CN115717123A - 一种利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法，属于纳米生物界面与组织工程技术领域，包括以下步骤：(1)将PLLA与明胶溶于六氟异丙醇，通过静电纺丝技术制备得到PLLA/明胶纳米纤维基体；(2)通过液相/气相诱导结晶方法，在步骤(1)所述的PLLA/明胶纳米纤维基体的表面包裹PLLA晶体得到分型纳米纤维；(3)将细胞培养于步骤(2)所述的分型纳米纤维上得到三维细胞球体。本发明基于静电纺丝技术和液相/气相界面诱导结晶方法，制备了一种分型纳米纤维，此纳米纤维支架为细胞球体的形成及培养提供了一个新的生物平台。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物界面与组织工程技术领域，尤其涉及一种利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法。
背景技术
自上世纪70年代科学家们意识到细胞二维培养的局限后，越来越多的研究投入到三维细胞培养中，尤其是细胞球体。然而，3D培养技术的高昂成本大大限制了其在再生医学、基础研究和药物研发的广泛应用。目前，细胞球体的形成方法包括悬滴法、旋转瓶法、微流体装置法和阵列法等等。这些方法存在着无法避免的局限，悬滴法工作量大，操作繁琐；旋转瓶法由于其自身的机械力，使得细胞球体活性降低；微流体装置法和阵列法需要复杂的仪器或特殊的材料。尤其是干细胞，其产量低、成本高、提取过程会导致巨大的伤害。因此，细胞球体的形成方法亟待改善。
静电纺丝纳米纤维制备方法简单，且与细胞外基质(ECM)极为相似。然而由于其纳米纤维较长且相互缠绕的二维结构，因此很难应用于细胞三维培养。此外，有研究报道称，已形成的细胞球体在纳米纤维膜上培养几天后，其三维立体结构会消失。因此，现有技术中还未有利用静电纺丝纤维长期稳定培养细胞球体的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法。本发明基于静电纺丝技术和液相/气相界面诱导结晶方法，制备了一种分型纳米纤维，此纳米纤维支架为细胞球体的形成及培养提供了一个新的生物平台。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法，包括以下步骤：
(1)将PLLA与明胶溶于六氟异丙醇，通过静电纺丝技术制备得到PLLA/明胶纳米纤维基体；
(2)通过液相/气相诱导结晶方法，在步骤(1)所述的PLLA/明胶纳米纤维基体的表面包裹PLLA晶体得到分型纳米纤维；
(3)将细胞培养于步骤(2)所述的分型纳米纤维上得到三维细胞球体。
优选的，所述步骤(1)中PLLA的含量为50wt％～90wt％，明胶的含量为10wt％～50wt％。
优选的，所述步骤(1)中静电纺丝技术的纺丝液浓度为6～15wt％，电压为15～25kV，挤出速度为1～3ml/h，喷丝头与接收板间距为12～15cm。
优选的，所述步骤(2)中液相诱导结晶的方法包括：将PLLA溶于对二甲苯中，加热后得到均一溶液，然后将步骤(1)所述的PLLA/明胶纳米纤维基体浸没于上述得到的均一溶液中，结晶，然后用对二甲苯溶液对上述结晶进行清洗，烘干，得到分型纳米纤维。
优选的，所述加热的温度为120～140℃，加热的时间为0.5～1.5h。
优选的，所述结晶的温度为80～85℃，结晶的时间为3～15h。
优选的，所述PLLA的重均分子量为17-26万。
优选的，所述细胞为干细胞、体细胞或癌细胞。
优选的，所述细胞的种植密度为10000～50000细胞/cm2。
优选的，所述细胞在分型纳米纤维上的培养时间为1～7d。
本发明基于静电纺丝技术和液相/气相界面诱导结晶方法，制备了一种分型纳米纤维，此纳米纤维支架为细胞球体的形成及培养提供了一个新的生物平台。
附图说明
图1为本发明用于三维干细胞球体形成的分型纳米纤维的制备工艺流程图；
图2为干细胞球体在分型纳米纤维上的形成及活性；
图3为干细胞球体在分型纳米纤维上培养不同时间的形貌；
图4为不同细胞种植密度下干细胞球体在分型纳米纤维上的形成及培养；
图5为干细胞球体在不同分型纳米纤维上的形成及培养。
具体实施方式
本发明提供了一种利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法，包括以下步骤：
(1)将PLLA与明胶溶于六氟异丙醇，通过静电纺丝技术制备得到PLLA/明胶纳米纤维基体；
(2)通过液相/气相诱导结晶方法，在步骤(1)所述的PLLA/明胶纳米纤维基体的表面包裹PLLA晶体得到分型纳米纤维；
(3)将细胞培养于步骤(2)所述的分型纳米纤维上得到三维细胞球体。
在本发明中，所述PLLA/明胶纳米纤维基体的比例优选为50：50～90：10，更优选为70：30。本发明对PLLA和明胶的来源没有特殊限定，采用常规的市售产品即可。
在本发明中，所述PLLA的重均分子量优选为17-26万，更优选为20万。
在本发明中，所述液相诱导结晶体系优选为PLLA/对二甲苯溶液，所述PLLA/对二甲苯溶液体系中PLLA的含量优选为0～0.03wt％，更优选为0.03wt％。在本发明中，所述PLLA/明胶纳米纤维基体在PLLA/对二甲苯溶液体系中结晶的时间优选为3～15h。
在本发明中，所述液相诱导结晶体系优选为丙酮，所述丙酮体系中丙酮稀释浓度为20～100％。在本发明中，所述PLLA/明胶纳米纤维基体在丙酮体系中结晶温度优选为4～37℃；所述PLLA/明胶纳米纤维基体在丙酮体系中结晶时间优选为5min～24h。
在本发明中，所述气相诱导结晶体系优选为二氯甲烷，所述PLLA/明胶纳米纤维基体在二氯甲烷体系中结晶温度优选为20～37℃；所述PLLA/明胶纳米纤维基体在二氯甲烷体系中结晶时间优选为1～4d。
在本发明中，所述细胞优选为干细胞、体细胞或癌细胞；所述干细胞优选为人源牙髓干细胞(hDPSCs)。
在本发明中，所述种植于分型纳米纤维细胞的密度优选为10000细胞/cm2～50000细胞/cm2。
在本发明中，所述干细胞在分型纳米纤维上的培养时间优选为1d～5d。
在本发明中，将细胞培养于分型纳米纤维上得到三维细胞球体前，优选将分型纳米纤维经紫外灭菌后，使用DMEM培养基预培养。本发明对DMEM培养基的来源没有特殊限定，采用常规市售或者自己配置的均可。
在本发明中，PLLA/明胶纳米纤维基体的制备，优选将PLLA溶于有机溶剂中制成均一、透明纺丝液，然后进行静电纺丝；纺丝液浓度优选为6～15wt％，电压优选为15～25kV,挤出速度优选为1～3ml/h,喷丝头与接收板间距优选为12～15cm。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种用于三维干细胞球体形成及培养的分型纳米纤维的制备方法，具体步骤如下:
(1)将8wt％的PLLA和明胶溶解于六氟异丙醇中，其质量比为70:30，随后进行静电纺丝，电压为25kV,挤出速度为3ml/h,喷丝头与接收板间距为12cm，获得PLLA/明胶纳米纤维基体；
(2)将PLLA溶于对二甲苯中，130℃加热1h，得到0.03wt％的均一溶液；
(3)将步骤(1)得到的静电纺丝纳米纤维基体浸没于步骤(2)的PLLA/对二甲苯稀溶液，83℃结晶15h，随后用对二甲苯溶液清洗分型纳米纤维,烘干备用；
(4)分型纳米纤维经紫外灭菌后，使用DMEM预培养；
(5)hDPSCs以50000细胞/cm2的密度种植于(4)中分型纳米纤维，培养5d；
(6)用活死细胞染色试剂对分型纳米纤维上的细胞进行染色；
(7)荧光显微镜下观察采集图像，如图2所示。
实施例2
一种用于三维干细胞球体形成及培养的分型纳米纤维的制备方法，具体步骤如下:
(1)将8wt％的PLLA和明胶溶解于六氟异丙醇中，其质量比分别为70:30,随后进行静电纺丝，电压为25kV,挤出速度为3ml/h,喷丝头与接收板间距为12cm，获得PLLA/明胶纳米纤维基体；
(2)将PLLA溶于对二甲苯中，130℃加热1h，得到0.03wt％的均一溶液；
(3)将步骤(1)得到的静电纺丝纳米纤维基体浸没于步骤(2)的PLLA/对二甲苯稀溶液，83℃结晶15h，随后用对二甲苯溶液清洗分型纳米纤维,烘干备用；
(4)分型纳米纤维经紫外灭菌后，使用DMEM预培养；
(5)hDPSCs以50000细胞/cm2的密度种植于(4)中分型纳米纤维，分别培养1d，3d，5d；
(6)用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞(室温，30min)，然后用PBS洗涤3次；
(7)固定后，用0.1％TritonX-100的PBS溶液进行透化，然后用PBS洗涤3次；
(8)细胞骨架用罗丹明标记鬼笔环肽工作液染色，然后用PBS洗涤3次。
(9)细胞核在室温下用DAPI染色10min；
荧光显微镜下观察采集图像，如图3所示。
实施例3
一种用于三维干细胞球体形成及培养的分型纳米纤维的制备方法，具体步骤如下:
(1)将8wt％的PLLA和明胶溶解于六氟异丙醇中，其质量比分别为70:30，随后进行静电纺丝，电压为25kV,挤出速度为3ml/h,喷丝头与接收板间距为12cm，获得PLLA/明胶纳米纤维基体；
(2)将PLLA溶于对二甲苯中，130℃加热1h，得到0.03wt％的均一溶液；
(3)将步骤(1)得到的静电纺丝纳米纤维基体浸没于步骤(2)的PLLA/对二甲苯稀溶液，83℃结晶15h，随后用对二甲苯溶液清洗分型纳米纤维,烘干备用；
(4)分型纳米纤维经紫外灭菌后，使用DMEM预培养；
(5)hDPSCs分别以10000，25000，50000细胞/cm2的密度种植于(4)中分型纳米纤维，培养3d；
(6)用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞(室温，30min)，然后用PBS洗涤3次；
(7)固定后，用0.1％TritonX-100的PBS溶液进行透化，然后用PBS洗涤3次；
(8)细胞骨架用罗丹明标记鬼笔环肽工作液染色，然后用PBS洗涤3次；
(9)细胞核在室温下用DAPI染色10min；
荧光显微镜下观察采集图像，如图4所示。
实施例4
一种用于三维干细胞球体形成及培养的分型纳米纤维的制备方法，具体步骤如下:
(1)将8wt％的PLLA和明胶溶解于六氟异丙醇中，其质量比分别为50:50,70:30,90:10,随后进行静电纺丝，电压为25kV,挤出速度为3ml/h,喷丝头与接收板间距为12cm，获得PLLA/明胶纳米纤维基体；
(2)将PLLA溶于对二甲苯中，130℃加热1h，得到0.03wt％的均一溶液；
(3)将步骤(1)得到的静电纺丝纳米纤维基体浸没于步骤(2)的PLLA/对二甲苯稀溶液，83℃结晶15h，随后用对二甲苯溶液清洗分型纳米纤维,烘干备用，分别记为C-P50G50,C-P70G30,C-P90G10；
(4)分型纳米纤维经紫外灭菌后，使用DMEM预培养；
(5)hDPSCs以25000细胞/cm2的密度种植于(4)中分型纳米纤维，培养5d；
(6)用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞(室温，30min)，然后用PBS洗涤3次；
(7)固定后，用0.1％TritonX-100的PBS溶液进行透化，然后用PBS洗涤3次；
(8)细胞骨架用罗丹明标记鬼笔环肽工作液染色，然后用PBS洗涤3次；
(9)细胞核在室温下用DAPI染色10min；
(10)荧光显微镜下观察采集图像，如图5所示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法，包括以下步骤：
(1)将PLLA与明胶溶于六氟异丙醇，通过静电纺丝技术制备得到PLLA/明胶纳米纤维基体；
(2)通过液相/气相诱导结晶方法，在步骤(1)所述的PLLA/明胶纳米纤维基体的表面包裹PLLA晶体得到分型纳米纤维；
(3)将细胞培养于步骤(2)所述的分型纳米纤维上得到三维细胞球体。
2.根据权利要求1所述的利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中PLLA的含量为50wt％～90wt％，明胶的含量为10wt％～50wt％。
3.根据权利要求1所述的利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法，其特征在于，所述步骤(1)中静电纺丝技术的纺丝液浓度为6～15wt％，电压为15～25kV，挤出速度为1～3ml/h，喷丝头与接收板间距为12～15cm。
4.根据权利要求1所述的利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相诱导结晶的方法包括：将PLLA溶于对二甲苯中，加热后得到均一溶液，然后将步骤(1)所述的PLLA/明胶纳米纤维基体浸没于上述得到的均一溶液中，结晶，然后用对二甲苯溶液对上述结晶进行清洗，烘干，得到分型纳米纤维。
5.根据权利要求4所述的利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法，其特征在于，所述加热的温度为120～140℃，加热的时间为0.5～1.5h。
6.根据权利要求4所述的利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法，其特征在于，所述结晶的温度为80～85℃，结晶的时间为3～15h。
7.根据权利要求1所述的利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法，其特征在于，所述PLLA的重均分子量为17-26万。
8.根据权利要求1所述的利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法，其特征在于，所述细胞为干细胞、体细胞或癌细胞。
9.根据权利要求1所述的利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法，其特征在于，所述细胞的种植密度为10000～50000细胞/cm2。
10.根据权利要求1所述的利用分型纳米纤维培养三维细胞球体的方法，其特征在于，所述细胞在分型纳米纤维上的培养时间为1～7d。
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