CN113082293A - 一种仿生矿化胶原成骨支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医用材料技术领域，具体公开了一种仿生矿化胶原成骨支架及其制备方法。制备方法包括：S1.向TBS缓冲液中分别加入氯化钙和磷酸氢二钾，在含有氯化钙的TBS缓冲液中加入羧甲基壳聚糖，加入含有磷酸氢二钾的TBS缓冲液，得仿生矿化液；S2.提取鼠尾肌腱纤维，洗净，浸于丙酮中浸泡，再置于缓冲液中浸泡，冲洗，置于醋酸中完全溶解，离心，取上清液，透析，进行胶原自组装得胶冻状物质，冻干，得鼠尾胶原支架；S3.将鼠尾胶原支架浸入仿生矿化液中矿化，冻干。本发明通过设定羧甲基壳聚糖的浓度及分子量范围协同制备的支架的矿化效率高，细胞活性佳，还可以促进骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和成骨向分化。

Description

一种仿生矿化胶原成骨支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其是涉及一种仿生矿化胶原成骨支架及其制备方法。
背景技术
现临床治疗颌骨缺损的常用方法为自体骨移植和骨胶原填充。自体骨移植的移植骨量受限，且易引起移植区骨量不足或供骨区创伤或感染等并发症。异体骨移植则难以处理其引起的排异反应。
骨组织工程技术可有效规避传统材料的缺点，成为当今的研究热点。骨组织工程主要由支架材料、种子细胞和细胞因子三部分构成，其中支架材料的开发是骨组织工程的重要分支。胶原支架是一类传统的支架材料，具有生物相容性好、免疫原性低和可生物吸收的优势，但其机械性能不良，操作性差，且在体内环境吸收过快，难以维持骨缺损完全修复所需时间，容易导致骨缺损回复不良。
矿化的胶原支架的开发，可以有效避免单纯胶原支架机械性能不良和吸收过快的问题。胶原支架的矿化方式主要分为传统矿化和纤维内矿化。在传统矿化技术中，磷酸根离子和钙离子在胶原支架表面成核后呈二维片状生长，逐渐形成片状羟基磷灰石覆盖胶原表面，不能进入胶原纤维内的空隙，这种形式又称为纤维外矿化。羟基磷灰石覆盖在胶原表面屏蔽了胶原的活性基团，导致其表面化学性质和形貌特征与天然骨组织的差异较大，诱导骨形成相关细胞的黏附、迁移、分化能力较差。而生物骨组织的矿化结构并不是如此形成，在非胶原蛋白如成牙本质基质蛋白、牙本质磷蛋白、骨桥蛋白、骨涎蛋白等的诱导下，骨组织矿化晶体在胶原纤维内部有序沉积，以纤维内矿化的形式存在。纤维内矿化胶原支架由聚电解质模拟体内骨桥蛋白、骨钙蛋白等非胶原蛋白，使钙磷离子进入胶原纤维内水仓后再结晶矿化，在胶原内部形成羟基磷灰石。纤维内矿化支架具有更好的机械性能，并保护了胶原的表面化学结构，维持了良好的生物活性。但是目前现有的纤维内矿化的胶原支架诱导胶原纤维矿化的效果较差，且需要添加种子细胞及生长因子，因此还有改善的空间。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种仿生矿化胶原成骨支架及其制备方法，本发明的仿生矿化胶原成骨支架矿化效率高，易于制备、价格低廉、机械性能好、细胞活性佳，还可以促进骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和成骨向分化。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，提供了一种仿生矿化胶原成骨支架的制备方法，其包括以下步骤：
S1.向TBS缓冲液中分别加入氯化钙和磷酸氢二钾，形成含有氯化钙的TBS缓冲液和含有磷酸氢二钾的TBS缓冲液，在含有氯化钙的TBS缓冲液中加入羧甲基壳聚糖，再加入与含有氯化钙的TBS缓冲液等体积的含有磷酸氢二钾的TBS缓冲液，制备成仿生矿化液；
S2.提取鼠尾肌腱纤维，洗净，浸于丙酮中浸泡，再置于缓冲液中浸泡，然后冲洗鼠尾肌腱纤维，将鼠尾肌腱纤维置于醋酸中完全溶解，离心，取上清液，透析，进行胶原自组装得胶冻状物质，冻干，得冻干的鼠尾胶原支架；
S3.将步骤S2制得的鼠尾胶原支架浸入步骤S1制备的仿生矿化液中矿化，然后冻干得仿生矿化胶原成骨支架；
所述步骤S1中仿生矿化液含羧甲基壳聚糖的浓度为50～200μg/ml，所述羧甲基壳聚糖的分子量为20kDa～150kDa。
本发明选择鼠尾肌腱纤维，因其主要成分为I型胶原，与骨组织的胶原结构相同，且获取成本低，易于提取，是进行成骨胶原支架相关研究的理想选择。
羧甲基壳聚糖(CMC)分子具有大量的游离羧基，可以在溶液中螯合钙离子，将磷酸钙稳定为一种非结晶、非溶解态、具有一定流动性的无定形状态，称为无定形磷酸钙(ACP)。ACP通过CMC的诱导，可以在一定条件下进入胶原纤维内部发生矿化，形成纤维内矿化胶原支架。
本发明人经过大量研究及试验发现，本发明利用羧甲基壳聚糖(CMC)的特性，意外得到当仿生矿化液含羧甲基壳聚糖的浓度为50～200μg/ml时，可以更有利地诱导新骨形成的纤维内矿化鼠尾胶原支架，重现与天然骨组织胶原类似的表面化学性质及形貌特征。
本发明通过协同调节羧甲基壳聚糖的分子量、浓度和矿化时间，以精细调控到精细调控鼠尾胶原支架仿生矿化，得到最优的结构和性能。所得到的仿生矿化胶原成骨支架具备良好的力学和生物学性能，可以促进骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和成骨向分化。在组织工程研究上，该支架可以为研究者提供一个易于制备、价格低廉、机械性能好、细胞活性佳的矿化支架材料。在临床上应用上，该技术制备的支架可以做到无需种子细胞及生长因子，一步式手术植入，有望实现较为理想的原位骨再生修复。
其中，当仿生矿化液含羧甲基壳聚糖的分子量为60kDa，浓度为100μg/ml或分子量为60kDa，浓度为200μg/ml或分子量为150kDa，浓度为200μg/ml时，胶原纤维表现为粗糙、融合片状或鼓胀质地，对应的仿生矿化液可以促进胶原纤维进一步组装，并诱导更高程度的纤维内矿化。
在步骤S2中丙酮主要去除肌腱纤维表面的脂质杂质残留，亦可选用异丙醇、乙醇等洗涤剂。提取胶原有酸法、碱法和盐法，其中酸法提取可以保护肽链的原始结构，利于胶原在自组装进程。
更优选地，鼠尾肌腱纤维置于4℃的醋酸中完全溶解。
胶原蛋白变性温度平均为37℃，本发明采用4℃保存条件，以防止温度过高导致的胶原变性。
作为本发明所述仿生矿化胶原成骨支架的制备方法的优选实施方式，所述步骤S1中仿生矿化液含羧甲基壳聚糖的浓度为200μg/ml。
作为本发明所述仿生矿化胶原成骨支架的制备方法的优选实施方式，所述羧甲基壳聚糖的分子量为20kDa或60kDa或150kDa。
分子量为20kDa或60kDa的羧甲基壳聚糖诱导胶原纤维内矿化的效率较分子量为150kDa的羧甲基壳聚糖低。
作为本发明所述仿生矿化胶原成骨支架的制备方法的优选实施方式，所述步骤S1中添加的羧甲基壳聚糖在含有氯化钙的TBS缓冲液的浓度为400μg/ml。
作为本发明所述仿生矿化胶原成骨支架的制备方法的优选实施方式，所述步骤S2中醋酸的浓度为0.3mol/L。
作为本发明所述仿生矿化胶原成骨支架的制备方法的优选实施方式，所述步骤S2中鼠尾肌腱纤维与醋酸的质量比为1:50。
作为本发明所述仿生矿化胶原成骨支架的制备方法的优选实施方式，所述步骤S3中矿化时间为1～14天。
更优选地，所述步骤S3中矿化时间为14天。
第二方面，提供了上述制备方法制得的仿生矿化胶原成骨支架。
第三方面，提供了上述仿生矿化胶原成骨支架在骨缺损修复材料中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种仿生矿化胶原成骨支架的制备方法，方法简单，通过设定羧甲基壳聚糖特定的浓度及分子量范围协同制备的仿生矿化胶原成骨支架的矿化效率高，机械性能好、细胞活性佳，还可以促进骨髓间充质干细胞的黏附、增殖和成骨向分化。
附图说明
图1为分子量为150kDa的羧甲基壳聚糖洗脱实验结果图；、
图2为实施例1及实施例6-13制备的仿生矿化液TEM及纳米粒径分析图；
图3为实施例1及实施例6-13制备的仿生矿化胶原成骨支架诱导胶原纤维矿化TEM结果图；
图4为实施例1及实施例6-13制备的仿生矿化胶原成骨支架SEM结果图；
图5为实施例1及实施例实施例6-7制备的仿生矿化胶原成骨支架FTIR结果；
图6为仿生矿化胶原成骨支架、传统矿化胶原支架及空白胶原支架接种BMSCs后SEM结果图；
图7为仿生矿化胶原成骨支架、传统矿化胶原支架及空白胶原支架接种BMSCs后CCK8结果；
图8为仿生矿化胶原成骨支架、传统矿化胶原支架及空白胶原支架接种BMSCs后ALP结果；
图9为提取鼠尾肌腱纤维和SigmaⅠ型胶原纤维的FTIR图(A)和紫外分光光谱图结果(B)。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1、仿生矿化胶原成骨支架的制备
一种仿生矿化胶原成骨支架的制备方法，包括以下步骤：
S1.向pH＝7.4的TBS缓冲液中分别加入氯化钙和磷酸氢二钾，形成含有9mmol/L氯化钙的TBS缓冲液和含有4.2mmol/L磷酸氢二钾的TBS缓冲液，称为Tris-Ca溶液和Tris-P溶液，在Tris-Ca溶液中加入分子量为150kDa、浓度为400μg/ml的羧甲基壳聚糖，再加入与Tris-Ca溶液等体积的Tris-P溶液，制备成仿生矿化液，仿生矿化液中羧甲基壳聚糖的最终浓度为200μg/ml；
S2.提取鼠尾肌腱纤维，用pH＝7.4的TBS缓冲液洗净，浸于丙酮中浸泡5min，将鼠尾肌腱纤维再置于Tris-HCl-NaOH缓冲液(0.05mol/L，pH＝7.4)中浸泡24h，然后用去离子水冲洗鼠尾肌腱纤维，将鼠尾肌腱纤维以1g：50ml的比例置于0.3mol/L的醋酸中4℃搅拌3d至完全溶解，将溶液进行4℃3000r/min高速离心，取上清液，置于0.02mol/L磷酸氢二钾溶液中透析3-5d，进行胶原自组装得胶冻状物质，冻干，得冻干的鼠尾胶原支架；
S3.将步骤S2制得的鼠尾胶原支架浸入步骤S1制备的仿生矿化液中矿化，每24h更换矿化液，矿化14天后取出后冻干，得仿生矿化胶原成骨支架。
实施例2、仿生矿化胶原成骨支架的制备
与实施例1相比，区别仅在于，矿化时间为1天。
实施例3、仿生矿化胶原成骨支架的制备
与实施例1相比，区别仅在于，矿化时间为3天。
实施例4、仿生矿化胶原成骨支架的制备
与实施例1相比，区别仅在于，矿化时间为5天。
实施例5、仿生矿化胶原成骨支架的制备
与实施例1相比，区别仅在于，矿化时间为7天。
实施例6、仿生矿化胶原成骨支架的制备
与实施例1相比，区别仅在于，羧甲基壳聚糖的分子量为20kDa。
实施例7、仿生矿化胶原成骨支架的制备
与实施例1相比，区别仅在于，羧甲基壳聚糖的分子量为60kDa。
实施例8、仿生矿化胶原成骨支架的制备
与实施例1相比，区别仅在于，仿生矿化液中羧甲基壳聚糖的最终浓度为50μg/ml。
实施例9、仿生矿化胶原成骨支架的制备
与实施例1相比，区别仅在于，仿生矿化液中羧甲基壳聚糖的最终浓度为100μg/ml。
实施例10、仿生矿化胶原成骨支架的制备
与实施例1相比，区别仅在于，羧甲基壳聚糖的分子量为60kDa，仿生矿化液中羧甲基壳聚糖的最终浓度为100μg/ml。
实施例11、仿生矿化胶原成骨支架的制备
与实施例1相比，区别仅在于，羧甲基壳聚糖的分子量为60kDa，仿生矿化液中羧甲基壳聚糖的最终浓度为50μg/ml。
实施例12、仿生矿化胶原成骨支架的制备
与实施例1相比，区别仅在于，羧甲基壳聚糖的分子量为20kDa，仿生矿化液中羧甲基壳聚糖的最终浓度为100μg/ml。
实施例13、仿生矿化胶原成骨支架的制备
与实施例1相比，区别仅在于，羧甲基壳聚糖的分子量为20kDa，仿生矿化液中羧甲基壳聚糖的最终浓度为50μg/ml。
试验例一、洗脱实验
分别以矿化和脱矿牙本质进行分子量为150kDa的羧甲基壳聚糖洗脱实验，结果显示两组洗脱溶液体积无统计学差异(图1)。该结果明确分子量为150kDa的羧甲基壳聚糖无法进入胶原纤维内。
因此，本发明应用分子量为150kDa的羧甲基壳聚糖在胶原纤维外发挥其稳定无定形磷酸钙，抑制结晶的作用，从而诱导出与天然骨结构类似的纤维内矿化胶原支架。
试验例二、仿生矿化液的表征
采用透射电子显微镜(TEM)观察实施例1及实施例6-13的制备的仿生矿化液，含有不同分子量及浓度的羧甲基壳聚糖的仿生矿化液的表征图如图2所示。
采用透射电子显微镜(TEM)观察含有不同分子量(20kDa、60kDa、150kDa)及浓度(50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)的羧甲基壳聚糖诱导胶原矿化7d所得仿生矿化胶原成骨支架的表征图如图3所示。
如图2所示，TEM显示仿生矿化液中纳米颗粒的粒径随羧甲基壳聚糖浓度的升高而减小；不同分子量(20kDa、60kDa、150kDa)同一浓度(200μg/ml)羧甲基壳聚糖的仿生矿化液中纳米颗粒，SAED(110kV)为无定形相，纳米粒径分析结果显示粒径约为50nm。上述结果表明羧甲基壳聚糖具有稳定无定形磷酸钙的能力，且仿生矿化液的稳定性随羧甲基壳聚糖浓度的升高而增强。
如图3所示，TEM下观察不同分子量及浓度的羧甲基壳聚糖诱导胶原矿化7d所得支架，20k-200(分子量为20kDa、浓度200μg/ml羧甲基壳聚糖的仿生矿化液，下同)、60k-100、60k-200及150k-200组均显示为较典型的纤维内矿化特征，其余组观察到不同程度的纤维外矿物沉积。结合抑制剂尺寸排除理论，分子量大于60kDa的羧甲基壳聚糖可部分或完全被排除在胶原外，随着羧甲基壳聚糖浓度的升高均可使无定形磷酸钙保持稳定，从而诱导纤维内矿化。
试验例三、仿生矿化胶原成骨支架生物学性能试验
不同羧甲基壳聚糖浓度诱导的仿生矿化胶原成骨支架表面形貌和表面化学特性具有较大差异(参照图4、5)。
不同分子量及浓度的羧甲基壳聚糖诱导仿生矿化胶原成骨支架的SEM结果(如图4)显示，不同组仿生矿化胶原支架呈现不同的表面形貌，60k-100(分子量为60kDa、浓度100μg/ml羧甲基壳聚糖的仿生矿化液，下同)、60k-200、150k-200组胶原纤维表现为粗糙、融合片状或鼓胀质地，表明这些组别对应的仿生矿化液可能促进胶原纤维进一步组装，并诱导更高程度的纤维内矿化；20k-50组胶原纤维呈现横纹样的未矿化特征；其余组观察到不同程度的胶原纤维横纹消失、表面均匀的内矿化特征。
对200μg/ml不同分子量羧甲基壳聚糖诱导的仿生矿化胶原成骨支架(实施例1及实施例6-7)及空白胶原支架进行FTIR分析(如图5)，60k-200及150k-200组仿生矿化支架中碳酸羟基磷灰石与胶原酰胺I带、II带特征峰同时存在，且150k-200组中磷灰石υ3PO4/胶原酰胺I带的峰值比显著高于其余组胶原支架，表明该组的矿化程度更高；碳酸羟基磷灰石特征峰在20k-200组及空白胶原支架中较弱。
试验例四、仿生矿化胶原成骨支架对骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附、增殖和成骨 向分化的调控作用
将骨髓间充质干细胞(BMSCs)分别接种于仿生矿化胶原成骨支架(实施例1)、传统矿化胶原支架及空白胶原支架，评估仿生矿化胶原成骨支架的对BMSCs的黏附、增殖和成骨向分化的调控作用。
对三组接种BMSCs的矿化支架进行SEM观察(参考图6)，结果显示未矿化支架组细胞呈球形，伪足数目与长度均较少；传统矿化组细胞呈球形，伪足数目较未矿化组明显增多；本发明的仿生矿化胶原成骨支架的表面细胞呈扁平状，较空白支架和传统矿化支架组细胞伸展度更高，提示仿生矿化胶原成骨支架可以很大程度促进BMSCs的黏附过程。
三组接种BMSCs的矿化支架细胞CCK8结果(参考图7)，24h三组细胞吸光度无明显差异。48h和72h本发明的仿生矿化胶原成骨支架组的吸光度明显高于另外传统矿化组和未矿化组，表明仿生矿化支架在促进BMSCs增殖方面具有更大的优势。
三组接种BMSCs的矿化支架ALP结果(参考图8)，三种矿化支架组BMSCs成骨活性均明显提高，提示矿化支架均可促进BMSCs成骨向分化。3d组未矿化支架的细胞成骨活性相对较高，而随着时间的推移，5d后仿生矿化胶原成骨支架组细胞成骨活性明显高于另外三组。表明仿生矿化胶原成骨支架促进BMSCs成骨向分化在长期来看具有更明显的优势。
参考图9为提取鼠尾肌腱纤维和SigmaⅠ型胶原纤维的FTIR图(A)和紫外分光光谱图结果(B)，以上实验均以鼠尾肌腱纤维为原材料构建仿生矿化胶原成骨支架，FTIR和紫外分光光谱结果表明，提取的鼠尾Ⅰ型胶原含有胶原蛋白的结构特征，且3股螺旋结构完整。
对实施例1-5(1d、3d、5d、7d、14d)的矿化效率进行了比较，结果表明羧甲基壳聚糖诱导胶原纤维矿化14d可以使其获得更理想的矿化程度。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种仿生矿化胶原成骨支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.向TBS缓冲液中分别加入氯化钙和磷酸氢二钾，形成含有氯化钙的TBS缓冲液和含有磷酸氢二钾的TBS缓冲液，在含有氯化钙的TBS缓冲液中加入羧甲基壳聚糖，再加入与含有氯化钙的TBS缓冲液等体积的含有磷酸氢二钾的TBS缓冲液，制备成仿生矿化液；
S2.提取鼠尾肌腱纤维，洗净，浸于丙酮中浸泡，再置于缓冲液中浸泡，然后冲洗鼠尾肌腱纤维，将鼠尾肌腱纤维置于醋酸中完全溶解，离心，取上清液，透析，进行胶原自组装得胶冻状物质，冻干，得冻干的鼠尾胶原支架；
S3.将步骤S2制得的鼠尾胶原支架浸入步骤S1制备的仿生矿化液中矿化，然后冻干得仿生矿化胶原成骨支架；
所述步骤S1中仿生矿化液含羧甲基壳聚糖的浓度为50～200μg/ml，所述羧甲基壳聚糖的分子量为20kDa～150kDa。
2.如权利要求1所述的仿生矿化胶原成骨支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中仿生矿化液含羧甲基壳聚糖的浓度为200μg/ml。
3.如权利要求1所述的仿生矿化胶原成骨支架的制备方法，其特征在于，所述羧甲基壳聚糖的分子量为20kDa或60kDa或150kDa。
4.如权利要求1所述的仿生矿化胶原成骨支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中添加的羧甲基壳聚糖在含有氯化钙的TBS缓冲液的浓度为400μg/ml。
5.如权利要求1所述的仿生矿化胶原成骨支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中醋酸的浓度为0.3mol/L。
6.如权利要求1所述的仿生矿化胶原成骨支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中鼠尾肌腱纤维与醋酸的质量比为1:50。
7.如权利要求1所述的仿生矿化胶原成骨支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中矿化时间为1～14天。
8.如权利要求7所述的仿生矿化胶原成骨支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中矿化时间为14天。
9.如权利要求1～8任一项所述的制备方法制得的仿生矿化胶原成骨支架。
10.如权利要求9所述的仿生矿化胶原成骨支架在骨缺损修复材料中的应用。
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