CN108744032A - 一种聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料及其制备方法和应用。所述制备方法包括如下步骤：S1：对高分子多孔支架表面进行PEI修饰；所述高分子多孔支架为PLGA、PLLA或PU；S2：将修饰后的高分子多孔支架材料依次浸入质量浓度为0.4~1mg/mL的oCS溶液和质量浓度为0.4~1mg/mL Col I溶液中6~15min和15~25min，重复所述浸入操作，使得oCS和Col I各3~7层交替吸附，即得所述聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料。本发明提供的制备方法可成功制备得到聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料。该材料具有较好的表面活性及热稳定性和更利于矿化过程中HAP的形成和沉积。

Description

一种聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于高分子医学领域，具体涉及一种聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料及其制备方法和应用。
背景技术
人工合成高分子材料因其良好的生物相容性、力学性能、可降解性及降解时间可调控性等优点而被广泛应用于组织工程支架材料的制备。然而该类材料往往具有较强的疏水性，缺乏生物活性位点从而不利于细胞在材料表面的粘附和伸展。此外，单纯的人工合成高分子材料往往缺乏成骨诱导活性且应用于骨缺损修复时其力学强度仍不能完全满足。
生物矿化是改善材料力学性能及成骨诱导活性的重要途径，然而人工合成高分子材料的惰性表面往往不具备调控及诱导矿化的能力，使得材料表面沉积的磷灰石分布不均匀且与材料结合不够紧密，最终导致其力学强度提升不明显。最重要的是，与基体材料松散结合的磷灰石在植入体内后可能从植入材料部位流失，从而对正常组织产生损害。体内骨矿化过程中HAP的成核和生长受到富含硫酸基、羧基基团的蛋白多糖等的调控。而体外研究也发现通过在材料表面富积上述基团可加速钙磷盐的沉积。因此，通过在高分子支架材料表面引入可富集钙、磷盐离子的功能基团将有望促进HAP在基体材料上的沉积。
因此，开发一种具有调控及诱导矿化能力的新型高分子支架材料及制备方法具有重要的研究意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中高分子多孔支架惰性表面不具备调控及诱导矿化的能力，力学强度提升不明显缺陷和不足，提供一种聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料的制备方法。本发明提供的制备方法得到的聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料改善了支架材料表面活性和亲水性，提高了支架材料的热稳定性，有利于调控、引导和促进矿化过程中HAP的形成和沉积，工艺简单。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料在制备骨缺损修复产品中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种HAP/高分子多孔支架。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
S1：对高分子多孔支架表面进行聚乙酰亚胺PEI修饰；所述高分子多孔支架为聚乳酸羟基乙酸PLGA、聚乳酸PLLA或聚氨酯PU。
S2：将修饰后的高分子多孔支架材料依次浸入质量浓度为0.4~1mg/mL的聚阴离子氧化硫酸软骨素oCS溶液和质量浓度为0.4~1mg/mL聚阳离子I型胶原Col I溶液中6~15min和15~25min，重复所述浸入操作，使得oCS和Col I各3~7层交替吸附，即得所述聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料。
层层自组装是用于表面修饰以制备仿生表面的一项重要技术，其操作简单，温和且可适应于任意基底材料。Col I是天然骨的重要有机组成成分，是HAP生长的天然模板，可调控HAP的成核及分布。蛋白聚糖来源的CS是是参与天然骨矿化过程的重要生物大分子，其富含的硫酸基团和羧酸基团，可以通过螯合钙离子而成为HAP的成核位点，并促进磷灰石的成核及生长。
oCS为CS氧化改性后的产物，可通过现有公开的方法对CS进行改性得到。
oCS与Col I可通过分子内交联方式自组装形成相对稳定的具有明显Col I纤维网络结构的聚电解质多层膜。
本发明首先在高分子多孔支架表面进行PEI修饰使其表面氨基化，然后依次修饰上oCS和Col I，oCS与Col I可通过分子内交联方式在高分子多孔支架表面自组装形成聚电解质膜，并作为矿化过程中HAP的成核位点，从而启动并加速矿物质的形成，实现支架材料表面及内部的均匀矿化，并促进钙磷盐与基体材料的紧密结合，提高材料的力学性能及成骨诱导活性。
另外，聚电解质膜组装所应用的层层自组装技术具有温和，简便，且可适用于任意形状基体材料的优点，因此可适用于任意三维多孔支架材料的表面修饰。该方法工艺简单，可广泛推广应用。
优选地，所述高分子多孔支架为PLGA。
现有技术中常规的方法均可实现高分子多孔支架表面的PEI修饰，本发明在此也提供一种具体的修饰方法。
优选地，S1中对高分子多孔支架表面进行PEI修饰的具体步骤如下：
S11：对高分子多孔支架进行活化处理；
S12：将活化后的高分子多孔支架浸泡在质量浓度为3~7 mg/mL，pH为7.0~7.6的PEI溶液中，清洗，晾干。
优选地，S11中活化处理的过程为：将高分子多孔支架经无水乙醇浸泡，清洗，然后在EDC和NHS的混合溶液中活化。
优选地，S11混合溶液中EDC的浓度为3mg/mL， NHS的浓度为5mg/mL，所述混合溶液的pH为6；活化时间为10min。
优选地，S12中PEI溶液的浓度为5mg/mL，pH=7.4。
优选地，S2中所述oCS和Col I吸附的层数均为4层。
优选地，S2中所述oCS溶液的浓度为0.5mg/mL；Col I溶液的浓度为0.5mg/mL。
优选地，S2中高分子多孔支架在oCS溶液中的浸泡时间为15min；高分子多孔支架在Col I溶液的浸泡时间为20 min。
本发明还请求保护上述制备方法制备得到的聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料。
该聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料具有较好的表面活性及热稳定性，更能促进支架在矿化过程中HAP的形成，及其在支架内外表面的均匀沉积，以及HAP与基体材料的结合。
上述聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料在制备骨缺损修复产品中的应用也在本发明的保护范围内。
优选地，所述高分子多孔支架材料在制备HAP/高分子多孔支架产品中的应用。
本发明还请求保护一种HAP/高分子多孔支架，将上述聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料矿化处理沉积HAP，即得所述HAP/高分子多孔支架。
该HAP/高分子多孔支架具有较好的力学性能、生物相容性及成骨诱导活性。
现有技术中常规的矿化处理均可适用于本发明中。如快速矿化、模拟体液矿化、酶控矿化、过饱和钙化溶液法和交替浸泡法处理等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料的制备方法可成功制备得到聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料。该材料具有较好的表面活性、热稳定性和更利于矿化形成过程中HAP的形成和沉积。HAP沉积后得到的HAP/高分子多孔支架具有较好的力学性能、生物相容性及成骨诱导活性。
附图说明
图1为PLGA和mPLGA的大体形貌图；
图2为PLGA和mPLGA的扫描电镜图（×100，×500）；
图3为PLGA和 mPLGA的TGA(A) 曲线和DTG(B)曲线；
图4为快速矿化制备HAP/mPLGA的流程图；
图5为PLGA、HAP/PLGA和HAP/mPLGA的大体形貌；
图6为PLGA、HAP/PLGA和HAP/mPLGA茜素红染色结果；
图7为HAP/PLGA和HAP/mPLGA的扫描电镜图(×100、×10.0 K、×70.0 K）；
图8为HAP/PLGA和HAP/mPLGA能谱分析结果示意图；
图9为PLGA、HAP/PLGA和HAP/mPLGA的FTIR图
图10为PLGA、HAP/PLGA、HAP/mPLGA和矿化反应液中磷灰石XRD图；
图11为BMSCs在两组多孔复合支架培养1、3、7 d 荧光显微镜结果；
图12为BMSCs在单纯PLGA及HAP/mPLGA多孔支架的SEM（500×）；
图13为BMSCs在两组多孔复合支架培养1 d、3 d、7 d MTS结果；
图14为BMSCs在PLGA和HAP/mPLGA支架上培养14 d成骨相关基因表达情况（*表示组间比较有显著性差异，P＜0. 05）；
图15为PLGA、HAP/PLGA-SBF和HAP/mPLGA-SBF的大体形貌图；
图16为PLGA、HAP/PLGA-SBF和HAP/mPLGA-SBF的茜素红染色结果；
图17为PLGA、HAP/PLGA-SBF和HAP/mPLGA-SBF的扫描电镜图；
图18为PLGA、HAP/PLGA-SBF和HAP/mPLGA-SBF的FTIR图和XRD图；
图19为大鼠股骨缺损处两种材料移植后不同时间点的X射线拍摄结果；
其中，PLGA表示单纯PLGA多孔支架材料，mPLGA为聚电解质膜修饰PLGA多孔支架材料，HAP/mPLGA为mPLGA经快速矿化得到的多孔支架材料，HAP/PLGA为PLGA经快速矿化得到的多孔支架材料，HAP/mPLGA-SBF为mPLGA经模拟体液（SBF）矿化得到的多孔支架材料，HAP/PLGA-SBF为PLGA经SBF矿化得到的多孔支架材料，HAP/PLGA-suspension为对PLGA进行矿化处理后的矿化反应液，HAP/mPLGA-suspension为对mPLGA进行矿化处理后的矿化反应液。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1~5 聚电解质膜修饰多孔支架材料
实施例1提供一种制备聚电解质膜修饰PLGA多孔支架材料mPLGA的制备方法，具体包括如下步骤。
（1）PLGA支架表面氨基化修饰（PEI修饰）
采用两步激活法对PLGA支架表面进行PEI修饰。将PLGA支架在无水乙醇中浸泡5 min后，去离子水充分清洗以去除无机残留物。充分水洗后，将PLGA支架转移至EDC(3 mg/mL，pH=6.0)及NHS (5 mg/mL，pH=6.0)的混合溶液中持续搅拌。反应10 min后将PLGA支架取出，大量去离子水清洗后将其浸泡于PEI溶液中(5mg/mL, pH=7.4)，室温反应4 h后去离子水清洗，晾干。
（2）聚电解质膜自组装修饰PLGA支架材料
oCS的制备：
对CS进行氧化改性，具体步骤如下：将0.5 g CS加入盛有100 mL超纯水的蓝口瓶中，磁力搅拌1小时使其完全溶解后，按照CS与高碘酸钠摩尔比为4：1的比列加入高碘酸钠避光反应3 h。反应结束后将反应液转移至预先浸泡处理的透析袋中，透析3 d，每天换液2次。透析后溶液转移至圆底烧瓶中，冷冻干燥24小时后即得到oCS。
层层自组装修饰PLGA：
接下来在PEI修饰后的PLGA多孔支架上进行聚电解质膜的组装，将PEI修饰后的PLGA材料分别浸入聚阴离子oCS（0.5mg/mL）及聚阳离子Col I（0.5mg/mL）溶液中，每一层吸附后都伴随着洗脱步骤，洗3次，每次3 min，洗脱液为NaCl溶液（0.15 M， pH 4.0），oCS溶液中的吸附时间为15 min，而Col I溶液中的吸附时间为20 min。重复以上步骤，最终在PEI基础层上得到各4层oCS与Col I交替吸附的聚电解质膜修饰多孔支架，命名为mPLGA。
实施例2提供另一种制备聚电解质膜修饰PLGA多孔支架材料的制备方法。
本实施例2中聚阴离子oCS溶液的浓度0.4 mg/mL，每次沉积的时间为15 min，共沉积7次；聚阳离子Col I溶液的浓度为0.4 mg/mL，每次沉积的时间为25 min，共沉积7次。其余条件均与实施1中的一致。
实施例3提供另一种制备聚电解质膜修饰PLGA多孔支架材料的制备方法。
本实施例3中聚阴离子oCS溶液的浓度1mg/mL，每次沉积的时间为6min，共沉积3次；聚阳离子Col I溶液的浓度为1mg/mL，每次沉积的时间为15min，沉积3次。其余条件均与实施1中的一致。
实施例4提供一种制备聚电解质膜修饰PLLA多孔支架材的制备方法。该制备方法除用PLLA代替PLGA外，其余步骤均与实施例1中一致。
实施例5提供一种制备聚电解质膜修饰PU多孔支架材料的制备方法。该制备方法除用PU代替PLGA外，其余步骤均与实施例1中一致。
交替吸附不同次数可得到不同层数的oCS和Col I。具体层数可根据需要进行选择，一般大于等于4层时都可得到较好性能的Col I纤维网络结构的聚电解质多层膜。另外，PLGA、PLLA和PU等均为有较好生物相容性及可降解性且具有生物惰性表面的人工合成高分子多孔材料。本发明仅以实施例1提供的多孔支架mPLGA为例对其性能及矿化后的支架材料进行研究。
图1为PLGA和mPLGA的大体形貌图。从图中可知，两者的形貌未见明显差异，两组材料均呈现均匀分布的多孔结构，质地较疏松且软。
为了进一步观察支架材料内部微观结构，通过SEM对材料形貌进行了观察。如图 2所示，oCS/Col I聚电解质膜修饰后得到的mPLGA支架依然保持着完整的三维多孔结构，与单纯PLGA支架相比并没有发生明显改变。但在较高倍数下可见，mPLGA支架表面结构较单纯PLGA表面更粗糙和富有纹理，这表明oCS与Col I已成功组装至PLGA支架材料表面。
单纯PLGA和mPLGA支架的热重分析见图 3。图 3A显示两种支架的热失重（TGA曲线）呈现相同的趋势：样品质量在30℃～280℃范围内未见明显变化；在280℃～340℃范围内，质量开始急剧下降。从DTG曲线（图3B）可以看出，与单纯PLGA支架相比，mPLGA的最大降解温度略高。说明oCS/Col I多层聚电解质膜的吸附可以提高PLGA支架的热稳定性。
实施例6 快速矿化处理得到的HAP/mPLGA多孔支架材料
对实施例1得到的mPLGA进行矿化处理可形成HAP，并在支架内外表面均匀沉积且紧密结合的HAP/mPLGA多孔支架材料。
本实施例提供一种快速矿化处理方法。如图4，具体过程如下。
5 mL去离子水，15 mL乙醇和0.3ｇ尿素加入一广口瓶中搅拌均匀，然后加入5 mL磷酸二氢钠溶液（0.1 M）。将单纯PLGA和mPLGA多孔支架分别浸入混合溶液中低速搅拌10min，使溶液充分渗透到多孔结构的网络中，然后加入8.35 mL氯化钙溶液（0.1 M）继续搅拌5 min。将广口瓶密封置于50℃烘箱中反应48 h。矿化后的m/PLGA支架为HAP/mPLGA，而矿化后的PLGA支架为HAP/PLGA，得到的样品经超声充分清洗，然后冷冻干燥备用。
分别对单纯PLGA， HAP/PLGA及 HAP/mPLGA支架材料等进行了理化性能表征及生物相容性，成骨诱导性能的研究。
（1）大体形貌观测
图5为PLGA、HAP/PLGA和HAP/mPLGA的大体形貌图。其中经过矿化后的mPLGA支架孔隙可见轻微的皱缩，但仍具有丰富、相对密集的孔隙结构。而单纯PLGA支架经过快速矿化后得到的HAP/PLGA支架体积发生明显皱缩，支架塌陷，残存孔隙结构较少。此外，HAP/PLGA和HAP/mPLGA相较于单纯PLGA明显更硬。
（2）多孔支架的茜素红染色
通过茜素红染色观察矿化后支架内钙磷盐的沉积情况见图6。可以看出，单纯PLGA多孔支架未见明显染色，而HAP/PLGA材料被茜素红染成淡红色， HAP/mPLGA支架则被染成紫红色，而染色越深则表明支架中的钙磷盐越丰富，由此表明经oCS与Col I聚电解质膜修饰后可促进PLGA支架材料的矿化。
（3）SEM观察
为进一步观察矿化48 h后两组支架材料微观结构的变化，SEM观察见图7。HAP/PLGA和HAP/mPLGA两组支架上均可见明显钙磷盐的沉积，在高倍镜下可以看到两组支架的表面及孔洞内部沉积了直径小于100纳米的典型棒状和片状纳米钙磷盐晶体。值得注意的是，沉积在单纯PLGA支架上的钙磷盐松散的附着在支架上而且形成了许多不规则分布的聚集体，而mPLGA组支架表面上的钙磷盐分布更为均匀丰富，结构更致密，在支架表面形成了紧密结合的结构。表明自组装修饰不仅可以诱导矿物质的形成，同时可以促进矿物质的均匀沉积及其与支架材料的紧密结合。
（4）能谱分析（EDX）结果
为了评估HAP/PLGA和HAP/mPLGA支架中沉积钙磷盐的元素组成，采用EDX对样品进行了分析研究。对应的分析及统计结果见图8及表1。由图可见，两样品均显示出Ca、P峰，其中HAP/mPLGA支架中Ca、P的摩尔比（Ca/P）约为1.10 ± 0.10，而HAP/PLGA支架中Ca/P约为1.23 ± 0.14，两组之间的Ca/P比值未见明显差异。
表1 HAP/PLGA及HAP/mPLGA多孔支架能谱分析Ca/P值统计结果
（5）红外（FTIR）分析结果
单纯PLGA、HAP/PLGA和HAP/mPLGA支架的红外分析结果见图9。从红外图谱中可见，HAP/PLGA和HAP/mPLGA支架材料在1036 cm−1，606 cm−1和560 cm−1处均可见来自于PO4 3−基团的特征拉伸和变形振动峰。另外，在1454 cm−1和867 cm−1处出现的特征峰可能来自于CO3 2−或CO3 2 − 和HPO4 2−的伸缩振动峰。而在1650 cm-1出现的弱峰应该源于二水合磷酸氢钙（DCP）中的O-H峰。这表明HAP/PLGA和HAP/mPLGA两组支架材料上形成的钙磷盐沉积物不仅含有HAP，还含有其他矿物质成份。
（6）X射线衍射（XRD）结果
HAP/PLGA、HAP/mPLGA及矿化后悬浮液中沉淀物XRD检测结果见图10。两组悬浮液中形成的钙磷盐未见明显差异，均为结晶度较低的HAP。然而HAP/PLGA和HAP/mPLGA支架材料的XRD谱具有一定的差异，表现为HAP/PLGA支架分别出现了HAP的特征衍射峰（25.8, 48.9）和DCP的衍射峰（29.2, 31.6）（图中圆点表示HAP出现的衍射峰，三角形表示DCP出现的衍射峰）。HAP/mPLGA支架中含有HAP的其他衍射峰（25.9, 32.2, 39.8, 53.3），和DCP的衍射峰（29.2），但是相比HAP/PLGA支架而言，其图谱中形成的HAP峰更尖锐，且HAP含量更高。另外，两组样品出现的HAP衍射峰均较宽，这可能是由于形成的HAP尺寸较小且结晶度较低。
（7）力学性能检测
从力学测试结果中（表2）可以看出，单纯PLGA在50%形变处的压缩强度与压缩模量分别是0.56 ± 0.1 MPa、1.05 ± 0.37 MPa，经自组装修饰及矿化后的HAP/mPLGA的压缩强度与压缩模量分别增至6.04 ± 1.56 Mpa和7.49 ± 1.64 MPa。从数据中可以发现，单纯PLGA较软，而通过矿化后支架材料的力学强度有了明显改善。由于单纯矿化的HAP/PLGA支架体积皱缩严重（图5可见），在此处无法对其力学强度进行检测。
表2 单纯PLGA和HAP/mPLGA复合支架材料的抗压强度（Compression strength）
*表明较单纯PLGA支架材料有显著性差异，P＜0. 05。
（8）生物相容性及成骨诱导活性研究
1. 支架材料上骨髓间充质干细胞（BMSCs）粘附、伸展及增殖行为研究
由于单纯矿化的HAP/PLGA支架材料形貌的改变及孔径尺寸的剧减，后续实验仅选择了单纯PLGA及修饰后矿化的HAP/mPLGA来研究。
A．利用荧光显微镜监测BMSCs-GFP在PLGA和HAP/mPLGA复合支架中细胞粘附、伸展及生长行为见图11。BMSCs-GFP在PLGA和HAP/mPLGA复合支架中培养1 d后，两组支架中均出现较少量荧光信号，为刚接种上去的贴壁细胞。在培养3 d后进一步观察两组支架中荧光信号发现其强度越来越强，细胞数量增多。而在7 d时，两组支架中的荧光信号聚集成团，且HAP/mPLGA复合支架中可见更强更多的荧光信号，提示支架中细胞数量更多。
B. 利用SEM进一步观察BMSCs在两组支架材料中的形态和基质分泌情况，结果见图12。培养3 d后，SEM显示BMSCs在PLGA及HAP/mPLGA多孔支架表面均有着良好的粘附和伸展行为，形成较多的丝状伪足；在第7 d时，可以观察到两组支架中细胞伸出明显的细胞伪足。与单纯PLGA支架组相比，HAP/mPLGA复合支架中BMSCs的粘附、伸展状态较好，伪足伸展更丰富，细胞体积更大；此外HAP/mPLGA复合支架中细胞的数量和细胞外基质的分泌也更多，可见其上单个细胞间通过所分泌基质连接成片。
C．BMSCs在两组支架上培养1 、3 及7 d 的增殖情况见图13。BMSCs在支架上培养1、3 和7 d后通过MTS法测定光吸收值，其中光吸收值反应活细胞数量，从而间接反应细胞增殖情况。结果显示，两组多孔支架材料均能够支持细胞的增殖，在第1 d和3 d，组间吸光值无显著性差异(P>0.05)，而在第7 d，BMSCs在HAP/mPLGA多孔支架组的吸光值较在单纯PLGA支架组高，差异有统计学意义（P<0.05），表明HAP/mPLGA多孔支架能更好地促进BMSCs的增殖。
2．支架材料上BMSCs的成骨分化行为研究
BMSCs在两组材料上培养14 d后，成骨相关基因的qRT-PCR分析结果见图14。与单纯PLGA支架相比，在成骨分化培养基中培养时，复合支架上BMSCs细胞内的主要转录因子RUNX2和OSX显著上调（P＜0.05）。而成骨细胞基质成熟的早期和中期生物标志物ALP的表达也明显较高（P＜0. 05）。此外，与骨钙化过程相关的OPN和OCN基因在复合支架中也有较高表达，但无统计学差异（P>0. 05）。这说明HAP/mPLGA够促进BMSCs的成骨分化。
实施例7 模拟体液矿化法得到的HAP/mPLGA-SBF多孔支架材料
本实施例提供一种模拟体液（SBF）矿化法对实施例1得到的mPLGA进行矿化处理，得到HAP/mPLGA-SBF多孔支架材料。具体过程如下。
单纯PLGA及聚电解质膜修饰后的mPLGA多孔支架浸泡入SBF中矿化14天，隔两天换液一次（SBF的配制参照表3和表4）。矿化后得到多孔支架经冷冻干燥后低温保存。经修饰后矿化的PLGA支架为HAP/mPLGA-SBF，而单纯矿化的PLGA支架材料为HAP/PLGA-SBF。分别对PLGA，HAP/PLGA，HAP/mPLGA-SBF支架材料等进行了理化性能表征及体内促进骨缺损修复作用的研究。
表3 SBF、血浆各离子浓度列表
表4 1×模拟体液配制方法表
（1）大体形貌观察
单纯PLGA，HAP/PLGA-SBF及HAP/mPLGA-SBF材料大体形貌见图15。从图中可见，矿化前后支架材料宏观形貌未见明显变化，均呈疏松多孔结构，PLGA质地柔软，然而HAP/PLGA-SBF及HAP/mPLGA-SBF质地较脆和硬。
（2）茜素红染色
从图16中可以看到，矿化前后材料的茜素红染色情况有明显差异，其中单纯组材料未见明显着色，而HAP/PLGA-SBF材料被茜素红染成淡红色， HAP/mPLGA支架则被染成紫红色，而染色越深则表明支架中的钙磷盐越丰富，由此表明经oCS与Col I修饰后可促进PLGA支架材料的矿化。
（3）SEM观察
图17为单纯PLGA，HAP/PLGA-SBF和HAP/mPLGA-SBF支架材料的表面形貌结构。通过SEM结果可以看到，矿化后两组支架材料的孔隙结构与单纯PLGA支架相比均未发生明显变化。其中单纯PLGA支架表面较光滑，而矿化后支架表面结构粗糙。与快速矿化结果相似，HAP/PLGA-SBF表面可见少量矿物质的沉积，且矿物质主要沉积在孔隙边缘，孔洞内壁仅可见少许无规则颗粒物沉积。而HAP/mPLGA-SBF支架表面有明显大量的纳米颗粒状矿物质的沉积，且矿物质在材料表面沉积更为均匀，孔洞边缘及内壁均可见大量均匀的球形矿物质沉积。表明自组装修饰不仅可以诱导矿物质的形成，同时可以促进矿物质在支架内部的均匀沉积。
（4） FTIR及XRD结果
如图18，FTIR结果显示，HAP/PLGA-SBF及HAP/mPLGA-SBF支架在SBF中矿化14天后在562cm-1处出现了P-O伸缩振动峰，在865 cm-1和1509 cm-1处出现了CO3 2-伸缩振动峰，在3370cm-1出现了O-H的振动峰，表HAP/PLGA-SBF和HAP/mPLGA-SBF支架上均出现了HAP的沉积。XRD结果可见，经SBF矿化14天后的HAP/PLGA-SBF支架材料在45.7º出现了HAP的特征衍射峰（图中圆点表示HAP出现的衍射峰）。而HAP/mPLGA-SBF支架材料则在45.7º，32.2º, 48.2º和53.4º处均出现了HAP的衍射峰，进一步证实了矿化后材料上HAP的形成。与快速矿化相似，同样地，相比HAP/PLGA-SBF支架而言，HAP/mPLGA-SBF支架对应图谱中形成的HAP含量更高。
（5）骨缺损修复作用研究
图19为PLGA和HAP/mPLGA-SBF材料植入4周和8周后骨缺损处的X射线扫描结果。在第4周时， PLGA和HAP/mPLGA-SBF移植组之间可见股骨中上段明显的缺损区域，两组之间无明显差异。而在第8周时可以明显观察到两组大鼠骨缺损处范围逐渐缩小，且缺损处有明显的不透射线的钙化组织，而HAP/mPLGA-SBF支架移植组较单纯PLGA支架移植组更能明显见其缺损处被钙化组织填充，整个缺损区趋于愈合。进一步利用仪器自带软件对缺损处骨密度（BMD）分析（见表5），在第4周时单纯PLGA和HAP/mPLGA-SBF支架移植组骨密度分别是2.28± 0.15、2.11 ± 0.07，两组间无明显差异（P>0.05）在第4周时多元复合支架和单纯支架移植组骨密度分别是2.31 ± 0.3、2.17 ± 0.05，两组间差异明显（P<0.05）。
表5 大鼠股骨缺损处两种材料移植后不同时间点骨密度统计表
注: * 表示较PLGA支架植入组有显著性差异，P＜0. 05。
综上，经oCS/Col I聚电解质膜自组装修饰后得到的mPLGA不仅能改善材料表面活性，提高支架的热稳定性，更能促进支架在矿化过程中HAP的形成，及其在支架内外表面的均匀沉积，以及HAP与基体材料的结合。而HAP在骨组织工程中表现出优良的力学性能及对干细胞成骨诱导活性。我们通过快速矿化及模拟体液矿方式均证明经oCS及Col I自组装修饰后的高分子多孔支架材料不仅能够促进HAP的生成，且能促进其与基体材料的结合及均匀分布。提高了支架材料的力学性能、生物相容性及成骨诱导活性。

Claims (10)

1.一种聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
S1：对高分子多孔支架表面进行聚乙酰亚胺PEI修饰；所述高分子多孔支架为聚乳酸羟基乙酸PLGA、聚乳酸PLLA或聚氨酯PU；
S2：将修饰后的高分子多孔支架材料依次浸入质量浓度为0.4~1mg/mL的聚阴离子氧化硫酸软骨素oCS溶液和质量浓度为0.4~1mg/mL聚阳离子I型胶原Col I溶液中6~15min 和15~25min，重复所述浸入操作，使得oCS和Col I各3~7层交替吸附，即得所述聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述高分子多孔支架为PLGA。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S1中对高分子多孔支架表面进行PEI修饰的具体步骤如下：
S11：对高分子多孔支架进行活化处理；
S12：将活化后的高分子多孔支架浸泡在质量浓度为3~7 mg/mL，pH为7.0~7.6的PEI溶液中，清洗，晾干。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2中所述oCS和Col I吸附的层数均为4层。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2中所述oCS溶液的浓度为0.5mg/mL；Col I溶液的浓度为0.5mg/mL。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，S2中高分子多孔支架在oCS溶液中的浸泡时间为15min；高分子多孔支架在Col I溶液的浸泡时间为20 min。
7.权利要求1~6任一所述制备方法制备得到的聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料。
8.权利要求7所述聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料在制备骨缺损修复产品中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述高分子多孔支架材料在制备HAP/高分子多孔支架产品中的应用。
10.一种HAP/高分子多孔支架，其特征在于，将权利要求7所述聚电解质膜修饰高分子多孔支架材料矿化处理沉积羟基磷灰石HAP，即得所述HAP/高分子多孔支架。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110240691A (zh) * 2019-05-20 2019-09-17 齐鲁工业大学 一种水性聚氨酯/胶原蛋白/羟基磷灰石复合材料的制备方法
CN111569160A (zh) * 2020-05-26 2020-08-25 四川大学 基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层及其制备方法
CN113710292A (zh) * 2019-02-13 2021-11-26 法国国家健康与医学研究院 包括含矿物质化合物的支架的生物材料及其作为骨替代物的用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1394901A (zh) * 2002-07-10 2003-02-05 浙江大学 用静电吸引层层自组装改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法
CN102875824A (zh) * 2012-10-25 2013-01-16 福州大学 生物活性纳米复合聚电解质三维多孔骨组织工程支架
CN104056302A (zh) * 2013-03-18 2014-09-24 杭州启迪生物科技有限公司 一种用于构建骨移植物的组织工程支架材料及其制备方法
CN105582576A (zh) * 2016-02-23 2016-05-18 武汉大复生物科技有限公司 提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料、制备方法及用途
CN107224609A (zh) * 2017-05-03 2017-10-03 中国人民解放军第四军医大学 高分子聚电解质诱导胶原纤维内仿生钙化的方法及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1394901A (zh) * 2002-07-10 2003-02-05 浙江大学 用静电吸引层层自组装改性聚酯类材料为表面具有细胞相容性生物材料的方法
CN102875824A (zh) * 2012-10-25 2013-01-16 福州大学 生物活性纳米复合聚电解质三维多孔骨组织工程支架
CN104056302A (zh) * 2013-03-18 2014-09-24 杭州启迪生物科技有限公司 一种用于构建骨移植物的组织工程支架材料及其制备方法
CN105582576A (zh) * 2016-02-23 2016-05-18 武汉大复生物科技有限公司 提高内皮祖细胞外泌体释放并促进骨缺损修复的生物材料、制备方法及用途
CN107224609A (zh) * 2017-05-03 2017-10-03 中国人民解放军第四军医大学 高分子聚电解质诱导胶原纤维内仿生钙化的方法及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. ABDELKEBIR等: "Biomimetic layer-by-layer templates for calcium phosphate biomineralization", 《ACTA BIOMATERIALIA》 *
M. Y. ZHAO等: "LBL coating of type I collagen and hyaluronic acid on aminolyzed PLLA to enhance the cell-material interaction", 《EXPRESS POLYMER LETTERS》 *
MINGYAN ZHAO等: "Improved Stability and Cell Response by Intrinsic Cross-Linking of Multilayers from Collagen I and Oxidized Glycosaminoglycans", 《BIOMACROMOLECULES》 *
MINGYAN ZHAO等: "Molecular composition of GAG-collagen I multilayers affects remodeling of terminal layers and osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells", 《ACTA BIOMATERIALIA》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113710292A (zh) * 2019-02-13 2021-11-26 法国国家健康与医学研究院 包括含矿物质化合物的支架的生物材料及其作为骨替代物的用途
CN110240691A (zh) * 2019-05-20 2019-09-17 齐鲁工业大学 一种水性聚氨酯/胶原蛋白/羟基磷灰石复合材料的制备方法
CN110240691B (zh) * 2019-05-20 2021-09-24 齐鲁工业大学 一种水性聚氨酯/胶原蛋白/羟基磷灰石复合材料的制备方法
CN111569160A (zh) * 2020-05-26 2020-08-25 四川大学 基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层及其制备方法
CN111569160B (zh) * 2020-05-26 2021-05-11 四川大学 基于重组人源胶原蛋白的多功能支架涂层及其制备方法

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