CN103611193B - 一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料及其制备方法和应用，本发明的制备方法步骤简单易行，无需大型设备。制备得到的符合材料兼具有碳酸钙微球以及细胞外基质的优点，与单纯的碳酸钙微球材料或细胞外基质材料相比，具有很好生物相容性的同时具有很好的机械力学性能，更易于细胞黏附增值，在医学组织工程修复上有很高的应用前景和实用价值，能有效促进细胞的黏附生长、增殖、迁移和分化。
Description
技术领域
本发明属于组织工程领域，具体涉及一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
生物支架材料是组织工程学中一个非常重要的组成部分，它不仅是细胞和生物活性因子进入机体的载体，而且还可以支持细胞在体内的增殖和分化及分泌活性细胞因子。理想的脂肪组织工程支架应具有：①适于细胞粘附、增殖和分化的三维空间结构；②具有良好的机械力学性能，不仅与宿主软组织特性相匹配，还要能够抵抗软组织的压力支持种子细胞的生长发育；③具备良好组成成分，对组织无毒、无副作用、无免疫原性；④具有特殊的生物刺激作用，如促进细胞的增殖分化，促进血管生成,促进宿主干细胞的迁移和分化等。存在于细胞间的纤维状和球形蛋白质的网状系统称之为细胞外基质（ECM），ECM是细胞环境的一种重要组成部分，细胞分泌的各种ECM成分形成基质间质和基质膜，在体内细胞锚定在该构架上。这些结构提供了组织特异性组织学的机体形成和发展所需要的空间定位和稳定性。细胞外基质(ECM)包括胶原、非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、以及弹性蛋白,通过维持细胞存活、决定细胞形状、调节细胞增殖、控制细胞分化并参与细胞迁移来保持组织功能正常，维持新陈代谢旺盛，从而保持机体的年轻状态。成纤维细胞参与了多种细胞外基质成分分泌的过程，包括胶原蛋白、粘连蛋白、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素及弹性蛋白等的分泌调控。但是单纯使用细胞外基质(ECM)作为组织工程修复材料具有机械力学性能差，不能有效的抵抗软组织的压力等缺点。
目前国内外学者对碳酸钙在骨科组织工程方面进行了深入的研究：碳酸钙作为骨科组织工程材料，与传统的金属材料制品相比具有以下特点：①研究表明在碳酸钙结晶过程中添加特定的氨基酸和磷蛋白，可以生成球霰石(Vaterite)结晶。这种具有粗糙表面的微米级球形颗粒在体外实验中被证实有促进形成羟基磷灰石形成的作用；②较好的力学性能；③压电特性：碳酸钙材料受压后会产生电压，刺激刺激骨细胞的生长，促进骨愈合。但是单独的碳酸钙微球材料具有生物相容性差，难降解性以及亲水性差的缺点，不利于骨髓间充质干细胞的黏附以及生长。
发明内容
本发明的发明目的在于克服现有细胞外基质材料以及碳酸钙微球材料的不足，公开一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料的制备方法。
本发明另一个目的在于公开一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料。
本发明还有一个目的在于公开一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料的应用。
本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：
一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料的制备方法，包括如下步骤：
S1. 分别配制浓度为10mM~250mM钙盐水溶液和10mM~250mM碳酸盐水溶液；
S2. 将步骤S1制得的钙盐水溶液和碳酸盐水溶液搅拌混合、静置10min~90min，将沉淀过滤、洗涤、干燥即得碳酸钙微球；
S3. 将S2得到的碳酸钙微球60mg-70mg平铺在细胞培养容器中，用培养基浸泡，然后接种骨髓间充质干细胞，于CO2培养箱中培养5~10天，每隔2~3天更换培养基，接着进行脱细胞处理，最后干燥即可得到碳酸钙微球-细胞外基质复合材料。
优选地，步骤S2中所述搅拌混合的搅拌速度为100rpm/min~5000rpm/min。
优选地，步骤S2中所述钙盐水溶液和碳酸盐水溶液混合时钙离子和碳酸根离子的摩尔比为1:1。
优选地，所述钙盐为氯化钙、硝酸钙等可溶钙盐；所述碳酸盐为碳酸钠、碳酸钾等可溶碳酸盐。
优选地，步骤S2中所述干燥为冷冻干燥，冷冻干燥时间为24~72小时。
优选地，步骤S3中所述培养基中含有浓度为20~30mM的抗坏血酸。
步骤S3中接种骨髓间充质干细胞的密度为10000~30000/cm2，所述骨髓间充质干细胞为人源P3代骨髓间充质干细胞。
步骤S3中所述脱细胞的步骤为：将细胞培养容器放入-80℃冰箱冷冻5~10min，接着取出解冻，用去离子水冲洗细胞培养容器表面，循环操作2~6次。
优选地，所述解冻为室温解冻。
一种根据本发明碳酸钙微球-细胞外基质复合材料的制备方法制备得到的碳酸钙微球-细胞外基质复合材料。
本发明制备得到的碳酸钙微球-细胞外基质复合材料在组织工程领域中的应用。
本发明制备得到的碳酸钙微球-细胞外基质复合材料在间充质干细胞体外培养中的应用。
优选地，所述体外培养为细胞增殖、分化或迁移。
本发明制备得到的碳酸钙微球-细胞外基质复合材料中，碳酸钙微球既可以增强细胞外基质的强度、提高机械力学性能，同时碳酸钙微球表面具有的拓扑结构能增强细胞的粘附，与常规的平面培养相比更有利于细胞的迁移和细胞外基质的分泌。此外，本发明选用的骨髓间充质干细胞分泌的细胞外基质含有大量的胶原蛋白以及生长因子，这些都能促进细胞的粘附和增殖。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明公开一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料及其制备方法和应用，本发明的制备方法步骤简单易行，无需大型设备。制备得到的符合材料兼具有碳酸钙微球以及细胞外基质的优点，与单纯的碳酸钙微球材料或细胞外基质材料相比，具有很好生物相容性的同时具有很好的机械力学性能，更易于细胞黏附增值，在医学组织工程修复上有很高的应用前景和实用价值，能有效促进细胞的黏附生长、增殖、迁移和分化。
附图说明
图1为碳酸钙微球-细胞外基质复合材料电镜图；
图2为碳酸钙微球-细胞外基质复合材料免疫荧光染色图；
图3为碳酸钙微球-细胞外基质复合材料的细胞培养细胞活力（MTT）检测结果图；
图4为碳酸钙微球-细胞外基质复合材料FDA染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
实施例1-3
（一）碳酸钙微球-细胞外基质复合材料的制备
实施例1-3钙盐溶液和碳酸盐溶液的种类和浓度如表1所示。
表1
| 钙盐 | 碳酸盐 | |
| 实施例1 | 氯化钙 25mM | 碳酸钠 25mM |
| 实施例2 | 硝酸钙 100 mM | 碳酸钠 100mM |
| 实施例3 | 氯化钙 250 mM | 碳酸钾 250mM |
根据表1的种类和浓度配制钙盐水溶液和碳酸盐水溶液等体积混合，在1500 rpm/min条件下搅拌10分钟。放在室温条件下静置20分钟，然后冷冻干燥24小时。将获得的碳酸钙微球放入含有培养基的6孔板中（每孔65mg）浸泡3小时后，每孔接种密度为30000/cm2的骨髓间充质干细胞，放入95%，37℃的CO2培养箱培养7天，每2-3天换一次液。然后采用循环冷冻的方法脱细胞处理，使用浓度为0.25%戊二醛溶液固定24小时，放入冻干机冻干处理12小时得碳酸钙微球-细胞外基质复合材料粉末。
将实施例1中的碳酸钙-细胞外基质复合材料固定于样品台上，喷金处理，置于热场发射扫描电镜的真空室内， 15kV电压下观察，得到SEM观察图。产品如图1所示。
从图1可以看出，细胞外基质的网状结构很好的附着在碳酸钙微球表面，说明复合材料中碳酸钙微球很好的分散在细胞外基质当中。
（二）碳酸钙微球-细胞外基质复合材料免疫荧光染色
将实施例2制备得到的碳酸钙微球-细胞外基质复合材料放入冰甲醇溶液中置于冰上固定30min。然后使用磷酸缓冲液冲洗3遍，每次5min .加入浓度为5%的BSA溶液封闭处理一个小时，然后用磷酸缓冲液清洗1次，加入层粘连蛋白，玻连蛋白，Ⅰ型胶原 ，Ⅲ型胶原一抗，孵育12小时，用磷酸缓冲液清洗三次，加入PE染料连接的二抗，孵育30min,磷酸缓冲液清洗三次。然后将样品置于激光共聚焦显微镜拍照。实施例结果如图2所示。
从图2可以看出，脱细胞处理后，细胞外基质上对细胞生长起关键性作用的层粘连蛋白，玻连蛋白，Ⅰ型胶原 ，Ⅲ型胶原均在碳酸钙微球-细胞外基质复合材料上保留。
（三）碳酸钙微球-细胞外基质复合材料的细胞培养细胞活力（MTT）检测
将实施例3制备得到的碳酸钙微球-细胞外基质复合材料平铺置于12孔板中重复8个样，聚苯乙烯细胞培养板（TCPS）孔以及碳酸钙微球组作为对照组，每孔接种密度为3000/cm2。分别培养1，3、5、7天后，每个孔板加入100μL的0.5mg/ml的3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)溶液。37℃孵育4小时后，吸弃每个孔板中的培养液，加入150μL的DMSO（二甲基亚砜）。96孔板在摇床摇晃5分钟后，把每个孔内的液体移至另一新96孔板，在免疫酶标仪上用490nm波长测定每孔的吸光值。结果如图3所示。
图3的结果表明，在碳酸钙微球-细胞外基质复合材料上细胞活力较强，明显高于碳酸钙微球组。
（四）碳酸钙微球-细胞外基质复合材料FDA染色
称5mgFDA(二乙酸荧光素)加入1mL丙酮溶解，摇匀，避光4℃保存；使用时用PBS将FDA溶液稀释1000倍，得到5μg/mL FDA溶液，将步骤（三）中得到的培养七天后的载体材料中培养基吸走，用无菌PBS溶液清洗三次，待用。在每孔材料中加入200μl的FDA溶液，培养箱中放置10min，尽量避光；取出培养皿，吸去染色液，用PBS清洗三次，置于荧光显微镜下观察。激发波长484nm，发射波长520nm。结果如图4所示（A为碳酸钙微球组、B为TCPS组、C为碳酸钙微球-细胞外基质组）。
从图4可以看出，在碳酸钙微球-细胞外基质复合材料上的骨髓间充质干细胞生长状态好；细胞形态饱满，可观察到细胞在凝胶内部均匀分布生长。
Claims (9)
1.一种碳酸钙微球-细胞外基质复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 分别配制浓度为10mM~250mM钙盐水溶液和10mM~250mM碳酸盐水溶液；
S2. 将步骤S1制得的钙盐水溶液和碳酸盐水溶液搅拌混合、静置，将沉淀过滤、洗涤、干燥即得碳酸钙微球；
S3. 将S2得到的碳酸钙微球称量60mg~70mg平铺在细胞培养容器中，用培养基浸泡，然后接种骨髓间充质干细胞，于CO2培养箱中培养5~10天，每隔2~3天更换培养基，接着进行脱细胞处理，最后干燥即可得到碳酸钙微球-细胞外基质复合材料；
所述脱细胞的步骤为：将细胞培养容器放入-80℃冰箱冷冻5~10min，接着取出解冻，用去离子水冲洗细胞培养容器表面，循环操作2~6次。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中所述钙盐水溶液和碳酸盐水溶液混合时钙离子和碳酸根离子的摩尔比为1:1。
3.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于，所述钙盐为氯化钙或硝酸钙；所述碳酸盐为碳酸钠或碳酸钾。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中所述干燥为冷冻干燥，冷冻干燥时间为24~72小时。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S3中接种骨髓间充质干细胞的密度为10000~30000/cm2，所述骨髓间充质干细胞为人源P3代骨髓间充质干细胞。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述解冻为室温解冻。
7.一种根据权利要求1所述制备方法制备得到的碳酸钙微球-细胞外基质复合材料。
8.权利要求1所述制备方法制备得到的碳酸钙微球-细胞外基质复合材料在间充质干细胞体外培养中的应用。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述体外培养为细胞增殖、分化或迁移。
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| CN105126164B (zh) * | 2015-09-29 | 2018-07-31 | 中山大学 | 一种用于骨软骨界面修复的具有梯度活性的支架材料及其制备方法和应用 |
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Family Cites Families (11)
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| US9132208B2 (en) * | 2008-08-07 | 2015-09-15 | Lifenet Health | Composition for a tissue repair implant and methods of making the same |
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| WO2007093431A1 (en) * | 2006-02-16 | 2007-08-23 | Universite Libre De Bruxelles | A method for osteogenic differentiation of bone marrow stem cells (bmsc) and uses thereof |
| US11607391B2 (en) * | 2008-09-25 | 2023-03-21 | Trs Holdings Llc | Mineral-coated microspheres |
| BRPI0921726B8 (pt) * | 2008-10-31 | 2021-07-27 | Synthes Gmbh | método para preparar uma composição de implante para promover o crescimento ósseo em um mamífero |
| CN101564553B (zh) * | 2009-06-05 | 2012-08-29 | 陕西瑞盛生物科技有限公司 | 人源化活性煅烧骨的制备方法 |
| RU2012149102A (ru) * | 2010-04-20 | 2014-05-27 | Интернэшнл Стем Селл Корпорейшн | Физиологические способы выделения клеточных популяций высокой чистоты |
| CN102070171A (zh) * | 2010-08-13 | 2011-05-25 | 刘霆 | 一种制备基因传输载体碳酸钙纳米的方法 |
| CN102397266B (zh) * | 2010-09-07 | 2013-06-19 | 国家纳米科学中心 | 纳米颗粒的制备方法及用该方法制备的纳米颗粒 |
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