CN102512710A - 一种丝素蛋白多孔三维材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种丝素蛋白多孔三维材料的制备方法，通过将丝素蛋白溶液进行浓缩处理，然后用处理后的丝素蛋白溶液通过盐析法制成支架。利用丝蛋白的自组装行为，改变丝素蛋白二级结构。因此获得的多孔支架同其它方法相比，不仅具有良好的成孔性，而且孔的内壁具有十分明显的微细结构。
Description
技术领域
本发明涉及一种多孔材料及其制备方法，特别涉及一种以丝素蛋白为原料，制备具有特定纳米结构和二级结构组成的三维多孔材料的技术。
背景技术
组织工程是在可降解的多孔支架材料上种植人体活细胞，使之在生长因子的作用下再生活的组织或器官，用于修复或替代受损伤组织或器官的能。现已开发应用的作为组织工程支架的生物医用材料主要有硅橡胶、聚氨酯、聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)和胶原蛋白等。理想的细胞支架材料应具有良好的孔隙率、生物相容性和可降解性，还需具备一定的机械特性。但硅橡胶、聚氨酯等合成材料的生物相容性、理化性能、降解速率的控制及缓释性等方面尚有许多问题未得到解决，且价格昂贵。
蚕丝中富含的丝素蛋白以其特殊的生物学特性和良好的人体亲和性越来越受到人们的关注。丝素蛋白具有良好的生物相容性，对机体无毒性，无致敏和刺激作用，又可部分生物降解，其降解产物本身不仅对组织无毒副作用，还对如皮肤、牙周组织等有营养与修复的作用。大量研究证明，丝素蛋白基组织工程支架能够应用于骨、皮肤、血管、神经、肝、软骨、韧带多种组织的再生。同时，丝素蛋白开始被应用于药物缓释领域，丝素蛋白薄膜或凝胶作为药物释放的载体，表现出良好的控释效果。丝素蛋白在这些领域表现出巨大的应用前景。
目前，对于丝蛋白多孔材料的制备与应用已是近年来材料学家研究的热点。现有技术中，采用丝素蛋白制备三维多孔支架的方法有盐析法、气体发泡法、冷冻干燥法、静电纺丝法以及相分离法等。例如：
(1)公开号为CN1262579C的中国发明专利“丝素蛋白海绵状三维多孔材料制备方法”中，需要采用甲醇或者乙醇作为变性剂，促使丝素II结构形成，提高丝素蛋白在水中稳定性，同样地，因为降解缓慢，不可调控，而且有机溶剂的使用可能会对生物相容性带来负面影响。
(2)公开号为CN101502669A的中国发明专利“丝素蛋白多孔三维支架及其制备方法”中，采用冷冻干燥法制备三维支架，避免了有机溶剂使用，但其支架孔隙率不高，仍然存在分离片状结构，且蛋白的纳米结晶结构无法调控。
(3)公开号为CN1844509A的中国发明专利“一种丝素蛋白多孔结构材料的制备方法”中，采用静电纺丝制备多孔支架，但其孔径较小，同时也难以获得复杂结构的多孔支架。
目前，盐析法仍然是制备丝蛋白多孔支架的最主要的方法之一，然而，传统的盐析法制备的丝蛋白多孔支架存在硬度高，结晶度高，多孔支架孔壁表面结构无法调控的问题，不适用于软组织的修复。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是在传统盐析的基础上，通过对丝蛋白结构的调控，提供一种丝蛋白微纳结构可调，二级结构可变的丝素蛋白多孔材料的制备方法，进而实现对丝蛋白细胞相容性、力学性能和降解性能的改变和调整，克服现有技术所得丝素蛋白多孔支架材料存在的硬度高、降解过于缓慢、微纳结构不可控的缺陷，所得产品生物降解性好、孔隙率高、结晶结构可调、仿生性优异，具有更好的促进组织修复，特别是软组织修复的性能。
为达到上述目的，本发明的技术方案包括以下步骤：
(1)制备丝素蛋白溶液，该丝素蛋白溶液具有第一浓度；
(2)对所述丝素蛋白溶液进行浓缩处理，使该丝素蛋白溶液具有第二浓度，所述第二浓度大于第一浓度；
(3)调整浓缩后的丝素蛋白溶液的质量分数，使所述丝素蛋白溶液的质量分数为4％至9％；
(4)利用盐析法，以氯化钠为成孔剂将上述丝素溶液制成支架并静置，然后去除所述支架中的氯化钠得到海绵组织；
(5)将所述海绵组织干燥处理后，获得干态的丝素蛋白多孔材料。
优选的，所述步骤(1)中制备丝素蛋白水溶液包括步骤：
(1.1)将蚕丝放在碳酸钠溶液中进行脱胶处理并烘干，去除蚕丝外部的丝胶蛋白；
(1.2)以溴化锂溶液对所述脱胶之后的蚕丝进行溶解处理；
(1.3)对所述溶有蚕丝的溴化锂溶液进行透析处理，去除溶液中的溴化锂以获得该具有第一浓度的丝素蛋白溶液。
优选的，所述透析处理包括：将所述溶有蚕丝的溴化锂溶液用截留分子量3500的透析袋浸在去离子水中透析3天，期间每两小时换一次水。
优选的，所述第一浓度的值为6％，所述第二浓度的值为25％至40％。。
优选的，所述浓缩处理包括：将丝素蛋白溶液放置于20℃至80℃环境下进行浓缩，浓缩时间为8小时至160小时。
优选的，在所述步骤(2)中，将丝素蛋白溶液浓缩处理后，还包括在0℃-40℃环境下放置2-21天，以促进丝素蛋白组装成纳米线结构。
优选的，所述步骤(4)中的静置时间至少大于12小时。
优选的，所述步骤(5)中的干燥处理为冷冻干燥处理，该冷冻干燥包括：将海绵组织在-20℃的低温条件下经过12小时以上冷冻，获得冷冻体；将冷冻体放入冻干机干燥72小时，获得干态的丝素蛋白多孔材料。
优选的，所述步骤(5)中的干燥处理为缓慢干燥处理，该缓慢干燥包括：将海绵组织在室温下进行自然干燥处理，所述干燥的时间为1小时-48小时。
优选的，所述步骤(5)中的干燥处理为快速干燥处理，该快速干燥包括：将海绵组织在50℃-90℃烘箱中快速干燥。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
第一：本发明通过将丝素蛋白溶液进行浓缩处理，然后用处理后的丝素蛋白溶液通过盐析法制成支架。其本质是利用丝蛋白的自组装行为，改变丝素蛋白二级结构。因此获得的多孔支架同其它方法相比，不仅具有良好的成孔性，而且孔的内壁具有十分明显的微细结构。
第二：由于本发明在制备过程中是用NaCl作为成孔剂，成型后用水将NaCl去除，不需添加其它化学试剂，无毒副作用，不会引起丝素蛋白支架生物相容性降低。
第三：本发明可以在制备过程中，通过调节浓缩时间，静置时间、丝素溶液浓度等工艺参数调控支架材料中丝素I与丝素II及无规卷曲结构的含量，从而获得具有不同的降解性能和力学性能的丝素蛋白支架材料。满足不同组织修复的需要。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的一种丝素蛋白多孔三维材料制备方法的流程图；
图2是实施例一所述的经浓缩处理后的丝素溶液经盐析法所得丝蛋白支架真空干燥后的电镜图；
图3是实施例二所述的经浓缩处理后的丝素溶液经盐析法所得丝蛋白支架真空干燥后的电镜图；
图4是本发明的蚕丝蛋白支架与未经浓缩处理的普通蚕丝蛋白支架的FTIR测试比较图；
图5是本发明的蚕丝蛋白支架与未经浓缩处理的普通蚕丝蛋白支架的X射线衍射(XRD)分析比较图；
图6是本发明的蚕丝蛋白支架与未经浓缩处理的普通蚕丝蛋白支架的酶降解分析比较图。
具体实施方式
请参见图1，图1是本发明的一种丝素蛋白多孔三维材料制备方法的流程图，如图所示，该制备方法包括步骤：
S11：制备丝素蛋白溶液，该丝素蛋白溶液具有第一浓度；
S12：对所述丝素蛋白溶液进行浓缩处理，使该丝素蛋白溶液具有第二浓度，所述第二浓度大于第一浓度；
S13：调整浓缩后的丝素蛋白溶液的质量分数，使所述丝素蛋白溶液的质量分数为4％至9％；
S14：利用盐析法，以氯化钠为成孔剂将上述丝素溶液制成支架并静置，然后去除所述支架中的氯化钠得到海绵组织；
S15：将所述海绵组织干燥处理后，获得干态的丝素蛋白多孔材料。
步骤S11通过常规手段制备丝素蛋白溶液，所获得的溶液浓度一般在6％左右。
步骤S12将上述丝素蛋白溶液进行浓缩，该浓缩过程实质是让溶液中的丝素蛋白进行自组装行为，目的是为了改变丝素蛋白二级结构，从而获得的多孔支架同其它方法相比，不仅具有良好的成孔性，而且孔的内壁具有十分明显的微细结构。
步骤S14中采用氯化钠(NaCl)作为成孔剂对丝素蛋白溶液进行盐析处理，由于NaCl具有方便去除，无毒副作用等优点，所以不会引起丝素蛋白支架生物相容性降低等问题。
步骤S15中的干燥处理可包括：冷冻干燥处理、缓慢干燥处理和快速干燥处理等几种处理方式。
在整个制备过程中，可以通过控制浓缩时间、静置时间、丝素溶液浓度等工艺参数调控支架材料中丝素I与丝素II及无规卷曲结构的含量，从而获得具有不同的降解性能和力学性能的丝素蛋白支架材料。
下面将以几个具体实施方式详细说明本发明的丝素蛋白多孔三维材料制备方法。
实施例一：
制备丝素蛋白溶液。具体为：将50g蚕丝放入0.5％的Na2CO3溶液中进行脱胶处理并烘干，脱胶时以100℃煮沸1小时，以去除蚕丝外部的丝胶蛋白，使用去离子水冲洗，重复以上操作3次后将蚕丝60℃下烘干。称取上述处理后的脱胶蚕丝15g放入于100mL浓度为9.3mol/L的溴化锂(LiBr)溶液中进行溶解处理，溶解处理时在60℃下溶解4小时。然后对上述溶解有蚕丝的LiBr溶液进行透析处理，透析时用截留分子量3500的透析袋浸在去离子水中透析3天，期间每两小时换一次水，以去除溶液中的LiBr，从而得到纯净的丝素蛋白溶液，其浓度为6％。
将上述丝素蛋白溶液在60℃的环境下进行浓缩处理，浓缩时间为120小时，丝素蛋白浓缩后溶液浓度为25％。然后将丝素蛋白水溶液的质量分数调整为8％；
将丝素溶液经盐析法(NaCl粒径为350～450微米)制成支架，静置48小时后，在水中浸泡72小时，去除NaCl，得到海绵组织。
再放入-20℃下冷冻24小时得到冷冻体。放入冻干机干燥72小时后得到纳米丝蛋白多孔材料。
请参见图2，图2是实施例一所述的经浓缩处理后的丝素溶液经盐析法所得丝蛋白支架真空干燥后的电镜图。从图2可见，上述支架的孔直径约为389±15μm，孔壁上含有大量微球。
实施例二：
采用与实施例一相同的方法制备浓度为6％的纯净丝素蛋白溶液。
将丝素蛋白溶液在80℃的环境下进行浓缩处理，浓缩时间为8小时，丝素蛋白浓缩后溶液浓度为20％。然后将丝素蛋白水溶液的质量分数调整为4％；
将丝素溶液经盐析法制成支架，静置48小时后，在水中浸泡72小时，去除NaCl，得到海绵组织。
采用缓慢干燥处理方式，在室温下自然干燥后得到纳米丝蛋白多孔材料。
请参见图3，图3是实施例二的对上述丝素蛋白支架进行扫描电镜测试。发现支架孔径约为319±15μm，硬度比前处理相同的真空干燥支架增加。
实施例三：
采用与实施例一相同的方法制备浓度为6％的纯净丝素蛋白溶液。
将丝素蛋白溶液在20℃的环境下进行浓缩处理，浓缩时间为160小时，丝素蛋白浓缩后溶液浓度为28％。然后将丝素蛋白水溶液的质量分数调整为9％；
将丝素溶液经盐析法制成支架，静置48小时后，在水中浸泡72小时，去除NaCl，得到海绵组织。再放入-20℃下冷冻24小时得到冷冻体。放入冻干机干燥72小时后得到纳米丝蛋白多孔材料。
实施例四：
采用与实施例一相同的方法制备浓度为6％的纯净丝素蛋白溶液。
将丝素蛋白溶液在60℃的环境下进行浓缩处理，浓缩时间为100小时，丝素蛋白浓缩后溶液浓度为35％。然后将丝素蛋白水溶液的质量分数调整为8％；
将丝素溶液经盐析法制成支架，放置48小时后，在水中浸泡72小时，去除NaCl，得到海绵组织。再放入-20℃下冷冻24小时得到冷冻体。放入冻干机干燥72小时后得到纳米丝蛋白多孔材料。
实施例五：
采用与实施例一相同的方法制备浓度为6％的纯净丝素蛋白溶液。
将丝素蛋白溶液在60℃进行浓缩处理，浓缩时间为150小时，丝素蛋白浓缩后溶液浓度为40％。然后将丝素蛋白水溶液的质量分数调整为6％；
将丝素溶液经盐析法制成支架，静置48小时后，在水中浸泡72小时，去除NaCl，得到海绵组织。再放入-20℃下冷冻24小时得到冷冻体。放入冻干机干燥72小时后得到纳米丝蛋白多孔材料。
实施例六：
采用与实施例一相同的方法制备浓度为6％的纯净丝素蛋白溶液。
将丝素蛋白溶液在60℃进行浓缩处理，浓缩时间为48小时，丝素蛋白浓缩后溶液浓度为30％。将浓缩液在4℃放置20天，然后将丝素蛋白水溶液的质量分数调整为6％；
将丝素溶液经盐析法制成支架，放置48小时后，在水中浸泡72小时，去除NaCl，得到海绵组织。将海绵状多孔支架在60℃下快速干燥，获得干态的丝蛋白多孔支架。
实施例七：
采用与实施例一相同的方法制备浓度为6％的纯净丝素蛋白溶液。
将丝素蛋白溶液在60℃进行浓缩处理，浓缩时间为48小时，丝素蛋白浓缩后溶液浓度为30％。将浓缩液在37℃放置3天，然后将丝素蛋白水溶液的质量分数调整为6％；
将丝素溶液经盐析法制成支架，放置48小时后，在水中浸泡72小时，去除NaCl，得到海绵组织。
将海绵状多孔支架在室温下自然干燥，获得干态的丝蛋白多孔支架。
请参见图4，图4是本发明的蚕丝蛋白支架与未经浓缩处理的普通蚕丝蛋白支架的FTIR测试比较图。其中曲线a、b为所述经浓缩处理后的丝素溶液经盐析法所得丝蛋白支架的FTIR测试图，曲线c、d为未经浓缩处理丝素溶液经盐析法所得支架的对照图。通过对比表明经过浓缩处理后的丝蛋白溶液进行盐析法制备多孔支架，所获得支架具有更多的无规结构存在，有利于提高材料的韧性和亲水性。可能原因是丝素蛋白浓缩有利于形成更强的分子内亲水作用，使晶体转化实现困难。
请参见图5，图5是本发明的蚕丝蛋白支架与未经浓缩处理的普通蚕丝蛋白支架的X射线衍射(XRD)分析比较图。其中曲线a、b为未处理丝素溶液经盐析法所得支架的XRD曲线，曲线c、d为所述经浓缩处理后的丝素溶液经盐析法所得丝蛋白支架的XRD曲线。对本发明的丝素蛋白支架进行X-射线衍射分析，经过浓缩处理后的溶液制备支架XRD中的结晶峰强度减弱，峰宽增加，表明经浓缩处理后所制备多孔支架含有更多的非晶结构。
将本发明的支架材料切块，浴比1∶100做酶降解处理，如图6所示，其中曲线a为未经浓缩处理丝素溶液经盐析法所得支架的降解曲线，曲线b为所述经浓缩处理后的丝素溶液经盐析法所得丝蛋白支架的降解曲线。同直接使用未处理的丝蛋白作为原料所制备支架相比，经过浓缩处理后的溶液制备的多孔支架降解较快。
综上所述，本发明通过将丝素蛋白溶液进行浓缩处理，然后用处理后的丝素蛋白溶液通过盐析法制成支架。利用丝蛋白的自组装行为，改变丝素蛋白二级结构。因此获得的多孔支架同其它方法相比，不仅具有良好的成孔性，而且孔的内壁具有十分明显的微细结构。另外，由于本发明在制备过程中是用NaCl作为成孔剂，成型后用水将NaCl去除，不需添加其它化学试剂，无毒副作用，不会引起丝素蛋白支架生物相容性降低。并且本发明可以在制备过程中，通过调节浓缩时间，静置时间、丝素溶液浓度等工艺参数调控支架材料中丝素I与丝素II及无规卷曲结构的含量，从而获得具有不同的降解性能和力学性能的丝素蛋白支架材料。满足不同组织修复的需要。
上述实施例所得丝素蛋白三维支架材料可应用于软骨、韧带、神经、皮肤等组织修复以及药物缓释的载体等。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种丝素蛋白多孔三维材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备丝素蛋白溶液，该丝素蛋白溶液具有第一浓度；
(2)对所述丝素蛋白溶液进行浓缩处理，使该丝素蛋白溶液具有第二浓度，所述第二浓度大于第一浓度；
(3)调整浓缩后的丝素蛋白溶液的质量分数，使所述丝素蛋白溶液的质量分数为4％至9％；
(4)利用盐析法，以氯化钠为成孔剂将上述丝素溶液制成支架并静置，然后去除所述支架中的氯化钠得到海绵组织；
(5)将所述海绵组织干燥处理后，获得干态的丝素蛋白多孔材料。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中制备丝素蛋白水溶液包括步骤：
(1.1)将蚕丝放在碳酸钠溶液中进行脱胶处理并烘干，去除蚕丝外部的丝胶蛋白；
(1.2)以溴化锂溶液对所述脱胶之后的蚕丝进行溶解处理；
(1.3)对所述溶有蚕丝的溴化锂溶液进行透析处理，去除溶液中的溴化锂以获得该具有第一浓度的丝素蛋白溶液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述透析处理包括：将所述溶有蚕丝的溴化锂溶液用截留分子量3500的透析袋浸在去离子水中透析3天，期间每两小时换一次水。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述第一浓度的值为6％，所述第二浓度的值为25％至40％。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述浓缩处理包括：将丝素蛋白溶液放置于20℃至80℃环境下进行浓缩，浓缩时间为8小时至160小时。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，将丝素蛋白溶液浓缩处理后，还包括在0℃-40℃环境下放置2天-21天，以促进丝素蛋白组装成纳米线结构。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中的静置时间至少12小时。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中的干燥处理为冷冻干燥，该冷冻干燥包括：将海绵组织在-20℃的低温条件下经过至少12小时冷冻，获得冷冻体；将冷冻体放入冻干机干燥72小时，获得干态的丝素蛋白多孔材料。
9.如权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中的干燥处理为缓慢干燥处理，该缓慢干燥处理包括：将海绵组织在室温下进行自然干燥处理，所述干燥的时间为1小时-48小时。
10.如权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中的干燥处理为快速干燥处理，该快速干燥处理包括：将海绵组织在50℃-90℃烘箱中快速干燥。
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