CN105412987B - 一种纤维内外协同矿化胶原支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纤维内外协同矿化胶原支架及其制备方法。该支架材料不仅在化学组成成分上接近天然骨组织,而且在形成过程上尽可能的模拟了天然骨组织的发生过程,从而在胶原纤维内形成了特征性周期性的(D=67nm)横位结构。这种新型的仿生矿化支架材料在体内实验(动物实验)、体外实验(细胞的增殖、成骨分化)及机械性能实验中均较传统矿化方法得来的支架材料有着明显的优越性,为今后临床骨组织缺损的修复提供了新的可能性,具有更为广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于组织工程支架材料领域,尤其是涉及一种纤维内外协同矿化胶原支架及其制备方法,特别是仿生矿化过程,涉及骨组织缺损修复材料的制备及应用。
背景技术
天然骨组织主要是由羟基磷灰石纳米晶体与Ⅰ型胶原纤维有序排列组合形成的复杂的有机-无机复合体。由于肿瘤切除或外伤等因素所导致的骨组织缺损的修复一直以来都是科学研究及临床治疗的重点及难点问题。尽管自体骨骨移植技术已经在临床骨组织缺损治疗中取得了一定的成效,但其供给区对骨量的限制以及对患者所造成的二次伤害制约其进一步发展应用。近年来,随着组织工程的发展,越来越多的研究重心放在了如何制备一种具有良好生物相容性、适宜机械性能、一定骨诱导性及骨传导性的支架材料上。
鉴于Ⅰ型胶原良好的生物学行为,使其成为支架基质材料的首选。但单独使用时,由于其机械性能较低、降解速率较快,无法很好的承担支架功能,因而对胶原支架如何进行仿生改性越来越多的受到关注。由于羟基磷灰石晶体较大,而自组装完成后的胶原纤维孔区直径较小,传统仿生矿化只能将无机物沉积在胶原纤维的外表面,形成外矿化。这种外矿化,虽然在一定程度上提高了支架的机械性能,降低了支架的降解速率,但与天然骨组织相比,并没有达到真正的仿生。
国内外大量研究表明,利用多聚物引导的液相前驱体(PILP过程)来矿化胶原纤维,可以达到胶原纤维内部矿化,形成与天然骨相似的纳米结构。但其使用的多聚物多为化学合成聚阴离子材料,应用于机体后的生物相容性有待研究,其次,其降解产物对机体是否有影响尚没有系统的探讨研究,因此寻找一种天然的具有良好生物学相容性的稳定材料显得十分必要。
发明内容
有鉴于此,本发明旨在提出一种纤维内外协同矿化胶原支架及其制备方法,以克服现有技术中的不足或缺陷,寻找到一种新型聚电解质多聚物,模拟骨组织发生过程,从而制备出基于仿生策略的纤维内外协同矿化胶原支架。
为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
一种纤维内外协同矿化胶原支架,包括I型胶原纤维以及羧甲基壳聚糖,以I型胶原纤维为支架结构,并利用羧甲基壳聚糖使其实现内外协同矿化。
优选的,所述I性胶原纤维为I型鼠尾胶原。
本发明还提供了一种制备如上所述的纤维内外协同矿化胶原支架的方法,包括如下步骤,
1)Ⅰ型胶原纤维的提取与自组装;
2)仿生矿化液的制备:将1~3mM的K2HPO4在质量分数0.5~1.5%的羧甲基壳聚糖稳定下与3~5mM的CaCl2相混合,静置1~3小时;
3)纤维内外协同矿化胶原支架的制备:将步骤1)制备的胶原纤维从透析袋中取出,去离子水超声清洗后,置于羧甲基壳聚糖溶液中,30~45℃的条件下放置50~90小时;取出后用去离子水超声清洗,放入冷冻干燥机中冷冻干燥。
优选的,步骤1)中的Ⅰ型胶原纤维的提取与自组装包括如下步骤,
A)将新鲜6~10周龄SD大鼠鼠尾浸泡于质量分数为65~85%乙醇溶液中10~20分钟;
B)取出后去除鼠尾皮肤,提取鼠尾腱,将提取的鼠尾腱置于Tris-HCl-NaCl缓冲溶液中,在1~7℃环境下浸泡20~28小时;
C)鼠尾腱取出后用去离子水冲洗,置于0.2~0.4M的醋酸溶液中,在室温下持续搅拌2~4天,得到胶原的醋酸溶液;
D)将步骤C)得到胶原的醋酸溶液在0~4℃,2000~4000r/min的条件下离心20~40分钟后取上清,放入透析袋中;
E)将透析袋置于0.015~0.025M的磷酸氢二钾溶液中透析5-7天,完成胶原的自组装过程。
优选的,所述步骤E)中,磷酸氢二钾溶液的浓度为0.02M。
优选的,所述步骤2)中,K2HPO4的浓度为2mM,羧甲基壳聚糖的浓度为1%,CaCl2的浓度为4mM。
优选的,所述步骤3)中,胶原纤维置于羧甲基壳聚糖溶液后,在37℃的条件下放置72小时。
本发明还提供了一种如上所述的纤维内外协同矿化胶原支架在骨组织修复中的应用。
本发明同时提供了如上所述的纤维内外协同矿化胶原支架的制备方法制备的胶原支架在骨组织修复中的应用。
相对于现有技术,本发明所述的一种纤维内外协同矿化胶原支架及其制备方法,具有以下优势:
(1)较传统矿化方法,本发明更高程度的模拟出了骨发生过程,使得该矿化支架不仅在化学组成成分上具有与天然骨组织相似的成分,而且在微观结构上也具有类似的特征横纹结构(横纹直径D=67nm)。
(2)本发明所述的矿化胶原支架在湿润及干燥状态下机械性能和生物相容性(细胞的增值、成骨分化、动物实验)均较传统矿化支架优势明显。
(3)本发明使用钙磷稳定剂为价格低廉、天然无毒副作用、具有良好生物学相容性、可以在体内生物降解且降解产物无毒副作用的羧甲基壳聚糖(CMC)。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1为对比例1获得的未矿化胶原支架(NMC)、对比例2获得的传统矿化方法获得支架(BMC)、以及实施例1获得的矿化胶原支架(TMC)的实物图;其中左图为未矿化胶原支架(NMC),中间为传统矿化方法获得支架(BMC),右图为实施本发明方法获得的新型矿化支架(TMC)。
图2中,a、b、c分别为NMC、TMC以及BMC的发射扫描电镜(SEM)的表征结果;d、e、f分别为NMC、TMC以及BMC支架材料的TEM表征结果;a中箭头所示为自组装完成的胶原纤维,b中箭头所示为矿物质沉积于纤维外部的传统矿化胶原纤维,c中箭头所示为仿生矿化得到的横纹(D=67nm)明显的胶原纤维;d中箭头所示为NMC支架负染后可见特征性周期横纹,e中箭头所示为TMC支架矿物质沉积于纤维外部,f中箭头所示为未染色的BMC支架中形成的特征性周期横纹结构;
图3为NMC、TMC以及BMC支架材料的X射线衍射(XRD)表征结果;箭头所示为羟基磷灰石特征峰值;
图4为干燥及湿润状态下NMC、TMC以及BMC支架材料三种不同支架材料弹性模量对比图;*号表示组间存在显著性差异P<0.05;
图5为CCK-8检测及ALP检测3T3-E1细胞增殖及成骨分化结果;数据均采用单因素方差分析数据间的差异。
图6为AO/EB染色后3T3-E1细胞分别在BMC、TMC、NMC支架上培养3天后激光共聚焦对比结果;a,b,c分别为BMC、TMC、NMC支架结果;
图7为大鼠头盖骨骨缺损模型的建立;
图8为4周、8周时骨缺损处Micro-CT扫描结果三维重建对比,a,b,c,d分别表示空白对照组、NMC支架组、TMC支架组、BMC支架组结果对比;
图9为4周、8周时缺损区组织切片HE染色结果;a,b,c,d分别表示空白对照组、NMC支架组、TMC支架组、BMC支架组结果对比;图中黑色箭头所指为新骨,白色箭头为缺损区头盖骨,白色五角星所指为未降解的材料。
图10为4周、8周时缺损区组织切片Masson染色结果;a,b,c,d分别表示空白对照组、NMC支架组、TMC支架组、BMC支架组结果对比。图中黑色箭头所指为新骨,白色箭头为缺损区头盖骨,白色五角星所指为未降解的材料。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
另外,在本发明的实施例中所提到的浓度单位M,是mol/L;mM,是指0.001mol/L。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
本发明所述的纤维内外协同矿化胶原支架,其制备包括如下步骤,
(1)Ⅰ型胶原的提取与自组装
将新鲜8周龄SD大鼠鼠尾浸泡于75%乙醇溶液中15分钟,取出后去除鼠尾皮肤,提取鼠尾腱,为防止胶原变性所有操作均在去离子水槽中进行。将提取的鼠尾腱置于Tris-HCl-NaCl缓冲溶液中(0.05mol/L,pH=7.4),在4℃环境下浸泡24小时。鼠尾腱取出后用去离子水冲洗,置于0.3M的醋酸溶液中,在室温下持续搅拌3天,得到胶原的醋酸溶液。将溶液在4℃,3000r/min的条件下离心30分钟后取上清,放入透析袋中。将透析袋置于0.02M的磷酸氢二钾溶液中透析5-7天,完成胶原的自组装过程。
(2)仿生矿化液(CMC液)的制备
将质量分数为1%的CMC加入2mM的K2HPO4溶液中,然后逐滴加入4mM的CaCl2相混合,静置2小时取上清。
(3)BMC支架的制备
将(1)中制备而得的胶原从透析袋中取出,去离子水超声清洗后置于盛有(2)中制备而得的CMC矿化液的容器中,37℃的条件下放置24小时或72小时。取出后用去离子水超声清洗,放入冷冻干燥机中冷冻干燥,从而制备得出仿生矿化三维多孔胶原支架。
(4)支架消毒将(3)中制备得的胶原支架在25kGy的剂量下进行Go60消毒。
对比例1
该对比例提供的是非矿化自组装胶原支架(NMC)的制备方法:
(1)Ⅰ型胶原的提取与自组装同实施例1中步骤(1);
(2)NMC支架制备将(1)中制备而得的胶原从透析袋中取出,去离子水超声清洗后置于盛有去离子水的容器中,37℃的条件下放置72小时。取出后放入冷冻干燥机中冷冻干燥,从而制备得非矿化自组装胶原支架。
(3)支架消毒方法同实施例1中步骤(4)
对比例2
该对比例提供的是传统矿化胶原支架(TMC)的制备方法:
(1)Ⅰ型胶原的提取与自组装同实施例1中步骤(1)
(2)模拟体液(SBF液)制备SBF溶液的制备:将NaCl、NaHCO3、KCl、K2HPO4·3H2O、MgCl2·6H2O、CaCl2、Na2SO4、Tris依次加入1L的去离子水中,用浓度为1M的HCl调节pH值为7.25-7.4。
(3)TMC支架的制备
将(1)中制备而得的胶原从透析袋中取出,去离子水超声清洗后置于盛有(2)中制备而得的SBF溶液的容器中,37℃的条件下放置24或72小时。取出后用去离子水清洗,然后放入冷冻干燥机中冷冻干燥,从而制备得传统矿化胶原支架。
(4)支架消毒方法同实施例1中步骤(4)
将实施例1、对比例1以及对比例2分别制备BMC、TMC、NMC支架材料进行骨缺损组骨组织再生作用的相关实验。
1、BMC、TMC和NMC的表征。
1)扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)观察支架材料表面微观形貌。
样品经冷冻干燥后喷金进行扫描电镜观察,比较各组样品表面形貌的差异。结果如图2中a,b,c。
2)透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察支架材料内部微观形貌。
样品冻干后超薄切片于金网上,用TEM来表征其内部形貌。NMC支架使用醋酸铀负染后进行观察,BMC与TMC支架不染色。并用仪器附带的原位电子衍射功能判断无机物是结晶状态还是无定形状态。结果如图2中d,e,f所示。
3)X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)定性确定支架材料无机矿物质(主要为Ca、P)含量。
通过XRD技术定性分析胶原支架的矿化程度。通过不同元素对应的峰强度值用软件Origin.8.0作图。样本在测试前在真空干燥箱内干燥24小时。结果如图3所示。
2、支架材料机械性能的对比
三种支架材料干燥状态下杨氏模量测定
将冻干后的材料裁剪成长度(mm)×宽度(mm)×厚度(mm)为5×5×2的相同大小,在干燥或者湿润(置于PBS中浸泡30min)于拉力测试仪((3367,Instron,USA)下以10mm/min速度进行检测,用以评估材料的杨氏模量。实验结果如图4所示。
3、细胞实验(体外实验)
1)小鼠前成骨细胞接种支架材料后细胞增殖水平测定
将小鼠前成骨细胞(3T3-E1)接种于Go60消毒后的支架材料上,分别于3、5、7天进行CCK-8试剂盒检测,结果如图5所示。
2)小鼠前成骨细胞接种支架材料后成骨分化水平测定
将小鼠前成骨细胞(3T3-E1)接种于Go60消毒后的支架材料上,分别于3、5、7天进行ALP试剂盒检测,结果如图5所示。
3)小鼠前成骨细胞接种材料后死活细胞染色
将小鼠前成骨细胞(3T3-E1)接种于Go60消毒后的支架材料上,于3后天进行AO/EB染色后于激光共聚焦下观察细胞形态及死活细胞的分布。结果如图6所示。
4、动物实验(体内实验)
1)建造SD大鼠颅盖骨缺损模型
将8周龄250g雄性大鼠头部皮肤备皮,消毒,切开,用环钻取直径为5mm的贯通性缺损。如图7所示。
2)不同支架材料修复大鼠颅盖骨缺损
将不同的消毒后的支架材料置于缺损中,逐层缝合。
3)不同时间段三种材料修复的颅盖骨微计算机断层扫描(Micro ComputedTomography,Micro-CT)对比新骨生成情况
将各组大鼠分别于4周、8周进行处死后头盖骨微计算机断层扫描以研究新骨形成情况。结果如图8所示。
4)不同时间段三种材料修复的颅盖骨免疫组化染色分析
将各组大鼠分别于4周、8周进行处死后头盖骨病理切片,然后进行HE(图9)和Masson染色(图10)。
实验结果
如图2所示,SEM可见,支架材料中胶原纤维纵横交织成网状结构,未矿化胶原纤维(NMC)较为纤细;传统矿化胶原纤维(TMC)直径明显增大,表面无横纹结构,b图中尚可见未矿化完全的胶原纤维,以及由于矿化后硬度增加而出现的纤维断裂口;本发明所制备仿生矿化胶原(BMC)支架中可见明显的(D=67nm)横纹结构。TEM可见,负染后的未矿化胶原纤维(NMC)自主装完成,纤维中形成明显的横纹结构;传统矿化方法(TMC)由于形成的羟基磷灰石晶体较大无法进入胶原孔隙区而沉积于胶原纤维外部;本发明所述方法,可先形成粒径较小的(50nm左右)无定型磷酸钙(CMC/ACP),进而进入胶原纤维孔隙区及纤维之间在纤维内形成明显的横纹结构。
如图3所示,XRD特征峰结果可见,矿化初期传统矿化方法形成了大量的羟基磷灰石故而无法完成胶原纤维内部的矿化,而本发明所述方法在相同条件下无机矿物质大多数属于无定型状态,即CMC/ACP状态。
如图4所示,在干燥和湿润状态下,BMC支架的杨氏模量均高于TMC高于NMC,其差异具有统计学意义。
如图5所示,CCK-8结果显示,BMC支架可以显著促进3T3-E1的增殖;ALP结果显示,在接种初期,TMC支架ALP表达较高,但在3天之后(包括3天),BMC支架中细胞ALP表达更高。
如图6所示,3T3-E1接种3天后,在BMC支架数量较多,形态较好;TMC支架次之;NMC支架细胞数量较少,分布成团聚样。
如图8、9、10所示,8周时BMC组明显新生骨量明显多于其余组,12周时BMC已基本完全修复。新骨形成量中,BMC支架组最多,且新骨大部分沿着缺损边缘生长,中心部少量成骨,8周时,仅可见少量未降解材料,HE染色可见毛细血管、红细胞、淋巴细胞及成骨细胞,12周时缺损区完全修复。TMC支架,4周时可见部分为降解材料,8周时未降解材料少见。12周时,缺损未完全修复,缺口较小。NMC支架,4周时少见未降解材料,新骨形成较少,8周时无未降解材料,新骨形成速度慢,12周时,缺损未完全修复,缺口较大。可见BMC支架组,新骨形成量大,大部分沿着缺损区边缘生长,局部可见新生骨岛,组织间还可见淋巴细胞、红细胞、毛细血管及成骨细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种纤维内外协同矿化胶原支架的制备方法,其特征在于:该支架包括I型胶原纤维以及由羧甲基壳聚糖稳定的无定型磷酸钙复合物,以I型胶原纤维为支架结构,并利用羧甲基壳聚糖使其实现内外协同矿化;所述I性胶原纤维为I型鼠尾胶原;
所述制备方法,包括如下步骤,
1)Ⅰ型胶原纤维的提取与自组装;
2)仿生矿化液的制备:将1~3mM的K2HPO4在质量分数0.5~1.5%的羧甲基壳聚糖稳定下与3~5mM的CaCl2相混合,静置1~3小时;
3)纤维内外协同矿化胶原支架的制备:将步骤1)制备的胶原纤维从透析袋中取出,去离子水超声清洗后,置于步骤2)所述仿生矿化液中,30~45℃的条件下放置50~90小时;取出后用去离子水超声清洗,放入冷冻干燥机中冷冻干燥;
步骤1)中的Ⅰ型胶原纤维的提取与自组装包括如下步骤,
A)将新鲜6~10周龄SD大鼠鼠尾浸泡于质量分数为65~85%乙醇溶液中10~20分钟;
B)取出后去除鼠尾皮肤,提取鼠尾腱,将提取的鼠尾腱置于Tris-HCl-NaCl缓冲溶液中,在1~7℃环境下浸泡20~28小时;
C)鼠尾腱取出后用去离子水冲洗,置于0.2~0.4M的醋酸溶液中,在室温下持续搅拌2~4天,得到胶原的醋酸溶液;
D)将步骤C)得到胶原的醋酸溶液在0~4℃,2000~4000r/min的条件下离心20~40分钟后取上清,放入透析袋中;
E)将透析袋置于0.015~0.025M的磷酸氢二钾溶液中透析5-7天,完成胶原的自组装过程。
2.根据权利要求1所述的纤维内外协同矿化胶原支架的制备方法,其特征在于:所述步骤E)中,磷酸氢二钾溶液的浓度为0.02M。
3.根据权利要求1所述的纤维内外协同矿化胶原支架的制备方法,其特征在于:所述步骤2)中,K2HPO4的浓度为2mM,羧甲基壳聚糖的质量分数为1%,CaCl2的浓度为4mM。
4.根据权利要求1所述的纤维内外协同矿化胶原支架的制备方法,其特征在于:所述步骤3)中,胶原纤维置于步骤2)制备的仿生矿化液后,在37℃的条件下放置72小时。
5.根据权利要求1~4任一项所述的纤维内外协同矿化胶原支架的制备方法制备的胶原支架在制备骨组织修复的药物中的应用。
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