CN110882416A - 一种仿生复合纳米纤维支架材料的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种仿生复合纳米纤维支架材料的制备方法和应用，材料包括：人造纳米纤维支架材料和细胞来源的细胞外基质材料。本发明复合纳米纤维材料，既保留了左旋聚乳酸传统生物医用材料的无毒、可降解等优点，又提高了支架材料的柔韧性和抗拉伸强度等力学性能；由于细胞外基质在不同物种间具有高度保守性，脱细胞来源的细胞外基质支架具有低免疫原性和优异的生物相容性等优点，可以接种从拟置入患者体内获得的并扩增的间质干细跑，经适当培养即可形成用于植入人体替代缺损组织的组织工程假体支架。

Description

一种仿生复合纳米纤维支架材料的制备方法和应用
技术领域
本发明属于组织工程材料及其制备和应用领域，特别涉及一种仿生复合纳米纤维支架材料的制备方法和应用。
背景技术
骨损伤是近年来急剧增加的临床案例，但机体自我修复功能有限，一般对于直径超过2mm的缺损，其愈合能力大大降低。因此，组织工程诞生之际，也带来了彻底治愈骨损伤的希望。1987年美国国家科学基金委员会首认了组织工程技术，其三要素包括种子细胞、支架和生物活性因子。其中，尤为关键的是制备一种能够模拟体内微环境的支架，理想的支架不单单只是为种子细胞提供附着的场所，而且还要能够更好的促进种子细胞的增殖与分化。
现有的支架材料主要包括人工合成的高分子聚合材料(如左旋聚乳酸PLLA,聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA,聚己内酯PCL)和天然生物大分子材料，如丝素蛋白(silkfibroin,SF)和壳聚糖(chitosan,CTS)。人工合成的高分子聚合材料可降解并具有一定的机械性能，但亲水性差且降解后的酸性产物不利于种子细胞的存活。天然生物大分子材料具有良好的亲水性、可塑性和柔韧性，且降解产物对细胞无毒害作用，但机械性能差。近年来研究发现：将天然生物大分子材料与人工合成的高分子聚合材料结合，使其优势互补，所制备的复合支架能够较好地作为仿生替代材料。
然而，人体组织结构复杂，目前的工程技术尚不能构建完美模拟体内微环境的组织，故而限制了组织工程的临床转化应用。因此，众多学者开始将研究方向转向细胞外基质(extracellular matrix,ECM)。该研究出现于上世纪九十年代初，其原理是通过脱组织或细胞技术制备去细胞结构的细胞外基质用于皮肤、骨等组织再生，从而降低异体组织或细胞移植的免疫原性。细胞外基质不仅留有组织或器官中主要的蛋白成分，包括结构和功能蛋白(如胶原和弹性蛋白),还有多糖组分(如蛋白聚糖和糖胺聚糖)，这些活性成分的保留有利于促进种子细胞与支架材料的结合，增强细胞的粘附，提高生物相容性。同时，制备的活性细胞外基质还可以将组织或细胞的超微结构保存完整，其中富含有多种生长因子(如bFGF、EGF等)能够促进种子细胞的增殖与分化。
目前，CN105194734A公开了一种壳聚糖-细胞外基质组织修复膜及其制备方法，但价格昂贵，而一般的壳聚糖含杂质较多，易引起感染；此外，CN105194734A发明材料中的细胞外基质经与壳聚糖混合再烘干，可能会造成细胞外基质的生物活性降低。本发明采用静电纺丝技术制备的纳米纺丝膜可以很好的模拟细胞外基质，之后脱细胞留下的细胞外基质未进行蛋白质破环性的操作，赋予了支架良好的生物活性，并为支架提供适当的机械性能。PLLA和丝素物美价廉，适于规模化生产和临床应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种仿生复合纳米纤维支架材料的制备方法和应用，克服现有技术仿生骨支架无法同时满足良好机械性能和生物相容性的缺陷。本发明中用人造高分子纤维支架材料作为基础材料，在此基础材料纤维结构的表面复合由动物细胞来源的细胞外基质材料，由此组成一种在后期为制作组织工程假体而接种组织细胞时更加有利于细胞存活及生长的纳米级尺寸结构的组织工程复合纤维支架材料。本发明将左旋聚乳酸/丝素蛋白两种材料混合进行静电纺丝，灭菌后将细胞种植在上面，再通过化学方法进行脱细胞，从而获得负载着细胞外基质的纳米纤维支架。
本发明一种复合纤维支架材料，所述材料包括人造高分子纤维支架材料和细胞来源的细胞外基质材料，不同类型细胞进行脱细胞后留下的细胞外基质材料包覆在基于人造高分子纤维支架材料制成的纤维结构(左旋聚乳酸/丝素蛋白混合材料静电纺丝支架)的外表面；所述的人造高分子纤维支架材料包括人工合成的高分子聚合材料和天然生物大分子材料。
进一步，所述人造高分子纤维支架材料为静电纺丝纳米纤维支架材料。
进一步的优化，所述的细胞外基质材料由已分化成熟的功能组织细胞合成。
更进一步的优化，所述的细胞外基质材料由接种在人造高分子纤维支架材料内的已分化成熟的异体动物功能组织细胞原位合成。所述的功能组织细胞包括同种异体组织细胞和异种异体组织细胞。
再进一步地优化，所述的已分化成熟的异体动物功能组织细胞为成骨细胞、成软骨细胞或神经细胞。
所述高分子纤维支架材料为左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架；细胞外基质材料为大鼠成骨细胞、成软骨细胞或神经细胞的外层基质材料。
本发明的一种复合纤维支架材料的制备方法，包括：
(1)将高分子纤维支架进行灭菌，清洗，加入培养基中进行预培养；
(2)将细胞种植在步骤(1)支架上，待细胞贴壁后固定细胞，然后脱细胞，即得。所述步骤(1)中高分子纤维支架为左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架；其中左旋聚乳酸与丝素蛋白的质量比为3:7～7:3。
所述左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架的具体制备方法为：
将左旋聚乳酸(MW＝100,000g/mol)与丝素蛋白以适当质量比混溶于HFIP(六氟异丙醇)中，配置纺丝液，进行静电纺丝；电纺后的纳米材料置于真空干燥箱中3天以上充分干燥。所述步骤(1)中灭菌具体为：采用乙醇或甲醇处理纳米纤维支架，然后紫外照射灭菌。
所述步骤(2)中细胞为猪成骨细胞、成软骨细胞或神经细胞。
所述步骤(2)中固定细胞为4％(w/v)多聚甲醛固定细胞；脱细胞为：用TritonX-100处理细胞，清洗。
复合纤维支架材料的制备方法具体为：
a.丝素蛋白的提取：蚕茧去除杂质后，置于Na2CO3水溶液中煮沸，进行脱胶；将脱胶蚕丝水分拧干、拉松铺展在铝箔上烘干；将干燥后的蚕丝溶于三元体系CaCl2/CH3CH2OH/H2O(摩尔比为1:2:8)溶液中，加热搅拌；将溶解液常温透析，获得丝素蛋白溶液，过滤，冷冻干燥后获得纯丝素蛋白。
b.左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架的制备：将左旋聚乳酸与丝素蛋白按100/0,70/30,50/50,30/70,0/100的质量比分别混溶于HFIP(六氟异丙醇)中，配置纺丝液，进行静电纺丝；电纺后的纳米材料置于真空干燥箱中3天以上充分干燥。
c.复合纳米纤维支架的灭菌：将材料放入培养板中，用体积比为90％的甲醇或者乙醇处理10-15min，使丝素蛋白结构改变；吸弃甲醇，加入无水乙醇浸泡过夜；吸弃乙醇后，紫外照射2h以上，再用75％乙醇浸泡2h以上；吸弃乙醇，用PBS清洗；每孔加入培养基置于培养箱进行预培养。
d.成骨细胞的提取：取出生一天的SD大鼠浸泡于75％酒精中；取出置于无菌板上，用眼科剪剪取颅骨，剔除其他组织，置于PBS中清洗，该操作在冰上进行；将颅骨剪碎，加入胰酶，置于细胞培养箱中消化30-40min；加入2倍体积的培养基终止消化，离心，加入培养基于培养箱中培养；隔天换液，待细胞覆盖率达80％左右进行传代。
e.成骨细胞外基质的负载：将成骨细胞种植于上述灭菌支架上；待细胞贴壁后，用新鲜配置的4％(w/v)多聚甲醛固定细胞；再用TritonX-100处理细胞；PBS清洗后，该复合纳米纤维支架即制备而成。
本发明的一种所述方法制备的复合纤维支架材料。
本发明提供一种基于所述复合纤维支架材料接种间质干细胞后作为组织工程假体材料的应用。
具体为：组织工程复合纤维支架材料上接种从拟置入患者体内获得的并扩增的间质干细跑，适当培养后即可形成用于植入人体替代缺损组织的组织工程假体材料。
本发明提供一种所述复合纤维支架作为生物支架的应用。
本发明所公开技术方案在具体应用中可以考虑以下几方面的扩展：
1.本发明公开的组织工程复合纤维支架材料，是将细胞合成的细胞外基质材料包覆在在人造高分子纤维支架材料的纤维结构的外表面构成。从制造成本考虑，细胞外基质材料可以由接种在人造高分子纤维支架材料内的同种异体或异种异体功能组织细胞原位合成，正如前面的说明书相关段落里所描述的，也可以考虑由异种异体动物的相应组织利用常规生物材料脱细胞提纯方法直接提存获得，经细化处理后沉积在人造高分子纤维支架材料的纤维结构的外表面。
2.本发明公开的组织工程复合纤维支架材料在具体应用中可以将用于产生细胞外基质的大鼠成骨细胞替换成与人抗原性更接近并易于大量获得的猪成骨细胞、成软骨细胞或神经细胞，在制成适当形状的组织工程复合纤维支架材料上接种从拟置入患者体内获得的并扩增的间质干细跑，适当培养后即可形成用于植入人体替代缺损组织的组织工程假体材料。
有益效果
(1)将左旋聚乳酸与丝素蛋白共纺，左旋聚乳酸机械强度大、可降解；丝素蛋白本身具有良好的柔韧性和抗拉伸强度、透气透湿性、缓释性等理化性质，通过不同处理技术可制备成纤维、膜和凝胶等。目前PLLA纤维支架的力学性能足够用于组织工程领域的研究，但单一的PLLA纤维支架因亲水性较差，降解缓慢，性脆等缺陷，很难单独使用。SF蛋白由于有良好的生物相容性和优异的亲水性能，被广泛应用于组织工程各领域，但其力学性能不足，无法单独用于骨修复。因此，将PLLA和SF进行混纺，以期将两者优异性能相结合，达到优势互补的效果。
(2)将细胞外基质负载于复合纳米纤维材料上。将成骨细胞的细胞外基质负载于左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架上，既保留了左旋聚乳酸作为传统生物医用材料的无毒、可降解等优点，丝素蛋白又提高该支架材料的亲水性、柔韧性和抗拉伸强度，同时细胞外基质可改善支架的细胞亲和性，使其具有更好的生物相容性，从而满足仿生支架的要求。此外，因为细胞外基质在不同物种间具有高度保守性，通过脱细胞技术基本可以去除细胞结构和DNA，既降低了免疫原性，又保留细胞外基质的活性成分，因而可以作为工程化组织构建中优良的生物支架材料。此外，左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架也可负载其他种类细胞的细胞外基质，如神经细胞、软骨细胞等，使干细胞向相应细胞分化。
(3)本发明利用脱细胞基质技术制备一种可降解、免疫原性低、机械性能好且具有高仿生特性和生物相容性的仿生骨材料具有极大的临床运用前景。
附图说明
图1负载细胞外基质的复合纳米纤维支架的制备流程图；
图2负载细胞外基质的复合纳米纤维支架的模式流程图；
图3新生SD大鼠成骨细胞的提取、培养及鉴定；其中A.成骨细胞的提取流程图；B.成骨细胞在组织培养板上传代三次后的光学显微镜图；C.成骨细胞碱性磷酸酶染色(ALP染色)；D.成骨细胞茜素红S(ARS)染色(标尺＝100μm)；由ALP染色和ARS染色结果可知，所提取细胞为成骨细胞；
图4左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架的扫描电镜图(A)；负载细胞外基质的左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架的扫描电镜图(B)。
图5小鼠MSCs成骨分化的14天后ALP染色结果；其中A.TCP(Tissue CulturePlate)对照组；B.TCP/成骨诱导液组；C.细胞外基质组；D.材料(左旋聚乳酸/丝素蛋白)组；E.细胞外基质/材料组；F.细胞外基质/材料/成骨诱导液组(标尺＝100μm)；
图6小鼠MSCs成骨分化的14天后ARS染色结果；其中A.TCP(Tissue CulturePlate)对照组；B.TCP/成骨诱导液组；C.细胞外基质组；D.材料(左旋聚乳酸/丝素蛋白)组；E.细胞外基质/材料组；F.细胞外基质/材料/成骨诱导液组(标尺＝100μm)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一、制备负载成骨细胞外基质的PLLA/SF仿生复合纳米纤维支架，具体方法如下：
a.丝素蛋白的提取：蚕茧(河北保定中药材零售批发)去除杂质后，置于质量Na2CO3(上海凌峰化学试剂有限公司)水溶液中，煮沸30-50min进行脱胶，再用去离子水清洗干净；重复上述步骤，至煮沸后的水溶液颜色无明显变化，且蚕丝纯白，此时丝胶去除干净；将脱胶蚕丝水分拧干、拉松铺展在铝箔上，50℃脱胶，再用烘干后称重；将干燥后的蚕丝以1：10的浴比溶于三元体系CaCl2/CH3CH2OH/H2O(摩尔比为1:2:8)(上海凌峰化学试剂有限公司)溶液中溶解，70℃-80℃加热搅拌；将溶解液常温透析6-10天，前4-6天每4h更换一次去离子水，后2-4天每8h更换一次去离子水，获得丝素蛋白溶液；过滤所得的丝素蛋白溶液，以去除杂质；冷冻干燥后获得纯丝素蛋白。
b.左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架的制备：将聚左旋乳酸PLLA(MW＝100,000g/mol)(济南岱罡生物科技有限公司)与提取获得的SF蛋白分别以不同的质量配比(依次为：100/0、70/30、50/50、30/70和0/100)共混溶解于六氟异丙醇(Hexafluoroisopropanol,HFIP)(上海达瑞精细化学品有限公司)中，配制成8％(wt)的电纺丝溶液。纺丝液经在磁力搅拌器上常温搅拌过夜后至充分混匀且性能稳定后可用于静电纺。本研究控制纺丝参数如下：电压为9-12kV，接收距离为10-12cm，溶液流速为1.0mL/h，室内温度在25-35℃，湿度为50-80％RH。用铝箔接收纤维，2h后可获得厚度在0.10-0.12mm范围内的无纺电纺丝纤维膜。将电纺丝收集的支架纤维膜置于真空干燥箱内充分干燥3-7d后，用于后续实验。
c.左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架交联：对于获得的不同比例的PLLA/SF纳米纤维膜，由于改性前SF主要为α-螺旋结构，常规条件下极易溶于水，不利于后续的表征操作及相关细胞实验。因此，本研究采用甲醇改性法对PLLA/SF纳米纤维支架进行预处理，用90％体积比的甲醇水溶液对PLLA/SF纳米纤维膜处理10min以达改性效果，用D-PBS进行清洗(洗3次，每次5min)后获得改性后的PLLA/SF纳米纤维支架。最后，经真空干燥干燥后的复合纳米纤维支架可用于后续实验。
d.左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架的性能表征：
i.纤维形貌观察：利用扫描电镜(JSM-5600,JEOL,Japan)观察五种不同质量配比的PLLA/SF共混纳米纤维支架的形貌：将纤维样品裁剪成约0.2cm2大小的小膜片，用导电胶粘贴于电镜载物台上，喷金40-60s以增强样品导电性，之后在10-15kV的加速电压下，用扫描电子显微镜观察纳米复合纤维膜的形貌。根据所获得的SEM图像，使用图像处理软件Image J2x(GraphPad Software,CA)测量纳米纤维的直径分布，测量n＝100处的纤维直径，结果取平均值，用Origin 8(Originlab,USA)做出直径分布图并分析(直径依次为163.81±149.27nm，971.34±335.65nm，438.52±69.70nm，471.37±75.18nm，283.13±66.26nm)。
ii.纤维结构分析：利用ATR-FTIR(NEXUS-670,Nicolet,USA)分析甲醇处理前后五种不同质量配比的PLLA/SF共混纳米纤维各组分间分子结构变化：仪器参数设置为，波数范围为400-4000cm-1，分辨率为4cm-1。
iii.纤维热重分析：将待测样品剪碎，称重(保证每个样品的质量大体一致，可提高测量准确性)，装入用酒精喷灯灼烧过的坩埚中，用热重分析仪(TG209F1,NetZSch,Germany)对样品进行测试分析，N2保护，升温速率为10℃/min，测试温度范围从室温至800℃。
iv.纤维亲水角测试：采用接触角测试仪对复合纳米纤维支架进行接触角测试，将试样裁剪成约2cm×3cm大小的膜片，平整地铺展于接触角仪(DSA30，KRUSS,Germany)上，用0.03mL的去离子水滴在待检样品上进行纤维表面亲水性检测，通过软件计算分析接触角，对于亲水性强的纤维膜，实时观察接触角变化，并保存视频。每个样品检测6处不同部位，取平均值(亲水角分别为：138.15，134.30，125.11，119.36，64.34)。
v.纤维力学性能分析：沿纤维走向制备一定厚度的1cm×5cm的条形试样(每个样品的平行组为n＝10)，用螺旋测微器测量每组样品上3-5个不同位置的厚度取平均值，之后将所制备的样品两端的1cm处固定于力学拉伸仪(NanoBionix,MTS,USA)上，中间3cm为测试区，在室温，50-70％湿度的环境下测定不同比例的拉伸力学性能，仪器设置参数为：拉伸速率为10mm/min，夹具间距为3cm，负荷范围为10N，伸长范围为5cm用于拉伸测试，计算得出断裂强度和断裂最大伸长率及应力应变曲线。
vi.细胞相容性评价：用于细胞实验的纤维支架，需用相应的盖玻片作为载体接收，方能置于培养板内用于细胞的种植。本研究首先对盖玻片进行灭菌处理，具体操作为，将直径分别为14mm(用于24孔板)的圆形盖玻片用浓硫酸浸泡过夜后，蒸馏水清洗15-20遍后高温高压灭菌(120℃，30min)，之后铺开于鼓风干燥箱内干燥过夜，用酒精浸泡2h晾干后获得无菌可用于细胞实验的盖玻片。将干燥后的盖玻片固定于铝箔上用于接收电纺丝纤维膜。随后，将制备好的盖玻片接收的纤维膜按其大小裁剪成若干匹配24孔板的支架材料。按照步骤c首先对负载纳米纤维的支架进行交联处理，然后进行无菌处理：将带盖玻片的材料裁剪好置于相应孔板中，在无菌超净台内用75％乙醇(上海凌峰化学试剂有限公司)浸泡2.5h以上，并用无菌D-PBS清洗(洗3次，每次5min)，之后紫外照射过夜杀菌处理，随后加入相应细胞培养液孵育材料，并于37℃、5％CO2浓度及95％湿度的细胞培养箱中孵育过夜进行预培养处理后，方可按相应密度接种细胞。
细胞相容性评价采用L929细胞(中科院细胞库)，分别对五种不同比例的PLLA/SF支架材料的细胞相容性进行评价。其基本步骤为：将细胞从培养箱转移至超净台内，吸弃旧培养基后用D-PBS清洗细胞两遍。加入0.125％胰酶(0.5mL/T25瓶)对细胞进行消化处理1-2min，之后用等体积含血清的培养基终止消化，用移液枪吹打瓶底将细胞悬浮后转移至15mL离心管中，并于1000rpm离心5min。吸弃上清后加入1mL完全培养基重悬细胞并计数，按2×104cells/mL的接种密度将细胞悬液接种在材料上，24孔板每孔先接种100μL细胞悬液，置于培养箱内培养2-4h后，每孔补足培养基到500μL进行培养，每2-3d换液，分别取培养第1、4、7d的时间节点进行CCK-8细胞活性评价实验。
e.综合性能优良的复合纳米纤维支架的筛选：根据上述d i-vi各项实验测试结果，从复合纤维膜的形貌、拓扑结构、热失重、亲水角以及细胞相容性分析，本实验最终优化质量配比为50:50的PLLA/SF复合纳米纤维支架用来进行后续的成骨诱导分化实验。如前dvi实验步骤所述将质量配比为50:50的PLLA/SF复合纳米纤维膜电纺于直径为14mm的盖玻片上，按照步骤c首先对负载纳米纤维的支架进行交联处理，然后进行无菌处理，将带盖玻片的材料裁剪好置于相应孔板中，在无菌超净台内用75％乙醇(上海凌峰化学试剂有限公司)浸泡2.5h以上，并用无菌D-PBS清洗(洗3次，每次5min)，之后紫外照射过夜杀菌处理，在4℃下无菌保存，以备后续实验。
f.成骨细胞的提取：取出生一天的SD大鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)浸泡于75％酒精中5-10min；取出置于无菌板上，用眼科剪将其头部剪下，用眼科镊挑起头部皮肤，剪取颅骨，剔除其他组织，置于PBS中清洗4-6遍，该操作在冰上进行；将颅骨剪碎，加入胰酶，置于细胞培养箱中消化30-40min；加入2倍体积的培养基终止消化，离心，用少量的成骨细胞完全培养基(DMEM+10％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺+1％青霉素/链霉素,均来自Gibco)于37℃，5％CO2培养箱中培养颅骨骨片；3-4h后，补加剩余的培养基继续培养；隔天换液，连续培养7d,待大量成骨细胞从骨片中爬出生长后，弃骨片，将成骨细胞收集进行传代培养，备用。
g.成骨细胞外基质的负载：将传至第3代的成骨细胞分别以1×104cells/mL的接种密度上述灭菌的质量配比为50:50的PLLA/SF复合纳米纤维支架上，培养10d，每2-3d换液，最后4d换成诱导基质分泌诱导液(成骨细胞完全培养基+50μmol/L的抗坏血酸，Sigma)。之后吸弃旧培养基，D-PBS冲洗2遍后，加入脱细胞处理液(D-PBS溶解的0.5％Triton X-100和20mmol/L的NH4OH,国药集团化学试剂有限公司)室温下处理5min用于裂解细胞，之后用D-PBS冲洗3遍，获得的负载细胞外基质的仿生支架于含1％双抗(Gibco)的D-PBS中4℃低温下可保存2个月。待细胞贴壁后，用新鲜配置的4％(w/v)多聚甲醛(上海宏生生物科技有限公司)固定细胞30-50min；再用0.1％TritonX-100处理细胞5-6min，以提高细胞通透性；PBS清洗3-5遍，该复合纳米纤维支架即制备而成，其扫描电镜图如图4B所示所示。
二、利用负载成骨细胞外基质的仿生复合纳米纤维支架来诱导干细胞成骨分化，具体方法如下：
a.MSCs(骨髓间充质干细胞)的提取：取3-4W的ICR小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)以脱颈法处死，在75％酒精中浸泡5-10min，在超净台中将其股骨和胫骨用眼科镊和眼科剪取出，在冰的PBS中清洗3-5次，除去上面的其他组织。用注射器吸取MSC培养基(DMEM/12+15％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺+1％青霉素/链霉素,均来自Gibco)将股骨和胫骨中的MSCs吹出，70μm滤器过滤杂质，1000rpm离心3-5min，MSC培养基重悬后，置于37℃，5％CO2的恒温培养箱培养，每2天更换一次培养液，直至细胞融合度达到85％以上开始传代培养，选择传3-5代细胞进行后续的成骨诱导分化实验。
b.MSCs在复合纳米纤维支架上的分化：种植MSCs的前一天，在预先放置负载成骨细胞外基质的PLLA/SF(50:50)复合纳米纤维支架的培养板中加入成骨细胞培养基(DMEM+10％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺+1％青霉素/链霉素,均来自Gibco)，进行孵育培养。选择传3-5代MSCs作为成骨分化种子细胞，按2×104cells/mL的接种密度将细胞悬液接种在材料上，采用成骨细胞培养基培养，置于37℃，5％CO2的恒温培养箱培养，每2天更换一次培养液，待培养至14d后，终止培养并进行成骨分化鉴定。
c.ALP染色：选用ALP染色试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行ALP染色，首先在培养终止后，吸弃培养基，PBS清洗3-5次，每次1-2min；吸弃PBS，加入碱性磷酸酶固定液固定30s；吸弃固定液，PBS清洗3-5次；吸弃PBS，依照试剂盒说明书配置染色液，加入到培养板中，置于恒温培养箱中孵育45min以上，至显色到预期结果；吸弃显色剂，蒸馏水清洗1-2次，置于荧光显微镜下观察、拍照。
d.ARS染色：选用ARS染色试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行ARS染色，首先在培养终止后，吸弃培养基，PBS清洗3-5次，每次1-2min；吸弃PBS，加入4％(w/v)多聚甲醛固定30min；吸弃固定液，PBS清洗3-5次；吸弃PBS，加入0.1％茜素红染色液到培养板中，置于恒温培养箱中孵育6-10min；吸弃显色剂，PBS清洗1-2次，置于荧光显微镜下观察、拍照。
结果分析：
a.如图3A所示，幼年SD大鼠颅骨骨片取材、培养以及成骨细胞生长示意图；图3B显示传3代的成骨细胞在玻片上的生长形貌良好，呈多边形铺展，且被大量细胞外基质包被，表明ECM分泌旺盛。由ALP染色和ARS染色结果如图3C和3D所示，可知，从颅骨骨片所爬出的细胞为成骨细胞。
b.如图4A所示，聚乳酸/丝素蛋白(PLLA/SF)共混纳米纤维膜纤维形貌良好，各成分分布均匀且仅存在简单的物理混合，综合其直径分布、亲水性，热重分析、力学性能和细胞相容性等测试结果，PLLA/SF＝50/50组的效果最佳，如图4B显示成骨细胞经过脱细胞处理后发现ECM并非二维结构，细胞外基质已负载于复合纳米纤维支架上，渗入材料内部，形成ECM沉积的网架结构。
c.成年小鼠MSCs成骨分化的14天后ALP染色结果如图5所示，由ALP染色结果可知，诱导液组、细胞外基质组、细胞外基质/材料组和细胞外基质/材料/成骨诱导液组均将细胞染成深紫色，即表现为ALP染色阳性，且细胞外基质/材料组和细胞外基质/材料/成骨诱导液组颜色较深，表明材料/细胞外基质组具有良好的成骨诱导分化作用。
d.成年小鼠MSCs成骨分化的14天后ARS染色结果如图6所示，由ARS染色结果可知，诱导液组、细胞外基质组、细胞外基质/材料组和细胞外基质/材料/成骨诱导液组均将细胞染成深红色，即表现为钙结节阳性，且细胞外基质/材料组和细胞外基质/材料/成骨诱导液组钙结节含量较高，表明材料/细胞外基质组具有良好的成骨诱导分化作用。
e.与之前CN105194734A公开了一种壳聚糖-细胞外基质组织修复膜及其制备方法相比，本发明采用静电纺丝技术制备的负载脱细胞基质的复合仿生纳米纤维支架可以很好的保留细胞外基质活性成分，赋予了支架良好的生物活性和潜在的成骨诱导分化功效，并为支架提供适当的机械性能，实验结果表明该支架具有很好的促进干细胞成骨分化，为临床上开发新型的骨组织再生支架提供新的思路。另外，PLLA和丝素蛋白取材广泛，物美价廉，适于规模化生产和临床应用。

Claims (10)

1.一种复合纤维支架材料，其特征在于，所述材料包括人造高分子纤维支架材料和细胞来源的细胞外基质材料，且所说的细胞外基质材料包覆在由所说的人造高分子纤维支架材料制成的纤维结构的外表面。
2.根据权利要求1所述支架材料，其特征在于，所述高分子纤维支架材料为左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架；细胞外基质材料为大鼠成骨细胞、成软骨细胞或神经细胞的外层基质材料。
3.一种复合纤维支架材料的制备方法，包括：
(1)将高分子纤维支架进行灭菌，清洗，加入培养基中进行预培养；
(2)将细胞种植在步骤(1)支架上，待细胞贴壁后固定细胞，然后脱细胞，即得。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中高分子纤维支架为左旋聚乳酸/丝素蛋白复合纳米纤维支架；其中左旋聚乳酸与丝素蛋白的质量比为3:7～7:3。
5.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中灭菌具体为：采用乙醇或甲醇处理纳米纤维支架，然后紫外照射灭菌。
6.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中细胞为鼠成骨细胞、成软骨细胞或神经细胞。
7.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中固定细胞为体积比4％(w/v)多聚甲醛固定细胞；脱细胞为：用TritonX-100处理细胞，清洗。
8.一种权利要求3所述方法制备的复合纤维支架材料。
9.一种基于权利要求8所述复合纤维支架材料接种间质干细胞后作为组织工程假体材料的应用。
10.一种权利要求1所述复合纤维支架在制备生物支架中的应用。
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