子，促进细胞成骨分化。
在本发明的一些优选实施例中，所述光引发剂与甲基丙烯酰化明胶的质量配比为1:20～60。在本发明的一些更优选实施例中，所述光引发剂与甲基丙烯酰化明胶的质量配比为1:40。
本发明第二方面提供一种可促进牙周组织再生的3D打印生物支架的制备方法，如图1 所示，包括以下步骤：
第一步、根据人正常牙周组织生物学结构，设计并建立生物支架三维模型并保存；
第二步、向光引发剂溶液中加入生物活性玻璃，混合均匀后，再加入甲基丙烯酰化明胶，水浴至混合均匀，得到3D打印生物墨水材料；
第三步、将第一步得到的生物支架三维模型导入3D打印机的控制系统，采用第二步得到的3D打印生物墨水材料进行3D打印，紫外光交联固化，即得可促进牙周组织再生的3D 打印生物支架。
本发明提供的制备方法中所述设计具体为通过计算机拓扑设计确定生物支架的结构，使得模型的整体和细节更加精确，能够更好地反映人正常牙周组织的生物学结构特征。
在本发明的一些优选实施例中，第一步中设计并建立生物支架三维模型包括设定生物支架的孔隙率、线径、形状以及表面积等。
在本发明的一些优选实施例中，第一步中生物支架三维模型保存为stl或stp格式。
在本发明的一些优选实施例中，第二步中根据人牙周组织不同细胞的生长需求，调节所述纳米生物活性玻璃与甲基丙烯酰化明胶的质量配比，得到一系列不同组分配比的3D打印生物墨水材料。
在本发明的一些优选实施例中，第二步中所述光引发剂溶液的制备方法为：将苯基-2,4,6- 三甲基苯甲酰基亚磷酸锂光引发剂粉末加入PBS中，55～65℃水浴20～40min，待其充分溶解后抽滤灭菌，得到光引发剂溶液。在本发明的一些更优实施例中，60℃水浴30min。
在本发明的一些优选实施例中，第二步中所述生物活性玻璃加入前需进行紫外光照灭菌。
在本发明的一些优选实施例中，第三步3D打印机料仓温度设置为20～25℃，喷头移动速度为5～15mm/s，挤出压力为0.3～0.6MPa，打印平台温度为10～20℃。在本发明的一些更优实施例中，打印平台温度为15℃。
在本发明的一些优选实施例中，第三步中紫外光波长405nm，光照强度为200～300mw/cm2，照射时间为40～60s。在本发明的一些更优实施例中，光照强度为250mw/cm2，照射时间为50s。
在本发明的一些优选实施例中，第三步中3D打印为分别采用不同组分配比的3D打印生物墨水材料进行分层打印。
在本发明的一些优选实施例中，第三步中所用3D打印机为挤压式3D打印机，可自动实现分层打印。
本发明的第三方面提供一种上述可促进牙周组织再生的3D打印生物支架或上述制备方法制备得到的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架在促进牙周组织再生方面的应用。
以下结合优选实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，如本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本发明中实施例与对比例的生物支架结构设计均相同，故统一描述，不再各自详述。
本发明中实施例与对比例的生物支架由挤压式3D打印机(电机辅助微注射器，上海福启帆机电科技有限公司，上海)打印。支架设计为12层，每层由生物墨水材料挤压而成的纤维丝以直角S型排列，纤维丝直径为400μm，纤维丝间距为1.5mm，相邻两层间的纤维丝构成纵横交错的网格矩阵，纵向纤维丝与横向纤维丝构成交叉点，所述交叉点为直接十字交叉点，最终形成约1cm×1cm×0.5cm(长×宽×高)的长方体，如图2所示。
实施例1
S1.将0.05g LAP光引发剂粉末加入20ml PBS中，60℃水浴30min，待其充分溶解后抽滤灭菌，4℃避光保存，得到LAP光引发剂溶液。
S2.将0.2g纳米生物活性玻璃颗粒(BG)紫外光照灭菌30min后，加入S1获得的光引发剂溶液中，振荡混匀，得到BG-光引发剂悬液(BG含量为1％w/v)。
S3.将2g甲基丙烯酰化明胶(GelMA)加入S2获得的BG-光引发剂悬液中，60℃水浴至混合均匀，得到BG-GelMA复合生物材料墨水(mBG：mGelMA＝1:10)。
S4.将S3获得的BG-GelMA复合生物材料墨水装载入3D打印机的打印料仓内，按照建模路径，打印墨水成型为支架。其中，支架的大小设定为1cm×1cm×0.5cm，料仓温度设置为20-25℃，喷头移动速度为10mm/s，挤出压力为0.3-0.6MPa，打印平台温度为15℃。
S5.对S4所得支架进行光交联，所用紫外光波长405nm，光照强度为250mw/cm2，照射时间为50s，最终得到3D打印生物支架。
实施例2
S1.将0.05g LAP光引发剂粉末加入20ml PBS中，60℃水浴30min，待其充分溶解后抽滤灭菌，4℃避光保存，得到LAP光引发剂溶液。
S2.将0.1g纳米BG颗粒紫外光照灭菌30min后，加入S1获得的光引发剂溶液中，振荡混匀，得到BG-光引发剂悬液(BG含量为0.5％w/v)。
S3.将2g GelMA加入S2获得的BG-光引发剂悬液中，60℃水浴至混合均匀，得到BG-GelMA复合生物材料墨水(mBG：mGelMA＝1:20)。
S4.将S3获得的BG-GelMA复合生物材料墨水装载入3D打印机的打印料仓内，按照建模路径，打印墨水成型为支架。其中，支架的大小设定为1cm×1cm×0.5cm，料仓温度设置为20-25℃，喷头移动速度为10mm/s，挤出压力为0.3-0.6MPa，打印平台温度为15℃。
S5.对S4所得支架进行光交联，所用紫外光波长405nm，光照强度为250mw/cm2，照射时间为50s，最终得到3D打印生物支架。
实施例3
S1.将0.05g LAP光引发剂粉末加入20ml PBS中，60℃水浴30min，待其充分溶解后抽滤灭菌，4℃避光保存，得到LAP光引发剂溶液。
S2.将0.02g纳米BG颗粒紫外光照灭菌30min后，加入S1获得的光引发剂溶液中，振荡混匀，得到BG-光引发剂悬液(BG含量为0.1％w/v)。
S3.将2g GelMA加入S2获得的BG-光引发剂悬液中，60℃水浴至混合均匀，得到BG-GelMA复合生物材料墨水(mBG：mGelMA＝1:100)。
S4.将S3获得的BG-GelMA复合生物材料墨水装载入3D打印机的打印料仓内，按照建模路径，打印墨水成型为支架。其中，支架的大小设定为1cm×1cm×0.5cm，料仓温度设置为20-25℃，喷头移动速度为10mm/s，挤出压力为0.3-0.6MPa，打印平台温度为15℃。
S5.对S4所得支架进行光交联，所用紫外光波长405nm，光照强度为250mw/cm2，照射时间为50s，最终得到3D打印生物支架。
对比例1
S1.将0.05g LAP光引发剂粉末加入20ml PBS中，60℃水浴30min，待其充分溶解后抽滤灭菌，4℃避光保存，得到LAP光引发剂溶液。
S2.将2g GelMA加入S1获得的LAP光引发剂溶液中，60℃水浴至混合均匀，得到GelMA生物材料墨水(BG含量为0)。
S4.将S2获得的GelMA生物材料墨水装载入3D打印机的打印料仓内，按照建模路径，打印墨水成型为支架。其中，支架的大小设定为1*1*0.5厘米，料仓温度设置为20-25℃，喷头移动速度为10mm/s，挤出压力为0.3-0.6MPa，打印平台温度为15℃。
S4.对S3所得支架进行光交联，所用紫外光波长405nm，光照强度为250mw/cm2，照射时间为50s，最终得到3D打印生物支架。
表征与性能测试
1、表征
1.1生物支架形貌
实施例1、实施例2、实施例3及对比例1所得生物支架的实物图如图3所示。由图3可知，所得生物支架为半透明的水凝胶材质，表面粗糙，为贯通多孔结构，纤维丝以直角S型排列。
将实施例1、实施例2、实施例3及对比例1所得生物支架在4℃下用戊二醇固定，酒精脱水后置于SEM电镜下观察，结果见图4。由图4可知，所有组的生物材料墨水均可打印成完整的、结构基本良好的支架，然而未添加的纳米BG颗粒的GelMA墨水组(对比例1) 有明显的支架底部塌陷和丝状扭曲现象，随着纳米BG颗粒浓度的增加，BG/GelMA生物支架(BG浓度：0.1％、0.5％、1％)变得越来越规则和均匀，不容易发生塌陷。BG/GelMA生物支架的扫描电镜图像如图4中所示，随着BG浓度的升高，支架表面越来越粗糙。四组支架都具有均匀互连的大孔隙，这表明挤压3D打印技术可以精准控制孔隙大小和结构。
1.2生物支架孔隙分析
实施例1、实施例2、实施例3及对比例1所得生物支架的孔隙分析结果如图5所示。所有孔隙暗区变成了红色，孔的边缘被自动描出并计算孔隙面积(a2、a3到d2、d3)。计算结果如表1中所示，实施例1、实施例2、实施例3平均孔径为300-450um，孔隙率为40％-55％。
表1实施例1、实施例2、实施例3及对比例1所得生物支架的孔径及孔隙率
1.3生物支架X射线光谱分析
实施例1所得生物支架的X射线光谱分析结果如图6所示。从图6中a3可以看到一类似人牙周膜细胞的团状物紧贴类似BG无机纳米颗粒的团状物生长，X射线光谱分析的结果证明了这一结论：b1显示的是a3图中黄色方框处的分析结果，其主要成分是Si、O，提示此处为BG纳米颗粒；b2显示蓝色方框处的分析结果，其主要成分是C、N、O，提示此处为人牙周膜细胞。
2、性能测试
2.1机械性能
测试方法：在万能试验机(上海衡翼精密仪器有限公司)上对支架进行压缩试验，以测定材料的压缩强度和弹性模量。具体试验方法为，以1mm/min的速度对BG/GelMA支架进行压缩，直到试样变形90％以上，电脑记录材料的应力-应变曲线。测试的支架大小为10.0mm×10.0 mm×5.0mm(长×宽×高)。在应变5％-20％区域对应力-应变曲线的斜率进行线性拟合，计算出弹性模量。所有测试重复三次。
结果分析：从图7中A可以看出，0％ BG、0.1％ BG、0.5％ BG、1％ BG组的压缩应力- 应变曲线变化趋势一致，拐点均在形变量为70％时。从图7中B可以看出，0％ BG、0.1％BG、 0.5％ BG、1％ BG组的90％形变时的平均抗压强度分别为3.679±0、5.790±0.001、4.065± 0.001、5.556±0.0002KPa，从图7中C可以看出，0％ BG、0.1％ BG、0.5％ BG、1％BG组的弹性模量分别为0.277±0.116、0.233±0.147、0.320±0.181、0.357±0.146KPa。0％ BG、 0.1％ BG、0.5％ BG和1％ BG的抗压强度和弹性模量差异无统计学意义。
2.2降解性能
测试方法：采用浸泡法评估3D打印BG/GelMA支架的降解性能。首先记录所有测试样品的原始重量M0。然后在无菌操作下，将N＝3的试样在密封容器中以1g:30mL的比例在PBS溶液中完全浸泡，37℃烘箱中保温。在各时间点(1d、3d、7d、14d、28d)，分别对测试样本进行湿重称量，重量记为M1。通过支架的重量变化来计算降解率，公式如下：
降解率(％)＝(M0-M1)/M0×100％
结果分析：如图8中A所示，随着降解时间的延长，各组生物支架的质量损失均逐渐增加，直到第14天时，质量损失曲线趋于平缓，说明生物支架的降解进入稳定状态，降解28天后，各组支架的失重率均在50％左右。如图8中C所示，在生物支架降解前一周内，硅离子大量释放。
3、细胞活力测定
使用CellTiter 96AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(Promega,Madison,WI,USA) 评估在实施例1、2、3和对比例1中培养3天的人牙周膜细胞的细胞活力。
细胞活力测定结果如图9所示。在HPDLCs培养3天后，0.1％ BG组的细胞活力较其他组下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。这一结果显示无机纳米颗粒的加入可能会产生对细胞增殖的负面影响。然而，随着BG浓度的增加，细胞存活率上升，而不是下降。
4、促进细胞成骨分化能力实验
将人牙周膜细胞(HPDLCs)在生物支架上进行体外培养24小时，戊二醛固定后用扫描电镜进行观察。如图10所示，随着生物支架中BG浓度的增加，生物支架表面和孔隙中可以观察到的细胞也越来越多，且观察到的细胞大多聚集在粗糙的BG颗粒周围。
实施例和对比例组生物支架的碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色结果如图11中A所示。由图11中A可见，在HPDLCs培养一段时间后，各组生物支架均有染色。随着培养时间的增加，颜色逐渐加深，标志着成骨分化的逐渐增强。使用ImageJ对染色后图片进行灰度值分析，得到结果如图12所示，7天、14天、21天组内不同BG浓度支架间无显著差异，组间差异明显。
实时荧光定量PCR结果如图11中B所示，与对比例1组、实施例3组相比，实施例1 组(1％ BG)第7天成骨和成牙骨质形成标志物Col-1α1和CEMP-1基因表达量最高(P<0.01)。但其他成骨相关基因OSX和ALP的表达无显著性差异，这可能与不同基因的调控机制有关，需要进一步研究。
综合以上所有试验例，可以观察到本发明获得了具有稳定结构的大孔隙生物支架，加入生物活性玻璃之后，生物支架表面粗糙，形态结构稳定，在一周内可迅速降解，伴有硅离子大量释放，从而促进人牙周膜细胞的黏附生长、成骨、成牙骨质分化。本发明优选的实施例 1作为最佳实施例。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (9)
1.一种可促进牙周组织再生的3D打印生物支架，其特征在于，所述生物支架为贯通多孔结构，由生物墨水材料经3D打印后通过光交联固化而成；所述生物墨水材料的组分包括光引发剂、生物活性玻璃、甲基丙烯酰化明胶；所述光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂；所述生物活性玻璃为纳米生物活性玻璃颗粒；所述3D打印生物墨水材料的制备方法包括：向光引发剂溶液中加入生物活性玻璃，混合均匀，生物活性玻璃的含量为1%w/v，再加入甲基丙烯酰化明胶，水浴至混合均匀，生物活性玻璃与甲基丙烯酰化明胶的质量配比为1:10。
2.如权利要求1所述的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架，其特征在于，所述生物支架为三维多层结构，每层由呈直角S型排列的纤维丝构成，相邻两层间的纤维丝构成纵横交错的网格矩阵。
3.如权利要求2所述的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架，其特征在于，所述纤维丝直径为300~600 μm，纤维丝间距为1.0~2.0 mm。
4.一种如权利要求1~3任一项所述的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步、根据人正常牙周组织生物学结构，设计并建立生物支架三维模型并保存；
第二步、向光引发剂溶液中加入生物活性玻璃，混合均匀后，再加入甲基丙烯酰化明胶，水浴至混合均匀，得到3D打印生物墨水材料；
第三步、将第一步得到的生物支架三维模型导入3D打印机的控制系统，采用第二步得到的3D打印生物墨水材料进行3D打印，紫外光交联固化，即得可促进牙周组织再生的3D打印生物支架。
5.如权利要求4所述的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架的制备方法，其特征在于，还包括以下特征中的一项或几项：
a）第一步中设计并建立生物支架三维模型包括设定生物支架的孔隙率、线径、形状以及表面积；
b）第一步中生物支架三维模型保存为stl或stp格式；
c）第三步3D打印机料仓温度设置为20~25℃，喷头移动速度为5~15 mm/s，挤出压力为0.3~0.6 MPa，打印平台温度为10~20 ℃；
d）第三步中紫外光波长405 nm，光照强度为200~300 mw/cm²，照射时间为40~60 s。
6.权利要求4所述的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架的制备方法，其特征在于，第三步中3D打印为分别采用不同组分配比的3D打印生物墨水材料进行分层打印。
7.如权利要求4所述的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架的制备方法，其特征在于，第二步中所述光引发剂溶液的制备方法为：将苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂光引发剂粉末加入PBS中，55~65 ℃水浴20~40 min，待其充分溶解后抽滤灭菌，得到光引发剂溶液。
8.如权利要求4所述的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架的制备方法，其特征在于，第二步中所述生物活性玻璃加入前需进行紫外光照灭菌。
9.如权利要求1~3中任一项所述的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架或权利要求4~8中任一项制备得到的可促进牙周组织再生的3D打印生物支架在制备促进牙周组织再生产品方面的应用。
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