CN103877622B - 一种静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料及其制备方法和应用，本发明的制备方法步骤简单易行，无需大型设备。制备得到的符合材料兼具有静电纺丝纳米纤维以及细胞外基质的优点，与单纯的静电纺丝纳米纤维材料或细胞外基质材料相比，具有很好生物相容性的同时具有很好的机械力学性能，更易于细胞黏附增值，在医学组织工程修复上有很高的应用前景和实用价值，能有效促进细胞的黏附生长、增殖、迁移和分化，可大规模扩增培养干细胞。此外，复合材料还具备低抗原性，经过严格筛选，无疾病传播风险。
Description
技术领域
本发明属于高分子材料技术领域和组织工程技术领域，具体涉及一种静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
细胞载体培养是一种可以大规模培养贴壁细胞的技术和方法，是当前贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法。通过对细胞没有毒副作用的载体介质，细胞贴附于载体表面或内部，可以大大提高细胞培养面积和效率，如微载体培养技术，具有均相培养兼具平板培养和悬浮培养的优势，培养条件(温度、pH值、二氧化碳浓度等)容易控制，并且培养过程系统化、自动化，不易被污染。但是，目前市面上的细胞载体(例如Cytodex系列微载体)大多价格昂贵，不适于工业化大规模培养细胞。目前用于干细胞大规模扩增的载体材料包括天然材料和人工合成材料两种，人工合成的材料主要有聚乙交醋、聚丙交醋以及两者的共聚物等。人工合成材料的缺点是疏水性，不利于细胞的粘附，并且降解产物呈酸性，对细胞。而天然材料来源于动物或人体，其网状结构、成分、生物力学环境适合种子细胞的生长、发育及新陈代谢，材料可降解，因此越来越受到研究者的重视。
经对现有技术文献的检索发现，M.PohlSCheidt等人在《VaCCine》Volume26，SSue12，17Mareh2008，PageS1552-1565报道了使用Cytodex-3微载体进行了50L牛肾细胞BKKL3A株反应器悬浮培养，并且对工业大规模工程放大做了基础研究，而这种大规模的细胞培养和重复性的生产活动需耗费大量的微载体，目前常用的商品化微载体有Cytodex系列、biosilon系列、5010微载体等，这些微载体对用于细胞培养来说，价格往往过于昂贵，用于大规模生产成本大，不适合进行工业化生产；同时，作为成型商品，这些细胞载体的形状和大小已经固定，不易加以改动，影响了相应工艺的设计、改进和优化。
静电纺丝技术，因其操作简便、可纺材料广泛，在过去二十年中得到了飞速发展，正成为超细纤维制备工艺中最常用的技术之一。电纺纤维的直径多为纳米或亚微米级，具有极高的比表面积和孔隙率，在组织工程领域具备一定应用潜力。有资料表明，纳米纤维支架纺织状的形貌结构以及纳米级别的纤维直径与动物体内的天然蛋白纤维非常类似，该种结构可极大地促进种子细胞的黏附、生长以及繁殖。但是静电纺丝材料的缺点是疏水性强，不利于细胞的粘附，并且降解产物呈酸性，在体内容易引起炎症反应。
存在于细胞间的纤维状和球形蛋白质的网状系统称之为细胞外基质（ECM），ECM是细胞环境的一种重要组成部分，细胞分泌的各种ECM成分形成基质间质和基质膜，在体内细胞锚定在该构架上。这些结构提供了组织特异性组织学的机体形成和发展所需要的空间定位和稳定性。细胞外基质(ECM)包括胶原、非胶原糖蛋白、氨基聚糖与蛋白聚糖、以及弹性蛋白,通过维持细胞存活、决定细胞形状、调节细胞增殖、控制细胞分化并参与细胞迁移来保持组织功能正常，维持新陈代谢旺盛。脱细胞基质由于去除了细胞和可溶性蛋白等引起免疫反应的物质，并且保留了原先的天然结构，已经得到了广泛的应用。但是单纯使用细胞外基质作为组织工程修复材料具有机械力学性能差，不能有效的抵抗软组织的压力等缺点。
发明内容
本发明的发明目的在于克服现有细胞外基质材料作为细胞载体的不足，公开一种静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料的制备方法，该方法工艺简单，成本低廉，操作简便，有利于降低日后工业化大规模贴壁细胞载体培养的成本。
本发明另一个目的在于公开一种静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料。
本发明还有一个目的在于公开一种静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料的应用。
本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：
一种静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料的制备方法，包括如下步骤：
S1.制备生物降解材料的静电纺丝纤维膜，所述生物降解材料为聚己内酯（PCL）、左旋聚乳酸(PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)；
S2.将步骤S1制得的静电纺丝纤维膜平铺在细胞培养容器中，用培养基浸泡，然后接种干细胞，于CO2培养箱中培养5~10天，每隔2~3天更换培养基，接着进行脱细胞处理，最后干燥即可得到静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料。
本发明选用特定种类的生物降解材料作为静电纺丝原料，制得三维静电纺丝纤维支架，再于ECM结合制得生物相容性好、机械力学性能和降解性能优异、易于细胞黏附增殖的复合材料，所述生物降解材料为聚己内酯（PCL）、左旋聚乳酸(PLLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)（共混比例9:1~3:1），所述生物降解材料的重均分子量为10万~20万。
本发明所述静电纺丝纤维膜采用常规静电纺丝技术制备即可，作为一种实施方案，步骤S1的具体步骤为先将生物降解材料溶解制得纺丝溶液，接着纺丝溶液通过常规静电纺丝装置进行纺丝，最后分离纺丝纤维即得静电纺丝纤维膜。
优选地，所述静电纺丝装置的参数设置为：微量推进泵的推进速度为0.4~1.0毫升/小时，高压电源电压值为10~20千伏，制得的静电纺丝纤维膜结构和性能更优，纤维粗细均匀，大小适中，有利于后续与ECM的结合。
优选地，所述纺丝溶液中生物降解材料的浓度为60~100mg/mL，溶液的粘度适中，利于后续的静电纺丝。
优选地，所述纺丝溶液的溶剂为二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂，二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为6:1~9:1，采用特定配比的混合溶剂更有利于分散生物降解材料，有利于后续的静电纺丝。
优选地，步骤S2中所述培养基中含有浓度为20~30mM的抗坏血酸，抗坏血酸能够刺激诱导干细胞分泌细胞外基质。
步骤S2中接种干细胞的密度为1000~3000/cm2，所述干细胞为人源P3代骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪干细胞或滑膜干细胞。
步骤S2中所述脱细胞的步骤为：将细胞培养容器放入-80℃冰箱冷冻5~10min，接着取出室温解冻，用去离子水冲洗细胞培养容器表面，循环操作2~8次。
优选地，步骤S2中所述干燥为冷冻干燥，冷冻干燥的时间为12~72小时，目的是除去复合材料表面残余的水且不破坏复合材料的形态和结构。
一种根据本发明静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料的制备方法制备得到的静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料。
本发明制备得到的静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料在组织工程领域中的应用。
本发明制备得到的静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料在间充质干细胞体外培养中的应用。
本发明所述体外培养为细胞增殖、分化或迁移。
本发明制备得到的静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料中，静电纺丝纳米纤维既可以增强细胞外基质的强度、提高机械力学性能，同时静电纺丝纳米纤维特有的表面结构能增强细胞的粘附，与常规的平面培养相比更有利于细胞的迁移和细胞外基质的分泌。此外，本发明选用的骨髓间充质干细胞分泌的细胞外基质含有大量的胶原蛋白以及生长因子，这些都能促进细胞的粘附和增殖。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明公开一种静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料及其制备方法和应用，本发明的制备方法步骤简单易行，无需大型设备。制备得到的符合材料兼具有静电纺丝纳米纤维以及细胞外基质的优点，与单纯的静电纺丝纳米纤维材料或细胞外基质材料相比，具有很好生物相容性的同时具有很好的机械力学性能，更易于细胞黏附增值，在医学组织工程修复上有很高的应用前景和实用价值，能有效促进细胞的黏附生长、增殖、迁移和分化，可大规模扩增培养干细胞。此外，复合材料还具备低抗原性，经过严格筛选，无疾病传播风险。
附图说明
图1为静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料电镜图；
图2为静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料免疫荧光染色图，其中A为III型胶原，B为层粘连蛋白，C为I型胶原，D为纤连蛋白；
图3为静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料的细胞培养细胞活力（CCK-8）检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
实施例1
1、制备生物降解材料的静电纺丝纤维膜：
（1）称取160mg的PCL（分子量10万），溶于2ml二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中（8:1,CH2Cl2/DMF,v/v），制得浓度为80mg/mL的PCL溶液，用封口膜封口，磁力搅拌3小时，待用。
（2）将步骤（1）制得的PCL溶液置于静电纺丝装置的注射器中，调节微量推进泵参数，容量0.2毫升，推进速度1.0毫升/小时，运行。打开旋转装置，调节转速使转动稳定。打开高压电源，调节电压值为20千伏，开始纺丝，沿着锡箔纸接收器的方向接收纺丝。
（3）纺丝结束后（约十分钟），取下锡箔纸，用玻璃棒沿着收集纺丝的锡箔纸表面方向将制备得到的纺丝纤维膜取下。
2、复合材料的制备：
将上一步制得的静电纺丝纤维膜剪成直径为5cm的圆片状，分别放入含有培养基的6孔板中浸泡3小时后，每孔接种密度为30000/cm2的骨髓间充质干细胞，放入95%，37℃的CO2培养箱培养7天，每2~3天换一次液。然后采用循环冷冻的方法脱细胞处理，使用浓度为0.25%戊二醛溶液固定12小时，放入冻干机冻干处理24小时即得目标复合材料。
3、SEM检测
将静电纺丝纳米纤维-细胞外基质(ECM)载体材料固定于样品台上，喷金处理，置于热场发射扫描电镜的真空室内，20kV电压下观察，得到SEM观察图。产品如图1所示。从图1可以看出，细胞外基质的网状结构很好的附着在静电纺丝纳米纤维表面。
实施例2
1、制备生物降解材料的静电纺丝纤维膜：
（1）称取200mg的PLGA（分子量15万，乳酸和羟基乙酸的比例为9：1），溶于2ml二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中（6:1,CH2Cl2/DMF,v/v），制得浓度为100mg/mL的PLGA溶液，用封口膜封口，磁力搅拌3小时，待用。
（2）将步骤（1）制得的PLGA溶液置于静电纺丝装置的注射器中，调节微量推进泵参数，容量0.2毫升，推进速度0.4毫升/小时，运行。打开旋转装置，调节转速使转动稳定。打开高压电源，调节电压值为10千伏，开始纺丝，沿着锡箔纸接收器的方向接收纺丝。
（3）纺丝结束后（约十分钟），取下锡箔纸，用玻璃棒沿着收集纺丝的锡箔纸表面方向将制备得到的纺丝纤维膜取下。
2、复合材料的制备：
将上一步制得的静电纺丝纤维膜剪成直径为5cm的圆片状，分别放入含有培养基的6孔板中浸泡3小时后，每孔接种密度为30000/cm2的骨髓间充质干细胞，放入95%，37℃的CO2培养箱培养7天，每2~3天换一次液。然后采用循环冷冻的方法脱细胞处理，使用浓度为0.25%戊二醛溶液固定12小时，放入冻干机冻干处理24小时即得目标复合材料。
3、静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料免疫荧光染色
将制备得到的静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料放入戊二醛溶液中室温固定30min。然后使用磷酸缓冲液冲洗3遍，每次5min。加入浓度为5%的BSA溶液封闭处理一个小时，然后用磷酸缓冲液清洗1次，加入层粘连蛋白，玻连蛋白，Ⅰ型胶原，Ⅲ型胶原一抗，孵育12小时，用磷酸缓冲液清洗三次，加入PE染料连接的二抗，孵育30min,磷酸缓冲液清洗三次。然后将样品置于激光共聚焦显微镜拍照。实施例结果如图2所示，其中A为III型胶原，B为层粘连蛋白，C为I型胶原，D为纤连蛋白。
从图2可以看出，脱细胞处理后，细胞外基质上对细胞生长起关键性作用的层粘连蛋白，玻连蛋白，Ⅰ型胶原，Ⅲ型胶原均在静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料上保留。
实施例3
1、制备生物降解材料的静电纺丝纤维膜：
（1）称取120mg的PLLA（分子量20万），溶于2ml二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中（9:1,CH2Cl2/DMF,v/v），制得浓度为60mg/mL的PLLA溶液，用封口膜封口，磁力搅拌3小时，待用。
（2）将步骤（1）制得的PLLA溶液置于静电纺丝装置的注射器中，调节微量推进泵参数，容量0.2毫升，推进速度0.5毫升/小时，运行。打开旋转装置，调节转速使转动稳定。打开高压电源，调节电压值为14千伏，开始纺丝，沿着锡箔纸接收器的方向接收纺丝。
（3）纺丝结束后（约十分钟），取下锡箔纸，用玻璃棒沿着收集纺丝的锡箔纸表面方向将制备得到的纺丝纤维膜取下。
2、复合材料的制备：
将上一步制得的静电纺丝纤维膜剪成直径为5cm的圆片状，分别放入含有培养基的6孔板中浸泡3小时后，每孔接种密度为30000/cm2的骨髓间充质干细胞，放入95%，37℃的CO2培养箱培养7天，每2~3天换一次液。然后采用循环冷冻的方法脱细胞处理，使用浓度为0.25%戊二醛溶液固定12小时，放入冻干机冻干处理24小时即得目标复合材料。
3、细胞CellCountingKit-8活力（CCK-8）检测
将制备得到的静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料剪成底面积为0.32cm2的圆片形放入96孔细胞培养板，完全培养基浸泡24小时后，接种密度为3000/cm2的骨髓间充质干细胞，分别的培养的第1、3、5、7天使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活力，具体检测步骤为：
（1）在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养（37℃,5%CO2）。
（2）向每孔加入10μLCCK溶液。
（3）将培养板在培养箱内孵育1~4小时。
（4）用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
其中使用在PLLA膜表面（采用本领域常规方法制备，将4mgPLLA溶于二氧环烷溶液，然后将4mg/ml的PLLA溶液平铺至培养皿，放到真空干燥箱60℃24小时制得PLLA膜）以及PLLA静电纺丝微米纤维膜（采用本领域常规方法制备，通过纺丝溶液的浓度控制纺丝的粒径大小，微米纤维膜的纺丝溶液浓度为6mg/ml，其他条件同纳米静电纺丝的制备工艺），亚微米纤维膜表面（采用本领域常规方法制备，亚微米纤维膜的纺丝溶液浓度为10mg/ml，其他条件同纳米静电纺丝的制备工艺）以及TCPS表面构建的ECM载体材料孔作为对照组，对照组分别命名为PLLA膜-ECM组、PLLA微米纤维膜-ECM组、PLLA亚微米纤维膜-ECM组、TCPS-ECM组。测试结果如图3所示。
图3的结果表明，在静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料上细胞活力较强，在第3、5天均明显高于各个对照组，说明本发明制得的复合材料生物相容性及促进干细胞体外增殖的性能最优。由于96孔板中细胞生长空间有限，细胞密度较大会产生接触抑制，细胞增殖能力下降，因而导致第7天静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料的增殖活力率略低于TCPS-ECM组。
Claims (7)
1.一种静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.制备生物降解材料的静电纺丝纤维膜，所述生物降解材料为聚己内酯、左旋聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物；
S2.将步骤S1制得的静电纺丝纤维膜平铺在细胞培养容器中，用培养基浸泡，然后接种干细胞，于CO2培养箱中培养5~10天，每隔2~3天更换培养基，接着进行脱细胞处理，最后干燥即可得到静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料；
步骤S1的具体步骤为先将生物降解材料溶解制得纺丝溶液，接着纺丝溶液通过常规静电纺丝装置进行纺丝，最后分离纺丝纤维即得静电纺丝纤维膜；
所述纺丝溶液中生物降解材料的浓度为60~100mg/mL；
步骤S2中接种干细胞的密度为30000/cm2，所述干细胞为人源P3代骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪干细胞或滑膜干细胞。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述纺丝溶液的溶剂为二氧环烷、二氯甲烷、三氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂，二氯甲烷与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为6:1~9:1。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述静电纺丝装置的参数设置为：微量推进泵的推进速度为0.4~1.0毫升/小时，高压电源电压值为10~20千伏。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述脱细胞的步骤为：将细胞培养容器放入-80℃冰箱冷冻5~10min，接着取出室温解冻，用去离子水冲洗细胞培养容器表面，循环操作2~6次。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2中所述干燥为冷冻干燥，冷冻干燥的时间为12~72小时。
6.一种根据权利要求1至5任一项所述制备方法制备得到的静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料。
7.权利要求6所述静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料在间充质干细胞体外培养中的应用。
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