CN109331232B

CN109331232B - 一种表没食子儿茶素没食子酸酯交联的小肠黏膜下层引导骨再生膜的制备方法

Info

Publication number: CN109331232B
Application number: CN201811251660.1A
Authority: CN
Inventors: 解慧琪; 苟敏; 王航; 江燕林
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2020-05-15
Anticipated expiration: 2038-10-25
Also published as: CN109331232A

Abstract

本发明公开具有骨修复作用的材料，它是表没食子儿茶素没食子酸酯交联的小肠黏膜下层膜，其交联指数为15.76％‑21.44％。本发明还提供了前述材料的制备方法和用途。本发明材料具有良好的力学性能，且降解缓慢，能维持骨组织再生处的空间结构，同时具有良好的生物相容性和成骨效果，克服了现有小肠黏膜下层膜作为引导骨再生膜存在的机械性能差、降解速度快和空间维持能力差等缺点，具有良好的临床应用前景。

Description

一种表没食子儿茶素没食子酸酯交联的小肠黏膜下层引导骨再生膜的制备方法

技术领域

本发明涉及一种表没食子儿茶素没食子酸酯交联的小肠黏膜下层引导骨再生膜的制备方法。

背景技术

种植修复因具有较高的成功率，且不会损伤邻牙，已经成为单颗牙缺失修复的首选治疗方案。而对于多颗牙缺失及牙列缺失的患者，种植修复也具有很高的成功率。相对于传统的义齿修复，种植修复有更好的稳定性，舒适性和美观性，提高了咀嚼效率，大大改善了患者的生活质量。获得和长期维持成功骨结合是种植修复成功最重要的先决条件之一，即种植位点存在充足的健康骨量。这不仅仅指有足够的骨高度能容纳合适长度的植体，为修复体提供足够的支持，也包括足够的牙槽骨宽度，避免植体暴露。临床治疗中，部分病人水平或垂直骨量不足，为了获得良好的远期效果，这类病人需要植骨后再行种植修复。现有的骨增量手术有块状骨移植，上颌窦提升，引导骨再生(Guided bone regeneration,GBR)等，而GBR技术是目前预期性最好的骨增量手术。

引导骨再生(Guided bone regeneration,GBR)指的是在骨缺损的表面覆盖一层屏障膜，阻隔生长速度更快的上皮细胞及成纤维细胞长入骨缺损区域，使成骨细胞在骨缺损处优先生长，从而促进成骨的技术。理想的GBR膜要求具有良好的生物相容性，力学性能，空间维持能力，较强的可操作性，适当的降解时间，最好能兼具促进成骨的作用。

GBR膜可以分为不可吸收膜和可吸收膜两大类：不可吸收膜在体内不会发生降解，需要二次手术取出；可吸收膜可在体内降解，不需要二次手术取出。其中，可吸收膜中的胶原材料具有良好的生物相容性、凝血性、亲水性、黏附性和低免疫原性，因此胶原来源的GBR膜已经在临床使用中占据越来越重要的地位。目前常用的GBR膜为Bio-gide膜，其修复效果良好，但是存在力学性能不佳、降解过快、空间维持能力差的问题。

猪小肠黏膜下层(Small Intestinal Submucosa，SIS)是一种含多种细胞因子的胶原材料，已被FDA批准应用于多种组织缺损的修复重建。文献报道，SIS膜作为GBR膜引导骨组织再生时，能促进成骨因子BMP-2在膜中的表达和积累，从而激发成骨的级联反应，加速骨再生。SIS膜和人BMSCs复合培养，可以促进BMSCs分泌成血管细胞因子。这些报道都说明SIS膜可以作为一种屏障膜，应用于引导骨组织再生。但是SIS膜的主要成分是胶原，必然存在胶原材料机械性能差，降解速度快，空间维持能力差等缺点。文献报道，在没有骨充填材料的情况下，SIS膜会出现塌陷，且在28天时出现了明显的降解。为了弥补这一缺陷，对胶原材料进行交联是一种有效提升其机械性能，延长其降解时间，增强其空间维持能力的常用手段。现有的交联方法可以分为物理交联、化学交联。物理交联常见为热交联、γ射线交联和紫外交联，这种交联方式毒性小，但是交联效率低；化学交联效率高，其交联剂可以分为人工合成的化学交联剂和天然来源的生物交联剂，人工合成的化学交联剂(例如：戊二醛、甲醛等)毒性大、免疫反应强，而生物交联剂由于其低毒性近年来受到越来越多的关注。

目前未见交联后的小肠黏膜下层膜作为引导骨再生膜的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表没食子儿茶素没食子酸酯交联的小肠黏膜下层引导骨再生膜(EGCG-SIS)的制备方法。该方法得到的引导骨再生膜具有良好的机械性能、空间维持能力、可操作性，具有更长的降解时间，并具有良好的生物相容性和促进成骨作用。克服了现有小肠黏膜下层引导骨再生膜力学性能差、降解速度快、空间维持能力差的缺点。

本发明提供的一种具有骨修复作用的材料，它是表没食子儿茶素没食子酸酯交联的小肠黏膜下层膜，其交联指数为15.76％-21.44％。

所述引导骨再生膜的交联的方法是：将小肠黏膜下层膜放入表没食子儿茶素没食子酸酯的溶液中交联，洗涤，冻干。

优选地，所述表没食子儿茶素没食子酸酯溶液的浓度为0.001～0.02g/ml，所述小肠黏膜下层膜放入表没食子儿茶素没食子酸酯的溶液的比例为300～900mg：100ml，优选为600mg：100ml。

优选地，所述交联的温度是35～38℃，优选37℃；和/或，所述交联的时间为24～96h，优选48h。

其中，所述小肠黏膜下层膜按照如下方法制备：取小肠，去除浆膜层和肌层，脱脂，脱细胞，去垢，冻干。

优选地，所述脱脂是用体积比为1:1的甲醇和氯仿的混合溶液浸泡6-24小时，去离子水冲洗；和/或，所述脱细胞采用酶消化，在4-10℃环境中，于胰蛋白酶溶液中孵育6-24小时，生理盐水冲洗去除胰酶；优选地，所述混合溶液中，胰蛋白酶的浓度均为0.01～10％w/v，进一步优选为0.25％w/v；所述去垢是在十二烷基硫酸钠与氯化钠的混合溶液中处理3～5h，优选4h；所述溶液中十二烷基硫酸钠溶液的浓度为0.01％-1％w/v，优选浓度为0.5％w/v，氯化钠的浓度为0.01％-1％w/v，优选浓度为0.9％。

优选地，所述材料为1～4层。

本发明还提供了一种制备前述材料的方法，其特征在于：步骤如下：将小肠黏膜下层膜放入表没食子儿茶素没食子酸酯的溶液中交联，洗涤，冻干。

优选地，所述表没食子儿茶素没食子酸酯溶液的浓度为0.001～0.02g/ml，所述小肠黏膜下层膜放入表没食子儿茶素没食子酸酯的溶液的比例为300～900mg：100ml，优选为600mg：100ml；和/或，所述交联的温度是35～38℃，优选37℃，和/或，所述交联的时间为24～96h，优选48h。

本发明还提供了前述材料再生膜在制备促进骨修复的材料中的用途；优选地，所述材料是引导骨再生膜。

综上，本发明制备的EGCG交联的SIS形成的材料既具有良好的力学性能，满足引导骨再生膜所需要的力学要求；又降解缓慢，能维持骨组织再生处的空间结构，防止SIS膜坍塌；还具有良好的生物相容性，有利于细胞良好地黏附与铺展，克服了现有SIS膜作为引导骨再生膜存在的机械性能差、降解速度快和空间维持能力差等缺点。更为让人吃惊的是，本发明修复材料引导骨再生的性能还优于市售产品Bio-gide膜，为临床引导骨再生提供了一种更为优良的选择，具有良好的临床应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出更多其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS红外吸收光谱。

图2在37℃，交联48h条件下，SIS交联指数随EGCG浓度的变化(&代表与0.5％E-SIS组有统计学差异)。

图3不同交联浓度的EGCG-SIS的溶胀率随交联浓度的变化(*代表与SIS组有统计学差异；#代表与0.1％E-SIS组有统计学差异；$代表与0.25％E-SIS组有统计学差异；&代表与0.5％E-SIS组有统计学差异)。

图4未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS的接触角(*代表与SIS组有统计学差异)。

图5 100U/mL的胶原酶溶液处理1天、1周、2周和8周后EGCG-SIS的剩余质量百分比。

图6未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS差示扫描量热法分析。

图7未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS拉伸应力最大值时的载荷(图A)和弹性模量(图B)(*代表与SIS组有统计学差异；#代表与0.1％E-SIS组有统计学差异；$代表与0.25％E-SIS组有统计学差异；&代表与0.5％E-SIS组有统计学差异)。

图8分别为4层SIS膜的正面，背面和截面(低倍放大1000倍，比例尺为100μm，高倍放大倍数为2000倍，比例尺为50μm)。

图9分别为未交联SIS膜和不同EGCG交联浓度的SIS膜的正面(低倍放大1000倍，比例尺为100μm，高倍放大倍数为2000倍，比例尺为50μm)。

图10 CCK8测定SIS及不同交联浓度的EGCG-SIS浸提液培养1d的MC3T3-E1的细胞活性(Positive代表含1％苯酚、10％FBS的α-MEM培养基；Negative代表含10％FBS的α-MEM培养基)。

图11 CCK8测定SIS及不同交联浓度的EGCG-SIS浸提液培养1d的L929的细胞活性(Positive代表含1％苯酚、10％FBS的L-DMEM培养基；Negative代表含10％FBS的L-DMEM培养基)。

图12 MC3T3-E1细胞系分别接种在未交联SIS膜和不同交联浓度的EGCG-SIS膜上的细胞形态。低倍标尺为500μm，高倍标尺为100μm。

图13 L929细胞系分别接种在未交联SIS膜和不同交联浓度的EGCG-SIS膜上的细胞形态。低倍标尺为500μm，高倍标尺为100μm。

图14鬼笔环肽染色结果图。MC3T3-E1细胞系分别接种在未交联SIS膜和0.5％E-SIS膜上的细胞形态(图A)和L929细胞系分别接种在未交联SIS膜和0.5％E-SIS膜上的细胞形态(图B)(低倍标尺为200μm，高倍标尺为50μm)。

图15扫描电镜结果图。MC3T3-E1细胞系分别接种在未交联SIS膜和0.5％E-SIS膜上的细胞形态(图A)和L929细胞系分别接种在未交联SIS膜和0.5％E-SIS膜上的细胞形态(图B)(低倍标尺200μm，高倍标尺为50μm)。

图16 MC3T3-E1细胞接种在未交联SIS和0.5％E-SIS上基础培养基和成骨诱导培养基培养4d、7d和14d后碱性磷酸酶的活性(*代表每个时间点与对照组相比具有统计学差异)。

图17 MC3T3-E1细胞接种在未交联SIS和0.5％E-SIS上基础培养基和成骨诱导培养基培养14d后的钙沉积(*代表与对照组相比有统计学差异)。

图18 MC3T3-E1细胞接种在未交联SIS和0.5％E-SIS上基础培养基和成骨诱导培养基培养14d后的茜素红染色，空白对照组为没有细胞接种的SIS及0.5％E-SIS的茜素红染色。

图19大鼠颅骨缺损修复情况(Micro-CT分析)：三维重建图像(图A)，新生骨体积(图B)，新生骨面积(图C)和新生骨相对骨密度(图D)(*代表每个时间点与对照组相比具有统计学差异；#代表与SIS修复组有统计学差异；&代表与Bio-gide修复组有统计学差异)。

具体实施方式

缩略词：

SIS：小肠黏膜下层，EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯，SDS：十二烷基硫酸钠。

实施例1一种EGCG交联的SIS引导骨再生膜的制备方法

1、SIS膜的制备方法：

(1)清洗裁剪：取屠宰4h以内的新鲜猪小肠一副，仅取空肠段，用大量清水反复冲洗，沿系膜纵向剖开并剪成15cm～20cm的肠段；

(2)机械刮除：机械刮除所剪肠段外面的浆膜层和肌层，放入生理盐水中漂洗3次，每次5min；

(3)脱脂：将漂洗好的膜拧干水分，放入1000mL(甲醇：氯仿体积比为1:1)脱脂溶液中，置于通风橱中12h，中间更换一次脱脂溶液；

(4)冲洗：倒掉脱脂溶液，用大量流动清水反复冲洗脱脂后的膜，直至没有任何有机溶剂气味，去离子水再漂洗3遍，每次5min；

(5)胰酶消化：在1000mL PBS溶液中加入2.5g胰蛋白酶配制成浓度为0.25％的胰酶消化液，将拧干后的膜放入消化液中，4℃过夜，去离子水反复洗涤去除胰蛋白酶；

(6)SDS脱细胞：在1000mL去离子水中加入5g SDS粉末和9g NaCl粉末，配制成0.5％的脱细胞溶液，将拧干的膜放入其中，室温处理4h。大量去离子水反复漂洗，去除SDS；

(7)冻干和灭菌：将处理好的膜铺平，真空冷冻干燥机中冻干，密封，环氧乙烷消毒保存。

2、EGCG交联SIS膜：

1)交联溶液的配制：称取0.1g的EGCG粉末溶于100mL PBS溶液中，配制成浓度为0.1％的交联溶液，避光保存；

2)SIS膜的交联：将一张SIS膜(150mg)放入25mL配制好的交联溶液中，37℃恒温摇床中避光交联48h；

3)交联后SIS膜的清洗：将交联后的SIS膜用PBS和去离子水反复洗涤；

4)冻干与灭菌：

a.单层材料：将交联后的SIS膜铺平，黏膜面朝上，真空冷冻干燥机冻干，环氧乙烷灭菌；

b.双层材料：将交联后的SIS膜交叉重叠后铺平，黏膜面朝上，真空冷冻干燥机冻干，环氧乙烷灭菌；

c.四层材料：将交联后的SIS膜对折，交叉重叠后铺平，黏膜面朝上，真空冷冻干燥机冻干，环氧乙烷灭菌。

实施例2一种EGCG交联的SIS引导骨再生膜的制备方法

1、SIS膜的制备方法：

与实施例1相同。

2、EGCG交联SIS膜：

1)交联溶液的配制：称取0.25g的EGCG粉末溶于100mL PBS溶液中，配制成浓度为0.25％的交联溶液，避光保存；

3)交联后SIS膜的清洗：将交联后的SIS膜用PBS和去离子水反复洗涤；冻干与灭菌：

实施例3一种EGCG交联的SIS引导骨再生膜的制备方法

1、SIS膜的制备方法：

与实施例1相同。

2、EGCG交联SIS膜：

1)交联溶液的配制：称取0.5g的EGCG粉末溶于100mL PBS溶液中，配制成浓度为0.5％的交联溶液，避光保存；

实施例4一种EGCG交联的SIS引导骨再生膜的制备方法

1、SIS膜的制备方法：

与实施例1相同。

2、EGCG交联SIS膜：

1)交联溶液的配制：称取1g的EGCG粉末溶于100mL PBS溶液中，配制成浓度为1％的交联溶液，避光保存；

4)冻干与灭菌：

实施例5一种EGCG交联的SIS引导骨再生膜的制备方法

1、SIS膜的制备方法：

与实施例1相同。

2、EGCG交联SIS膜：

1)交联溶液的配制：称取2g的EGCG粉末溶于100mL PBS溶液中，配制成浓度为2％的交联溶液，避光保存；

4)冻干与灭菌：

以下用实验例的方式来证明本发明的有益效果：

在实验例中，实施例1～5制备的EGCG交联的SIS引导骨再生膜(EGCG-SIS)分别命名为0.1％E-SIS、0.25％E-SIS、0.5％E-SIS、1％E-SIS和2％E-SIS。

实验例1 EGCG交联的SIS引导骨再生膜的理化性能评价

(一)傅里叶红外光谱分析

1、实验方法

将单层未交联的SIS及实施例1～5制备的EGCG-SIS真空干燥后，用美国Nicolet公司170SX型傅里叶红外光谱仪测试，扫描波数为4000～400cm^-1。

2、实验结果

未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS的傅里叶红外光谱结果如图1和表1所示。

表1未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS红外吸收光谱中1236/1450吸收峰值的比值和酰胺II带的位置。

1645cm^-1为酰胺I带特征吸收峰，1544cm^-1为酰胺II带特征吸收峰，1236cm^-1为酰胺III带特征吸收峰，2925cm^-1为-CH₂振动吸收峰，3307cm^-1为氢键特征吸收峰；1236/1450吸收峰值的比值为1.0～1.1之间，代表蛋白质二级结构得到完整保存，蛋白质变性的临界值为0.6。由图1和表1可知，相比未交联的SIS，不同EGCG浓度交联得到的EGCG-SIS氢键吸收峰变宽，证明有氢键形成；此外，酰胺Ⅱ带能灵敏地反映分子间或分子内的氢键缔合作用，当氢键破坏时，谱带将向高波数移动，当氢键数增加时，谱带会向低波数移动，交联后的EGCG-SIS酰胺II带所对应的波数都向低波数移动，证明有氢键形成，EGCG和SIS发生了交联。酰胺1带、II带和III带的吸收峰值显著降低，有可能是SIS中的-NH₂和醛基反应产生了稳定的席夫碱，取代了部分氢键的形成。1236/1450吸收峰值的比值均接近1.0，证明蛋白质的二级结构得到了完整的保存。

实验结果表明，EGCG与SIS之间通过氢键交联，且在交联过程中，蛋白质二级结构得到了完整的保存。

(二)交联指数

1、实验方法

(1)茚三酮溶液的配制：称取1.05g柠檬酸和0.04g氯化亚锡(SnCl₂.2H₂O)溶于10mL(1.0M)NaOH溶液中，加去离子水至总体积为25mL，配制成A液；称取1.112g水合茚三酮粉末溶于25mL的乙二醇甲醚中，配制成B液；将A液和B液混合，搅拌45min，制备成茚三酮溶液，储存于棕色瓶中，避光保存备用。

(2)甘氨酸标准曲线的描绘：称取0.1g甘氨酸溶解于1000mL去离子水中，制备成浓度为0.01％的甘氨酸溶液待用。分别吸取50、100、150、200、250、500uL(分别相当于浓度0.0640、0.1212、0.1739、0.2222、0.2667和0.4444μmol/mL的NH₂溶液)的甘氨酸溶液于1mL的茚三酮溶液中，混匀后，于沸水中加热20min，冷却至室温，加入5mL 50％的异丙醇溶液，充分混匀后，吸200uL加入96孔板中，采用分光光度计在570nm下测量吸光值。

(3)交联指数的测定：单层未交联的SIS及实施例1～5制备的EGCG-SIS各称取约1.5mg，每组同时设置三个平行样，放入15mL离心管中，加入1mL茚三酮溶液，于沸水中加热20min，冷却至室温，加入5mL 50％异丙醇溶液，充分混匀后，吸200uL于96孔板中，采用分光光度计在570nm下测量吸光值。根据甘氨酸标准曲线，计算SIS及各组EGCG-SIS中自由氨基的含量，所有的反应均在避光条件下进行，交联指数按以下公式计算：

CI(％)＝(M_S-M_E)/M_S×100％

其中CI表示交联指数，M_S表示单位质量未交联SIS中所含有的自由氨基的摩尔数，M_E表示单位质量EGCG交联的SIS中所含有的自由氨基的摩尔数。

2、实验结果

未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS的交联指数如图2和表2所示。

表2未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS的交联指数。

由图2和表2可知，EGCG交联浓度在0.1％～0.25％时，交联指数变化不大；当交联浓度为0.5％～1％时，随交联浓度增加，交联指数逐渐下降；交联浓度为1％～2％时，随浓度增加，交联指数又逐渐上升；交联浓度为0.5％时，交联指数最大，并且与其他交联浓度具有统计学差异。

实验结果说明，EGCG能够和SIS交联，其交联指数与EGCG浓度相关，但并不是浓度越高越好，优选的EGCG交联浓度为0.5％。

(三)溶胀试验

1、实验方案

将单层未交联的SIS及实施例1～5制备的EGCG-SIS裁剪成3cm×3cm大小，分别测定材料重量，然后将材料分别浸泡在PBS中，37℃条件下浸泡24h，吸干材料表面水分，分别测定材料的重量，按以下公式计算溶胀率：

S_w(％)＝(W_s-W_i)/W_i×100％

其中S_w代表溶胀率，W_i代表材料浸泡在PBS前的初始重量，W_s为材料吸水后的重量。

2、实验结果

未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS的溶胀率如图3所示。由图3可知，SIS膜经EGCG交联后，其溶胀率大大增加，交联浓度在0.1％～0.5％之间时，随交联浓度增加，溶胀率逐渐增加，交联浓度超过0.5％，溶胀率有所下降，但是交联浓度增加到2％，溶胀率又有所上升。交联后溶胀率的提升可能和SIS与EGCG之间形成氢键有关，使其更亲水。试验结果证明交联后的材料也更亲水，有利于细胞的黏附。

实验结果说明，EGCG-SIS的溶胀率增加。

(四)接触角试验

1、实验方法

将单层未交联的SIS及实施例1～5制备的EGCG-SIS剪成1cm×2cm大小，每组3片，用接触角测量仪测量3uL水滴接触材料第1秒时的接触角大小，每片测2个点。

2、实验结果

未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS的接触角如图4和表3所示。

表3未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS的接触角。

由图4和表3可知，未交联的SIS接触角为83.75±5.54°，EGCG交联后的SIS接触角约为55°，EGCG-SIS的亲水性相比未交联的SIS明显提高，具有统计学差异。

此实验结果与溶胀性实验的猜想一致，证明EGCG交联SIS后形成更多氢键，使EGCG-SIS更加亲水。

(五)降解试验

1、实验方案

将单层未交联的SIS及实施例1～5制备的EGCG-SIS裁剪成直径为15mm的圆片，将样品浸泡于I型胶原酶溶液中(100U/mL)中，置于37℃水平摇床中，每隔两天换液，分别在第1天、1周、2周、8周取出3片材料，用去离子水清洗干净胶原酶溶液，真空冷冻干燥机冻干，剩余质量百分比按如下公式计算：

W(％)＝M₁/M₀×100％

其中，M₀为材料的初始质量，M₁为不同时间点材料冻干后的质量，W为剩余质量百分比。

2、实验结果

未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS的剩余质量百分比结果如图5所示。未交联的SIS在24h内降解为碎片，无法取材，而降解8周后，EGCG交联后的SIS膜剩余质量百分比仍可达到80％以上，其中0.1％E-SIS降解率最大，剩余质量百分比约为83％；0.25％、1％和2％E-SIS降解率居中，剩余质量百分比约为90％；0.5％E-SIS降解最少，剩余质量百分比约为93％。

实验结果说明，EGCG交联后能明显减缓SIS膜的降解速率，且EGCG浓度为0.5％时为优选浓度，此时EGCG-SIS膜的降解速率最缓慢，此结果与交联指数实验结果一致，交联程度越大，降解速度越慢。

(六)差示扫描量热法分析

1、实验方法

将单层未交联的SIS及实施例1～5制备的EGCG-SIS真空干燥后，用美国TA公司Q200型差示扫描量热仪进行测试。温度范围为25～200℃，升温速率为10℃/min。

2、实验结果

未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS的差示扫描量热法结果如图6所示。由图6可知，SIS经EGCG交联后，变性温度增加，胶原稳定性增加，交联浓度为0.5％时，变性温度最高，比未交联的SIS升高约10℃。

实验结果说明，经EGCG交联后的SIS稳定性明显增加，且EGCG浓度为0.5％时，稳定性最优，与降解试验结果一致。

(七)力学测试

1、实验方案

按照GB/T528中3型标准，将单层未交联的SIS及实施例1～5制备的EGCG-SIS裁剪成长度为5cm，中间平行部分为4mm的哑铃型，以10mm/min的速率对材料进行单轴拉伸测试，测定材料拉伸应力在最大值时的载荷以及弹性模量。

2、实验结果

未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS力学性能如图7所示。由图7可知，与未交联SIS相比，经EGCG交联后的SIS，拉伸应力最大值时的载荷和弹性模量明显提升了。交联浓度在0.1％～0.5％之间时，随交联浓度增加，力学性能逐渐增加，当交联浓度为0.5％时，拉伸应力最大值时的载荷约为未交联SIS的2倍，弹性模量约为3.5倍；交联浓度超过0.5％，力学性能虽有所下降，但是弹性模量仍高于未交联SIS，且交联浓度增加到2％，力学性能又有所上升。

实验结果表明，经EGCG交联后的SIS力学性能提高，更能满足作为引导骨再生膜的力学需求，且EGCG浓度为0.5％时，力学性能达到最优。

(八)扫描电镜对材料的亚显微结构观察

1、实验方法

对样品(单层、四层未交联SIS和单层不同交联浓度的EGCG-SIS)进行临界点干燥，将导电胶涂到样品台上，用镊子轻夹样品边缘，粘贴后，待导电胶干透，进行真空镀膜和SEM镜检。

2、实验结果

未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS扫描电镜结果如图8和图9所示。由图8可知，SIS黏膜面为多孔结构，有利于细胞的黏附；浆膜面致密，有利于阻挡细胞的长入和穿透；截面可以看到4层SIS膜厚约50μm，各层之间连接紧密，没有分层。由图9可知，未交联的SIS纤维纤细，排列无序，SIS经EGCG交联后变得紧凑，直径变粗，纤维排列呈现出一定的方向性，可能与EGCG与SIS之间形成氢键，发生交联有关。胶原纤维间空隙减少，形成编织网状结构，有利于提高机械性能。

由EGCG交联的SIS引导骨再生膜的理化性能评价结果可知，SIS经EGCG交联后，其溶胀性、亲水性、抗酶降解能力、热稳定性和力学性能均显著性增加，且当EGCG浓度为0.5％时，上述性质均为最优，因此EGCG交联SIS的最优交联浓度为0.5％。

实验例2 EGCG交联的SIS引导骨再生膜的生物相容性评价

(一)间接细胞毒性

1、实验方法

采用CCK8试剂盒测定未交联的SIS及实施例1～5制备的EGCG-SIS的间接细胞毒性，方法如下：

(1)浸提液的制备：将单层未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS裁剪为2cm×3cm的矩形(表面积约为12cm²)，低温环氧乙烷灭菌，于通风橱中放置1周，待用。按1mL培养基/6cm²材料浸提比例，将材料浸泡在2mL含10％FBS的α-MEM培养基(MC3T3-E1)或L-DMEM培养基(L929)中，无菌条件下于37℃孵箱中浸提24h，收集浸提原液于2mL无菌EP管中。并稀释EGCG-SIS浸提液成100％、75％、50％和25％浸提原液。阳性对照为含1％苯酚、10％FBS的培养基，阴性对照组为含10％FBS的培养基。

(2)细胞接种：取对数生长期的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1或者小鼠成纤维细胞L929，用胰蛋白酶将细胞消化下来，用细胞计数板计数，调整密度为1×10⁵个细胞/mL。在96孔板的外围孔中加入100μL培养基/孔，在其余孔中加入100μL密度为1×10⁵个细胞/mL的细胞悬液(＝1×10⁴个细胞/孔)，每个组设置5个平行孔。细胞孵育24h后形成半融合层。在倒置相差显微镜下检查培养板各孔细胞增长相对相等。

(3)更换培养基：孵育24h后弃去培养基，每孔加入100μL各浓度的EGCG-SIS浸提原液、或100％SIS浸提原液、或阴性对照、或阳性对照，孵育24h。

(4)CCK8检测：小心弃去培养基，每孔加入110μL含10％CCK8的培养基，避光孵育2h。然后每孔吸取100μL CCK8溶液至新的孔板中，用分光光度计在450nm处检测吸光值。

(5)结果计算及评价：按如下公式计算各组浸提液的细胞存活率：

式中：OD_450e指的是各浓度浸提原液和阳性对照组的吸光值的平均值；OD_450c指的是阴性组吸光值的平均值。

2、实验结果

未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS的间接细胞毒性如图10和图11所示。由图10和图11可知，无论是MC3T3-E1细胞，还是L929细胞，不同交联浓度的EGCG-SIS100％浸提液组吸光值都处于较高水平，且各EGCG-SIS组随着浸提液稀释比例地增加，吸光值均逐渐增加。计算可得，各EGCG-SIS组细胞存活率均大于80％，根据GB/T 16886.1/ISO 10993-1，不同交联浓度的EGCG-SIS均无细胞毒性。

(二)直接细胞毒性

1、实验方法

采用活死染色测定未交联的SIS及实施例1～5制备的EGCG-SIS的直接细胞毒性，方法如下：

(1)细胞接种：将单层未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS裁剪成直径为16mm的圆片，低温环氧乙烷灭菌,于通风橱中放置1周，待用。放置于24孔板中，每孔加入α-MEM培养基(MC3T3-E1)或L-DMEM培养基(L929)500μL，浸泡2h后，弃掉培养基。取对数生长期的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1或者小鼠成纤维细胞L929，用胰蛋白酶将细胞消化下来，用细胞计数板计数，稀释成6×10⁴个/mL的细胞悬液，每孔加入0.5mL的细胞悬液(＝3×10⁴个细胞/孔)，隔天换液，于培养第3天收样。

(2)钙黄绿素和碘化丙啶溶液的配制：将钙黄绿素粉末溶解于DMSO中制备成浓度为1mM的母液，将碘化丙啶粉末溶解于PBS溶液中制备成浓度为1mM的母液。吸取4μL钙黄绿素母液和2μL碘化丙啶母液加入2mLPBS溶液中制备成浓度分别为2μM和1μM的工作液。

(3)活性染色：弃掉培养基，PBS清洗3遍，每次2min，洗去未黏附的细胞。然后每孔加入200μL染液，37℃避光孵育20min。用PBS清洗2遍，每次2min。然后用激光共聚焦显微镜对材料上的细胞形态和数量进行观察。

2、实验结果

未交联SIS和不同交联浓度的EGCG-SIS的直接细胞毒性如图12和图13所示。由图12和13可知，培养第3天后，未交联SIS及不同交联浓度的EGCG-SIS材料表面均有大量的活细胞和少量的死细胞。MC3T3-E1细胞和L929细胞均活力良好，有伪足伸出，且细胞在EGCG-SIS上延展得更开，有更多的伪足伸出。实验结果说明EGCG交联后的SIS更利于细胞伸展。

(三)细胞黏附

1、实验方法

采用鬼笔环肽染色和扫描电镜观察未交联的SIS及实施例3制备的0.5％E-SIS上的细胞黏附，方法如下：

A.鬼笔环肽染色

(1)细胞接种：将单层SIS及0.5％E-SIS裁剪成直径为16mm的圆片，低温环氧乙烷灭菌，于通风橱中放置1周，待用。放置于24孔板中，每孔加入α-MEM培养基(MC3T3-E1)或L-DMEM培养基(L929)500μL，浸泡2h后，弃掉培养基。取对数生长期的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1或者小鼠成纤维细胞L929，用胰蛋白酶将细胞消化下来，用细胞计数板计数，稀释成2×10⁴个/mL的细胞悬液，每孔加入0.5mL的细胞悬液(＝1×10⁴个细胞/孔)。隔天换液，于培养第3天收样。

(2)罗丹明溶液、DAPI溶液和0.1％Triton100溶液的配制：吸取5μL罗丹明溶液于1mL PBS中制备成浓度为100nM的工作液；将DAPI粉末溶解于去离子水中制备成浓度为1mg/mL的母液，吸取1μL DAPI母液于1mLPBS溶液中制备成浓度为1μg/mL的工作液；吸取100μLTriton 100液体加入100mL PBS中，混合均匀，制备浓度为0.1％的Triton 100溶液。

(3)鬼笔环肽染色：弃掉培养基，PBS清洗3遍，每次5min，洗去未黏附的细胞。然后每孔加入1mL多聚甲醛，室温固定30min，PBS清洗3遍，每次5min；每孔加入0.1％Triton100溶液1mL，室温放置30min，PBS清洗3遍，每次5min；每孔加入罗丹明溶液250μL，37℃避光孵育45min，用PBS清洗3遍，每次5min；每孔加入DAPI溶液250μL，室温放置5min，用PBS清洗3遍，每次5min。然后用激光共聚焦显微镜对材料上的细胞形态进行观察。

B.扫描电镜

(1)细胞接种：将单层SIS及0.5％E-SIS裁剪成直径为16mm的圆片，低温环氧乙烷灭菌,于通风橱中放置1周，待用。放置于24孔板中，每孔加入α-MEM培养基(MC3T3-E1)或L-DMEM培养基(L929)500μL，浸泡2h后，弃掉培养基。取对数生长期的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1或者小鼠成纤维细胞L929，用胰蛋白酶将细胞消化下来，用细胞计数板计数，稀释成2×10⁴个/mL的细胞悬液，每孔加入0.5mL的细胞悬液(＝1×10⁴个细胞/孔)。隔天换液，于培养第3天收样。

(2)2.5％戊二醛溶液的配制：称取17.81g Na₂HPO₄·2H₂O粉末溶解于500mL去离子水中制备成浓度为0.2M的磷酸氢二钠贮备液(A液)；称取13.8gNaH₂PO₄·H₂O溶解于500mL去离子水中制备成浓度为0.2M的磷酸二氢钠贮备液(B液)；取40.5mL A液和9.5mL B液混合成0.2M的磷酸缓冲液(pH＝7.4)；取25％戊二醛溶液1mL，去离子水4mL和0.2M的磷酸缓冲液5mL混合均匀制备成浓度为2.5％的戊二醛固定液。

(3)样本固定及脱水：弃掉培养基，PBS清洗3遍，每次5min，洗去未黏附的细胞。然后每孔加入1mL 2.5％的戊二醛固定液，4℃放置24h，PBS清洗3遍，每次5min。真空冷冻干燥机冻干。

(4)电镜扫描：对样品进行临界点干燥，将导电胶涂到样品台上，用镊子轻夹样品边缘，保证细胞接种面朝上。粘贴后，待导电胶干透，进行真空镀膜和SEM镜检。

2、实验结果

未交联SIS和0.5％E-SIS的鬼笔环肽染色和扫描电镜结果分别如图14和图15所示。由图14和图15可知，与未交联SIS相比，MC3T3-E1细胞和L929细胞在0.5％E-SIS上延展得更开，有更多伪足伸出。此结果与活死染色结果一致，说明EGCG交联后的SIS更利于细胞的伸展。

由EGCG交联的SIS引导骨再生膜的生物相容性评价结果可知，利用EGCG交联后的SIS并未有细胞毒性，反而更利于细胞在SIS上的黏附与伸展。

实验例3 EGCG交联的SIS引导骨再生膜的成骨能力评价

(一)碱性磷酸酶的测定

1、实验方法

测定MC3T3-E1细胞在未交联的SIS及实施例3制备的0.5％E-SIS上的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性，方法如下：

(1)细胞接种：将单层未交联SIS及0.5％E-SIS裁剪成直径为16mm的圆片，低温环氧乙烷灭菌,于通风橱中放置1周，待用。放置于24孔板中，每孔加入含10％FBS的α-MEM培养基500μL，浸泡2h后，弃掉培养基。消化MC3T3-E1细胞，用细胞计数板计数，稀释成1×10⁵个/mL的细胞悬液，每孔加入0.5mL的细胞悬液(＝5×10⁴细胞/孔)。基础培养基组：次日更换基础培养基，然后隔天换液，于培养第4d、7d和14d收样；成骨诱导组：次日更换培养基为成骨诱导培养基，隔天换液，于成骨诱导培养第4d、7d和14d收样。

(2)样本收集：收样时，将材料转移至新的孔板中，PBS清洗3遍，每次2min，洗去未黏附的细胞，然后加入1mL 37℃预热的0.25％胰蛋白酶+EDTA，室温消化3min，加入0.5mL含10％FBS的培养基终止消化，用枪尖反复吹打，尽量将材料表面黏附的细胞吹打下来，收集每个样本细胞悬液于1.5mL的EP管中。12000rpm离心8min，吸去上清，加入1mL的PBS吹匀，再次12000rmp离心8min，重复2次。最后一次吸去上清后，倒置EP管，滤干水分，每管加入70uL的去离子水，吹匀。将EP管放入液氮中30s，然后转移至-20℃冰箱中放置30s，然后于室温下解冻，如此再重复3遍，然后将样本保存于-20℃冰箱中。

(3)ALP检测：将第4d，7d和14d的样本室温下解冻，按照说明书，设置空白孔3个，标准孔3个，测定孔4个，分别加入双蒸水30uL、0.02mg/mL的酚标准液30uL和待测样本30uL，然后每孔加入缓冲液和基质液各50uL，充分混匀后，37℃水浴15min，最后，每孔加入150uL的显色剂，用分光光度计在520nm处检测吸光值。

(4)BCA蛋白浓度测定：

a.蛋白标准品的配制及稀释：取1.2mL的蛋白标准配制液于装有30mg标准蛋白的试剂管中，充分溶解，得到浓度为25mg/mL的蛋白标准液，-20℃长期保存。吸取20μL蛋白标准液于980μL PBS中，得到浓度为0.5mg/mL的蛋白标准品的稀释液，-20℃长期保存；

b.BCA工作液的配制：6.5mL试剂A与130μL试剂B按照50:1的比例混合，室温24h稳定；

c.蛋白浓度的检测：在96孔板中分别加入蛋白标准品稀释液0μL、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL和20μL，然后每孔再加入PBS，补齐至总体积为20μL，其最终的蛋白浓度为0mg/mL、0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL和0.5mg/mL。然后加入BCA工作液200μL，37℃放置20min，用分光光度计在562nm处测定吸光值。

d.样本测定：在96孔板中分别加入上述解冻样本20μL，然后加入BCA工作液200μL，37℃放置20min，用分光光度计在562nm处测定吸光值。

(5)ALP活性的计算：

a.样本蛋白浓度的计算：根据蛋白标曲的测定，绘制出蛋白浓度与吸光值之间的线性关系图，计算其线性方程，根据此方程换算出相应样本所含蛋白的浓度；

b.样本ALP活性的计算：

2、实验结果

未交联SIS和0.5％E-SIS上MC3T3-E1细胞的ALP活性结果如图16所示。由图16可知，在基础培养基中，MC3T3-E1细胞在SIS及0.5％E-SIS上的ALP活性均很低；在成骨诱导培养基中，MC3T3-E1细胞在SIS及0.5％E-SIS上的ALP活性较高，且在第4d、7d和14d，MC3T3-E1细胞在0.5％E-SIS上的ALP活性均比在SIS上高，且具有统计学差异。

(二)钙沉积

1、实验方法

测定MC3T3-E1细胞在未交联的SIS及实施例3制备的0.5％E-SIS上的钙沉积，方法如下：

(1)细胞接种：将单层SIS及0.5％E-SIS裁剪成直径为16mm的圆片，低温环氧乙烷灭菌,于通风橱中放置1周，待用。放置于24孔板中，每孔加入含10％FBS的α-MEM培养基500μL，浸泡2h后，弃掉培养基。消化MC3T3-E1细胞，用细胞计数板计数，稀释成1×10⁵个/mL的细胞悬液，每孔加入0.5mL的细胞悬液(＝5×10⁴细胞/孔)。基础培养基组：次日更换基础培养基，然后隔天换液，于培养第14d收样；成骨诱导组：次日更换培养基为成骨诱导培养基，隔天换液，于成骨诱导培养第14d收样。

(2)样本收集：收样时，弃掉培养基，去离子水清洗3遍，每次2min，然后将材料转移至1.5mL的EP管中，加入0.6mol/L的HCl溶液400μL，盖上盖子，封口胶密封，放入37℃摇床中24h。然后每个EP管中加入5mol/L的NaOH溶液48μL中和至中性，反复吹打均匀后，1200rpm离心5min，吸取上清至新的1.5mLEP管中保存。

(3)钙沉积检测：按照说明书，设置空白孔3个，标准孔3个，测定孔4个，分别加入双蒸水10uL、1mmol/L的钙标准液10uL和待测样本10uL，然后每孔加入250uL的工作液I，静置5min后，用分光光度计在610nm处检测吸光值。

2、实验结果

MC3T3-E1细胞在未交联SIS和0.5％E-SIS上的钙沉积结果如图17所示。由图17可知，无论是在基础培养基中还是在成骨诱导培养基中培养14d后，MC3T3-E1在0.5％E-SIS上的钙沉积量均比在SIS上高，且具有统计学差异。

(三)茜素红染色

1、实验方法

对未交联SIS及实施例3制备的0.5％E-SIS进行茜素红染色，方法如下：

(2)茜素红溶液的配制：

a.0.1％Tris-HCl溶液(pH＝4.2)的配制：称取0.1g Tris-base粉末，溶解于60mL去离子水中，完全溶解后转移至100mL定容瓶中，清洗容器3次，每次5ml，并将清洗后的溶液转移至定容瓶中。用1mol/L的HCl溶液和1mol/L的NaOH溶液调整pH至4.2，然后加入去离子水至刻度线下方2cm处，再次用pH计测量pH值，微调至pH值至4.2后加入去离子水至刻度线，混匀后转移至玻璃瓶中；

b.0.1％茜素红溶液的配制：称取0.02g茜素红粉末，溶于20mL 0.1％Tris-HCl溶液(pH＝4.2)中，震荡至完全溶解，0.2μm滤器过滤。

(3)茜素红染色：收样时，将材料转移至新的孔板，PBS清洗3遍，每次2min，每孔加入多聚甲醛500μL，室温固定30min。PBS清洗3遍，每次2min，每孔加入茜素红溶液1mL，37℃放置10min，然后用PBS反复清洗材料。

(4)镜下观察：于正置显微镜下观察钙结节染色情况并拍照。

2、实验结果

未交联SIS和0.5％E-SIS的茜素红染色结果如图18所示。由图18可知，未接种细胞的材料茜素红染色几乎无着色；在基础培养基中，MC3T3-E1在SIS及0.5％E-SIS上的茜素红染色较浅，可见散在浅色结节，两组之间未见明显差异；在成骨诱导培养基中，MC3T3-E1在SIS和0.5％E-SIS上的茜素红染色均明显，在0.5％E-SIS上的钙结节比在SIS上的稍大。

由EGCG交联的SIS引导骨再生膜的成骨能力评价结果可知，经EGCG交联后，SIS的促成骨能力强于未交联的SIS。

实验例4 EGCG交联的SIS引导骨再生膜的体内成骨效果评价

采用动物实验评价未交联的SIS及EGCG-SIS的成骨效果，方法如下：

(1)实验动物：健康雄性SD大鼠24只，体重250～300g，购于四川省动物养殖中心(伦理备案号：2018015A)。华西动物房饲养一周后待用。

(2)实验材料及分组：将四层冻干的未交联的SIS、四层0.5％E-SIS和对照材料Bio-gide裁剪成10mm×10mm大小的正方形，环氧乙烷灭菌后，放置在通风橱1周，待用。实验分为空白对照组(无材料修复)，SIS修复组，0.5％E-SIS修复组和Bio-gide修复组。

(3)手术操作：用1g/mL的水合氯醛，按100g体重0.35mL的麻醉剂量对SD大鼠进行腹腔麻醉。将麻醉后的大鼠固定于手术板上。将大鼠双耳连线至瞳孔连线之间的区域的毛用电动剃毛器剃光暴露手术区域，用碘伏消毒后，铺巾，正中切开皮肤，剥离骨膜，用种植环钻于顶骨左右各造一5mm的圆形全层颅骨极限缺损，空白对照组不放置材料，修复组在缺损上方覆盖10mm×10mm SIS膜、0.5％EGCG交联的SIS膜和Bio-gide生物膜，然后用5-0的缝线分层缝合骨膜，皮下组织和皮肤，再次碘伏消毒。将术后大鼠放置于电热毯上30min，待其苏醒后放入笼中。

(4)术后大体观察及取材：术后观察大鼠的饮食、体重及活动情况，手术部位有无脱线、材料暴露情况，伤口有无红肿、渗液及流脓情况。于4周和8周安乐死动物，每组3只，取材，10％中性甲醛固定48h。

(5)Micro-CT分析：用SCANCO MEDICAL AG/瑞士μCT50对固定后的标本进行扫描。扫描精度为18μm，扫描高度为10mm，扫描电压为70kVp，电流为200μA，AL 0.5mm，1×300ms。重建大鼠颅骨三维图像，比较各组新生骨体积、骨面积和骨密度，灰度阈值为220。

2、实验结果

未交联SIS和EGCG-SIS的Micro-CT结果如图19所示。由图19可知，当植入4周时，0.5％E-SIS修复组的新生骨体积和骨面积都高于空白对照组、SIS修复组和Bio-gide修复组，且具有统计学差异，其对骨缺损的修复效果最好。植入8周时，空白对照组仍有明显骨缺损未修复，而SIS修复组、Bio-gide修复组和0.5％E-SIS修复组骨缺损都得到了明显的修复；Bio-gide修复组的新生骨体积高于空白对照组和SIS修复组，而新生骨面积仅高于空白对照组，与SIS修复组相似；0.5％E-SIS修复组无论是新生骨体积还是骨面积都明显高于其他三组，且具有统计学差异。实验结果说明，经EGCG交联后的SIS具有良好的成骨效果，其骨引导效果优于Bio-gide和未交联SIS。

综上所述，本发明制备的EGCG交联的SIS引导骨再生膜既具有良好的力学性能，满足引导骨再生膜所需要的力学要求；又降解缓慢，能维持骨组织再生处的空间结构，防止SIS膜坍塌；还具有良好的生物相容性，有利于细胞能好的黏附与伸展。克服了现有SIS膜作为引导骨再生膜存在的机械性能差、降解速度快和空间维持能力差等缺点。同时，经EGCG交联后的SIS具有更好的成骨效果，促进骨再生。因此，本发明制备的EGCG交联的SIS引导骨再生膜为引导骨再生提供了一种新的选择，具有良好的临床应用前景。

Claims

1.一种具有骨修复作用的材料，其特征在于：它是表没食子儿茶素没食子酸酯交联的小肠黏膜下层膜，其交联指数为15.76％-21.44％；

所述交联的方法是：将小肠黏膜下层膜放入表没食子儿茶素没食子酸酯溶液中交联，洗涤，冻干；

所述表没食子儿茶素没食子酸酯溶液的浓度为0.001～0.02g/ml，所述小肠黏膜下层膜放入表没食子儿茶素没食子酸酯溶液的比例为300～900mg：100ml。

2.根据权利要求1所述的材料，其特征在于：所述小肠黏膜下层膜放入表没食子儿茶素没食子酸酯溶液的比例为600mg：100ml。

3.根据权利要求1所述的材料，其特征在于：所述交联的温度是35～38℃；和/或，所述交联的时间为24～96h。

4.根据权利要求3所述的材料，其特征在于：所述交联的温度是37℃；和/或，所述交联的时间为48h。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的材料，其特征在于：所述小肠黏膜下层膜按照如下方法制备：取小肠，去除浆膜层和肌层，脱脂，脱细胞，去垢，冻干。

6.根据权利要求5所述的材料，其特征在于：所述脱脂是用体积比为1:1的甲醇和氯仿的混合溶液浸泡6-24小时，去离子水冲洗；和/或，所述脱细胞采用酶消化，在4-10℃环境中，于胰蛋白酶溶液中孵育6-24小时，生理盐水冲洗去除胰酶；所述去垢是在十二烷基硫酸钠与氯化钠的混合溶液中处理3～5h；所述溶液中十二烷基硫酸钠溶液的浓度为0.01％-1％w/v，氯化钠的浓度为0.01％-1％w/v。

7.根据权利要求6所述的材料，其特征在于：所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的浓度为0.01～10％w/v。

8.根据权利要求7所述的材料，其特征在于：所述胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的浓度为0.25％w/v。

9.根据权利要求6所述的材料，其特征在于：所述去垢是在十二烷基硫酸钠与氯化钠的混合溶液中处理4h。

10.根据权利要求6所述的材料，其特征在于：所述溶液中十二烷基硫酸钠溶液的浓度为0.5％w/v，氯化钠的浓度为0.9％w/v。

11.根据权利要求1所述的材料，其特征在于：所述材料为1～4层。

12.一种制备权利要求1～11任意一项所述材料的方法，其特征在于：步骤如下：将小肠黏膜下层膜放入表没食子儿茶素没食子酸酯溶液中交联，洗涤，冻干。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述表没食子儿茶素没食子酸酯溶液的浓度为0.001～0.02g/ml，所述小肠黏膜下层膜放入表没食子儿茶素没食子酸酯溶液的比例为300～900mg：100ml；和/或，所述交联的温度是35～38℃，和/或，所述交联的时间为24～96h。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述小肠黏膜下层膜放入表没食子儿茶素没食子酸酯溶液的比例为600mg：100ml。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述交联的温度是37℃，和/或，所述交联的时间为48h。

16.权利要求1～11任意一项所述材料在制备促进骨修复的材料中的用途。

17.根据权利要求16所述的用途，其特征在于：所述材料是引导骨再生膜。