CN102526804B - 一种缺损修复材料 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种缺损修复材料,它包括小肠黏膜下层和铜元素,每1g小肠黏膜下层中含有0.005mg~5mg铜元素。还提供了该缺损修复材料的制备方法以及该缺损修复材料在制备修复组织缺损的药物中的用途。本发明提供的缺损修复材料解决了现有修复材料无法与受体组织完全愈合的问题,具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种缺损修复材料,属于生物材料领域。
背景技术
组织缺损是指由于创伤或疾病所引起的组织细胞坏死,进而导致组织结构连续性丧失或功能障碍的病理表现。组织缺损包括尿道、膀胱、血管、胆道、肠道、肌腱、神经、骨、软骨、肌肉、皮肤或者食管缺损。组织缺损及修复过程中纤维组织形成期和瘢痕形成期会引起身体持久病变,给患者身心带来极大损伤。
理想的组织缺损修复是使组织恢复原有的结构和功能,尽管组织缺损的修复与再生目前在基础研究和临床治疗等方面均取得了长足的进展,但是离理想的组织缺损修复仍相差较远。如,食管是长管状的器官,是消化道最狭窄的部分。分为颈、胸、腹(亦即上、中、下)三段。颈段长约5厘米,是由食管开始端至颈静脉切迹平面的一段,胸段长约15厘米,上接食管颈段,下至横膈膜肌食管裂孔,腹段仅1~3厘米,上接胸段,下接胃贲门部,与肝左叶后缘相邻,其主要的功能是通过蠕动把食团输送到胃里。食管癌是常见的消化道肿瘤。目前,手术切除肿瘤是食管癌最重要与首选的治疗方式,对于先天性食管闭锁,返流性食管炎,化学性烧灼伤等造成的食管瘢痕和狭窄,也往往需要手术治疗,手术切除后的食管缺损往往通过食管形成术修复。自Berman等在1952年率先采用特制的聚乙烯管代替食管以修复缺损以来,至今人工食管的研究已经有50多年的历史。国内从1983年开始,先后用各种人工材料进行人工食管的研究。早期主要使用不可降解高分子材料制成的人工食管,但其与受体组织相容性差,受体血管、组织无法长入、人工食管内腔不能完全内皮化,往往会导致严重的并发症,如感染、吻合口瘘、吻合口狭窄等,并且由于人工食管无法与受体组织完全愈合而得到生物学固定,最终不可避免发生脱落。后来又采用镍钛合金、硅橡胶等,均未达到理想的效果。
去细胞基质的天然材料是机体组织经过机械及化学处理而去细胞的生物支架,它具有良好的生物相容性,天然的三维立体多孔结构,可降解吸收等特点,可能是较理想的修复材料。小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)是一种天然的细胞外基质类生物材料,通常由猪小肠制备。SIS主要含有胶原、氨基多糖、糖蛋白等成分,并且含有多种生长因子,对组织的修复重建及细胞的生长有重要作用,如成纤维细胞生长因子、转化生长因子和血管内皮生长因子等,可通过与细胞表面的多种受体作用后介导细胞信号转导,从而对上皮细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、骨细胞等多种细胞具有促进生长、分化的作用,其作为组织工程的支架材料广泛应用于尿道、膀胱、血管、肌腱、神经、骨等多种组织缺损修复的实验研究。然而,研究表明用单纯小肠黏膜下层SIS用于组织缺损修复,存在上皮化不完全,肌肉再生和血管再生不理想等缺陷。
寻找简便、安全、有效的组织缺损修复材料已成为治疗组织缺损疾患、提高病人生活质量的关键。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种新的、更加有效的缺损修复材料。
本发明提供了一种缺损修复材料,它包括小肠黏膜下层和铜元素,每1g小肠黏膜下层中含有0.005mg~5mg铜元素。优选地,每1g小肠黏膜下层中含有0.005mg~1.460mg铜元素。优选地,每1g小肠黏膜下层中含有0.005mg~0.766mg铜元素。进一步优选地,每1g小肠黏膜下层中含有0.562mg~0.766mg铜元素。
所述缺损修复材料是由如下方法制备:
(1)取小肠黏膜下层和含有铜离子的溶液,将小肠黏膜下层浸泡在含有铜离子的溶液中8~16h,每1g小肠黏膜下层浸泡在含有5μM~100μM铜离子的溶液中;
(2)冻干,消毒灭菌。
其中,所述步骤(1)中含有铜离子的溶液中铜离子的浓度为25μM。
本发明还提供了中制备前述缺损修复材料的方法,它包括如下步骤:
(1)取小肠黏膜下层和含有铜离子的溶液,将小肠黏膜下层浸泡在含有铜离子的溶液中8~16h,每1g小肠黏膜下层浸泡在含有5μM~100μM铜离子的溶液中;
(2)冻干,消毒灭菌。
其中,所述步骤(1)中含有铜离子的溶液中铜离子的浓度为25μM。
本发明还提供了前述缺损修复材料在制备修复组织缺损的药物中的用途。
其中,所述组织缺损为尿道、膀胱、血管、胆道、肠道、肌腱、神经、骨、软骨、肌肉、皮肤或者食管缺损。
本发明提供的缺损修复材料药效良好,可加快组织修复的速度,降低组织修复需要的时间,解决了现有修复材料无法与受体组织完全愈合的问题,提高临床病人的存活率,且制备方法简便,具有广阔的应用前景。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1SIS的光镜和扫描电镜检测结果。其中,A:未冻干的SIS呈半透明状膜;B:冻干后的SIS成白色纸状;C:处理后SIS表面未见细胞残留(HE×200);D:处理后的SIS(SEM×200),光镜以及扫描电镜下观察到的处理后的SIS未见细胞残留。
图2 CuSO4溶液浓度与复合材料中Cu元素含量关系图。
图3不同浓度的铜对血管内皮细胞增殖情况的影响。
图4 5μM CuSO4作用下血管内皮细胞的生长曲线。
图5使用5μM的CuSO4对HUVEC处理48小时后,MTT法检测5μM的CuSO4处理48小时后对HUVEC增殖情况的影响,数值以平均值±标准差表示(*,表示与Control组有显著性差异P<0.05),以不添加CuSO4的Control组作为100%,增殖活性百分比处理。
图6使用5μM的CuSO4对HUVEC处理48小时后,3H-TdR渗入法检测5μM的CuSO4处理48小时后对HUVEC增殖情况的影响,数值以平均值±标准差表示(*,表示与Control组有显著性差异P<0.05),以不添加CuSO4的Control组作为100%,增殖活性百分比处理。
图7使用5μM的CuSO4对HUVEC处理48小时后,细胞计数法检测5μM的CuSO4处理48小时后对HUVEC增殖情况的影响,数值以平均值±标准差表示(*,表示与Control组有显著性差异P<0.05),以不添加CuSO4的Control组作为100%,增殖活性百分比处理。
图8流式细胞术检测5μM的CuSO4处理48小时后对HUVEC细胞周期的影响。数值以平均值±标准差表示(*,表示与其对应相同周期的Control组百分比有显著性差异P<0.05)
图9SIS,SIS+5Cu(5μM的CuSO4)和SIS+25Cu(25μM的CuSO4)组动物体重。(*表示与SIS组相比,P<0.01,#表示与SIS+5Cu相比,P<0.05)
图10术后8周三组钡餐检测结果。A为SIS组,B为SIS+5Cu组,C为SIS+25Cu,右箭头→示食管缺损修复处。
图11术后8周三组大体标本观察结果。A为SIS组,B为SIS+5Cu组,C为SIS+25Cu。
图12术后8周SIS组标本组织学结果:
A1 SIS组Masson’s trichrome染色示部分上皮化(下箭头↓)(×40)
A2 SIS组HE染色示部分上皮化(下箭头↓)(×40)
A3 SIS组HE染色示部分上皮化(下箭头↓)及大量炎细胞(上箭头↑)(×200)。
图13术后8周SIS+5Cu组标本组织学结果:
B1 SIS+5Cu组Masson’s trichrome染色示完全上皮化(下箭头↓)(×40)
B2 SIS+5Cu组HE染色示完全上皮化(下箭头↓)(×40)
B3 SIS+5Cu组HE染色示完全上皮化(下箭头↓),上皮层数达8-10层(×200)。
图14术后8周SIS+25Cu组标本组织学结果:
C1 SIS+25Cu组Masson’s trichrome染色示完全上皮化(下箭头↓)(×40)
C2 SIS+25Cu组HE染色示完全上皮化(下箭头↓)(×40)
C3 SIS+25Cu组HE染色示完全上皮化(下箭头↓)(×200)。
图15术后8周三组标本炎细胞计数(**P<0.01,*P<0.05)。
图16术后8周SIS组标本组织学结果:
E1 SIS组HE染色可见血管形成(下箭头↓)(×200)
E2 SIS组Masson’s trichrome染色,可见有波浪状胶原形成(上箭头↑)(×200)。
图17术后8周SIS+5Cu组标本组织学结果:
F1 SIS+5Cu组HE染色示肌岛形成(三角形箭头▲)(×200)
F2 SIS+5Cu组Masson’s trichrome染色示肌岛形成(三角形箭头▲),肌岛被胶原包裹(右箭头→)(×200)。
图18术后8周SIS+25Cu组标本组织学结果:
G1 SIS+25Cu组HE染色示肌岛形成(三角形箭头▲)(×200)
G2 SIS+25Cu组Masson’s trichrome染色示肌岛形成(三角形箭头▲),肌岛被胶原包裹(右箭头→)(×200)。
图19三组免疫组织化学染色检测结果:
A1 SIS组α-SMA染色血管平滑肌阳性(下箭头↓)
B1 SIS+5Cu组α-SMA染色血管平滑肌阳性(下箭头↓)
C1 SIS+25Cu组α-SMA染色血管平滑肌阳性(下箭头↓)
图20三组免疫组织化学染色检测结果:
A2 SIS组CD31染色血管内皮阳性(下箭头↓)
B2 SIS+5Cu组CD31染色血管内皮阳性(下箭头↓)
C2 SIS+25Cu组CD31染色血管内皮阳性(下箭头↓)。
图21三组免疫组织化学染色血管计数(**P<0.01,*P<0.05)。
具体实施方式
实施例1本发明缺损修复材料的制备
1、制备方法
(一)、小肠黏膜下层SIS的制备
(1)SIS的制备
清洗整理:取屠宰后半个小时的新鲜猪小肠,用水冲去小肠内容物,翻转小肠,加入盐揉搓后用水反复冲洗3次,用手术刀剖开小肠,然后剪成15厘米长的肠段。
分离出SIS:用压舌板刮除肌层,浆膜层,置于生理盐水中4℃保存过夜。
脱脂:用去离子水漂洗干净后用纱布滤干水。浸入三氯甲烷∶甲醛1∶1中,置于通风橱里4个小时,平均2小时换一次液,并且每半个小时搅拌一次,每次滤干之前的液体再浸入到新的脱脂液中。
脱细胞:将脱脂后的SIS用去离子水漂洗20次,反复清洗,漂至无味。然后放入浓度为0.25%的胰酶液里,4℃脱细胞处理过夜。用去离子水漂洗10次后用0.5%的SDS处理至少4个小时,清洗后冻干。
(2)SIS的检测:染色、扫描电镜
通过HE染色和扫描电镜观察有无残留的细胞,如图1所示,说明制备好的SIS已基本去除细胞,且对其超微结构和胶原纤维的热稳定性未造成损害。
(二)、本发明缺损修复材料的制备
取步骤(一)制备的SIS或者市售的SIS,按每克SIS重量浸泡在1升5μM、25μM、50μM、75μM、100μM的CuSO4溶液中12hr,真空冻干机冻干,裁剪成所需大小,包装,环氧乙烷消毒、灭菌。
2、检测
采用原子吸收光谱法测定复合材料上Cu的含量:
各样品消解罐在使用前用10%硝酸浸泡24小时,去离子水冲洗干净,充分润洗干净后烘干,将烘干的各胶条放入各个消解罐中,各加入6mlHNO3(优级纯)组装上各罐放入微波消解仪中。
消解条件:6*200W,1900C,15atm,5min
消解结束后,待温度降到50摄氏度以下,压力降到0.5atm以下后,取出消解罐,在通风橱中拧开罐侧边螺丝放气,片刻后再拧松顶丝,取出内罐。将罐中的HNO3消解液倒入25ml容量瓶中,用少量去离子水冲洗内罐、漏斗并入容量瓶中。用去离子水定容即可。
AAS测定方法及仪器条件:
表1.AAS测铜仪器条件选择
元素-基体 | Cu- |
仪器类型 | Zeeman |
浓度单位 | μg/L |
仪器模式 | 吸收法 |
进样方式 | 手动 |
校正模式 | 浓度 |
测量模式 | 峰面积 |
标样读数次数 | 1 |
样品读数次数 | 1 |
扩展系数 | 1.0 |
最小读数 | 禁用 |
平滑 | 7点 |
浓度小数位 | 2 |
波长 | 327.4nm |
狭缝 | 43% |
灯电流 | 4.0mA |
扣背景 | 扣背景开 |
标样1 | 25.00μg/L |
标样2 | 50.00μg/L |
标样3 | 75.00μg/L |
重置斜率频率 | 30 |
重置斜率标样点 | 2 |
重置斜率下限 | 75.0% |
重置斜率上限 | 125.0% |
重校频率 | 30 |
标准曲线拟合算法 | 新合理 |
样品体积 | 10μl |
总体积 | 15μl |
体积减少因子 | 2 |
母液浓度 | 50.00μg/L |
母液位置 | 25 |
制备液位置 | 24 |
检测结果如表2所示:
表2:原子吸收光谱法测定复合材料上Cu的含量
根据表1中数据,计算不同硫酸铜浓度下,每克复合材料上复合的铜元素含量的平均值,绘制图表,如图2所示。
由表1和图2可知,本发明成功地将铜离子复合在小肠黏膜下层SIS上,制备得到了本发明复合材料,且本发明复合材料的含铜量跟溶液中铜离子的浓度不成线性关系。
实施例2铜元素的生理作用
一、不同浓度的铜对血管内皮细胞HUVEC增殖情况的影响
1、实验方法:
(1)血管内皮细胞传代培养后,消化,将细胞悬液的细胞密度调到2.5×104/mL,96孔板每孔加200μL细胞悬液,即每孔接种5×103细胞,接种于96孔板。
(2)接种24小时后,吸掉孔中原有的培养基,添加含CuSO4终浓度分别为0、5、10、25、50、100、250、500、1000μM的L-DMEM培养基。每孔加200μL。以后每24小时换液一次。
(3)MTT法测细胞增殖活力:从换液当天开始,48小时后检测,每组一次测5个复孔。吸去每组孔中的培养基,每孔加200μL MCDB131。每组有5个孔。每孔加20μL MTT,晃匀。在细胞培养箱中孵育3.5小时。吸去培养基,每孔加100μL DMSO。在细胞培养箱中孵育5~10分钟。将溶液吸到另一个干净的96孔板中,在连续光谱微孔板光密度测读仪中测每孔溶液的OD值,光波长为490nm。
2、实验结果
图3的结果显示,5~100μM范围内,各浓度的CuSO4对细胞的增殖活性有显著的促进作用,且作用强度大致相当,而100μM以上浓度的CuSO4则具有明显的细胞毒性。
二、5μM的CuSO4对血管内皮细胞HUVEC生长曲线的影响。
鉴于5~100μM浓度的CuSO4均对细胞的增殖活性有促进作用这一实验结果,我们选择了生理浓度范围内的5μM作为我们的实验使用浓度。研究终浓度为5μM的CuSO4对血管内皮细胞生长曲线的影响。
1、实验方法
(1)将血管内皮细胞接种于96孔板;
(2)接种24小时后,吸掉孔中原有的培养基,添加含CuSO4终浓度分别为0、5μM的L-DMEM培养基。每孔加200μL。以后每24小时换液一次。
(3)MTT法测细胞增殖活力:从换液当天起,每24小时检测一次,每组一次测5个复孔,检测方法同上。
2、实验结果
如图4所示,白色框为无添加Control组,黑色框为添加5μM CuSO4组,相同时间点CuSO4组的OD490高于Control组,说明5μM的CuSO4对血管内皮细胞增殖有促进作用,同时,CuSO4组的生长曲线相较于Control组左移,说明在整个观察期(10天)内,5μM的CuSO4都表现出了促进血管内皮细胞增殖的作用。
三、5μM的CuSO4处理48小时后对血管内皮细胞HUVEC增殖的促进作用
在对细胞增殖活性的评价方法上,大多的研究都是使用单一的方法,为了使其更加全面准确,在这部分实验中我们采用了三种不同的方法,MTT法、3H-TdR掺入法、细胞计数法分别从细胞的代谢、DNA合成和直观的细胞数量的增加这三方面验证了CuSO4对HUVEC增殖活性的影响。
1、实验方法
(1)MTT法:血管内皮细胞接种于96孔板。接种24小时后,吸掉孔中原有的培养基,添加含CuSO4终浓度分别为0、5μM的L-DMEM培养基。每孔加200μL,检测方法。
(2)3H-TdR掺入法:血管内皮细胞接种于24孔板,细胞悬液的细胞密度调到2.5×104/mL,24孔板每孔加500μL细胞悬液,即每孔接种1.25×104细胞。接种24小时后,吸掉孔中原有的培养基,换成含CuSO4终浓度为0、5μM的L-DMEM培养基。每孔加500μL。以后每24小时换液一次。处理48小时后,取24孔板,更换新鲜MCDB131培养基。每孔加入浓度为1μci的3H-TdR100μL。收集样品,上机检测。
(3)细胞计数法:细胞悬液的细胞密度调到1.5×104/mL,将血管内皮细胞接种于12孔板,12孔板每孔加1000μL细胞悬液,即每孔接种1.5×104细胞。接种24小时后,吸掉孔中原有的培养基,换成含CuSO4终浓度为0、5μM的L-DMEM培养基。每孔加1000μL。处理48小时后,吸去每组孔中的培养基,每孔加100μL TNE。每组有3个孔。用移液枪吹匀。在细胞培养箱中孵育5分钟。用同一血球计数板计数,每孔重复计数3次。
2、实验结果
使用5μM的CuSO4对HUVEC处理48小时后,MTT法、3H-TdR掺入法和细胞计数法检测细胞的增殖活性的结果分别如图5,6和7所示。为了便于比较,以不添加CuSO4的Control组作为100%,把增殖活性百分比处理。结果可以发现5μM的CuSO4处理后HUVEC的增殖高于Control组,有显著性差异。
四、流式细胞仪检测CuSO4对血管内皮细胞HUVEC细胞周期的影响
1、实验方法
(1)取在25mL培养瓶中培养的HUVECs分别添加终浓度为0、5μM的CuSO4培养48小时后,收集细胞。
(2)弃培养基,PBS液清洗1次。
(3)加入TNE 1mL。在倒置显微镜下观察见到的内皮细胞皱缩时吸去TNE。
(4)将细胞在37℃下孵育2分钟。
(5)每孔加入1mL L-DMEM+10%FBS培养基终止消化,并将细胞悬液移入干净EP管中。
(6)吹打成单细胞悬液,200~400目尼龙筛过滤。
(7)将单细胞悬液离心(100g,5min),弃上清液,用PBS清洗两次,最后用预冷的70%乙醇固定,4℃过夜。
(8)用0.5mL PBS重悬细胞。
(9)加入PI和RNaseA至终浓度50μg/mL,37℃避光保温30min。
(10)冰浴终止酶作用。
(11)上样,流式细胞仪测定周期。
2、实验结果
使用5μM的CuSO4对HUVEC处理48小时后,用流式细胞术检测细胞周期的变化。结果如图8所示,可以发现,5μM的CuSO4处理48小时后HUVEC的细胞更多的从G1期进入到了S期,有更多的细胞参与到了细胞的有丝分裂周期当中,其增殖活性增加,与MTT法、3H-TdR掺入法、细胞计数法检测到的细胞增殖情况结果相符。
上述实验说明在毒性阈值以下,铜元素可促进血管内皮细胞增殖。由于低剂量与高剂量促进细胞增殖的效果相当,为了节约成本,选择低剂量铜元素是恰当的。
实施例3本发明修复材料修复犬颈段食管缺损
一、术后一般情况观察及体重曲线
1、实验方法
(1)实验动物:健康雄性比格犬(1周岁,10kg)18只由四川省医学科学院实验动物研究所提供,许可证为SCXK(川)2004-15。
(2)实验分组:对照组为单纯SIS材料修复组(n=6);实验组为SIS复合5μMCu(SIS+5Cu组,n=6)和SIS复合25μMCu(SIS+25Cu组,n=6),根据实施例1的方法制备,经检测SIS+5Cu材料中所测得Cu含量为0.127mg/g,SIS+25Cu材料中所测得Cu含量为0.677mg/g。
(3)术前准备:术前三天口服链霉素1g/天清洁消化道,术前一天开始禁食。
(4)动物麻醉:将实验犬仰卧固定于手术台上,颈部垫高,建立静脉通路输液,采用戊巴比妥钠麻醉(25-30mg/kg),手术中用安定维持麻醉。
(5)食管重建术:消毒术野,铺巾,左颈沿胸锁乳突肌前缘斜切口长约7-8cm,经胸锁乳突肌前入式。距食管咽部约5cm处分离自身食管,在食管的前外侧切除5cm长半周径的自身食管,“内套式”吻合食管,对照组6例,实验组SIS+5Cu组及SIS+25Cu组各6例,两端套入长度约0.5cm。采用5-0PGA可吸收缝线连续内翻扣锁缝合,间距3mm,边距3mm。用艾利克和PBS冲洗伤口,食管床留置橡皮条引流,3-0的PGA可吸收线间断缝合肌肉及皮下组织,1号丝线间断缝合皮肤。
(6)术后处理:禁食;术后一周内,青霉素80万u肌肉注射bid;术后第一周,给予静脉高营养支持(华瑞制药有限公司);术后2周,给予普食。
(7)行为学观察:术后2天拔出切口内橡皮引流条,并清洁切口。严格测量并记录实验犬每天的重量,并观察切口情况,观察有无呼吸困难、流涎、呕吐、腹泻、进食梗阻等。一旦出现切口红肿及有皮下积液或有混浊液体自切口渗出,提示有吻合口瘘出现,敞开切口进行引流探查,如果证实为吻合口瘘,即停止实验研究,不进行保守治疗观察。
2、实验结果
实验结果发现:所有动物全部存活,无呼吸困难,无流涎,一般情况好。切口7天后拆线,甲级愈合,无红肿及流脓。由图9可知,所有动物术后7天体重均明显降低,以后体重逐渐上升,但SIS+5Cu,SIS+25Cu组体重上升明显较SIS组快。SIS组到术后51天才恢复到原来体重,而SIS+5Cu,SIS+25Cu组分别于术后34天、27天就恢复到原来正常的体重。
二、钡餐X线检查及大体标本观察
1、实验方法
术前准备,手术,术后护理同上。
钡餐X线检查:在检查前给实验犬禁饮4小时,禁食12小时。检查前腹腔内注射戊巴比妥30mg/kg,待实验犬麻醉后,经口置入12号胃管于食管上端,将硫酸钡500g加牛奶1000ml搅拌成半流质经胃管注入钡剂,进行连续拍片检查,了解有无食管瘘及食管的功能。
大体检查:于术后8周定期处死动物,观察材料移植处与周围组织粘连的情况,材料周围有无积脓,以及材料移植处食管粘膜面的光滑度,与正常粘膜用肉眼能否辨认以及移植处有无狭窄。
2、实验结果
钡餐X线检查:实验结果见图10,术后8周钡餐显示全部实验犬吞咽活动正常,三组实验犬修复食管均固定于原位,管腔通畅,钡剂顺利通过,上下吻合端均无狭窄,无吻合口瘘,但SIS+5Cu组(图10B)粘膜面较SIS组(图10A)光滑,尤其SIS+25Cu组(图10C)最为光滑。动态透视下,三组食管蠕动波由上至下传递。
大体检查:由图11可知,三组动物食管缺损修复处与正常组织有少量粘连,易分离,周围无脓肿形成。粘膜面与正常粘膜的界线能辨认出,SIS(图11A)粘膜面有少许纤维样凸起,SIS+5Cu(图11B)粘膜面较光滑,SIS+25Cu组(图11C)粘膜面最为光滑。
三、组织学观察
1、实验方法
术前准备,手术,术后护理同上。
于术后8周定期处死动物。食管标本取材包含近、远端吻合口,10%甲醛固定,经脱水、透明、石腊包埋、切片等步骤制成5um厚的石腊切片,行常规HE染色和Masson’s trichrome染色,光镜镜检,进行炎性细胞计数。
2、实验结果
术后8周组织学观察显示:SIS组缺损修复处的中心地方只有部分上皮化,有上皮化处只有2-3层上皮,粘膜下有大量炎性细胞(图12-A1,A2,A3),而SIS+5Cu组(图13-B1,B2,B3)和SIS+25Cu组(图14C1,C2,C3)的组织学显示食管完全上皮化,上皮细胞层数达8-10层,而且几乎没有炎性细胞。
炎细胞计数显示:SIS组炎细胞数量明显多于SIS+5Cu组和SIS+25Cu(**P<0.01),而SIS+5Cu组炎性细胞数量又明显多于SIS+25Cu(*P<0.05)(图15)。
SIS组没有岛状肌肉细胞的形成,仅见成波浪状的胶原(图16-E2)及一些血管形成(图16-E1),而SIS+5Cu组(图17-F1,F2)和SIS+25Cu组(图18-G1,G2)显示有岛状或束状的肌肉细胞的形成,肌肉细胞被胶原包裹,尤其SIS+25Cu组更为明显。
四、免疫组织化学观察
1、实验方法
术前准备,手术,术后护理同上。于术后8周定期处死动物。食管标本取材包含近、远端吻合口,10%甲醛固定,经脱水、透明、石腊包埋、切片等步骤制成5um厚的石腊切片,行标本免疫组织化学分析:1∶100鼠抗狗α-平滑肌肌动蛋白抗体(α-smooth muscle actin,α-SMA),1∶100CD31单克隆抗体检测血管的再生情况,光镜镜检。并进行血管计数。
2、实验结果
α-SMA,CD31均为阳性表达,α-SMA血管平滑肌呈黄色(下箭头↓)(图19-A1、B1、C1),CD31血管内皮呈黄色(下箭头↓)(图20-A2、B2、C2)。血管计数显示:SIS组血管数量明显少于SIS+5Cu组和SIS+25Cu(**P<0.01),而SIS+5Cu组血管数量又明显少于SIS+25Cu组(*P<0.05)(图21D)。
上述实验结果说明,与小肠黏膜下层SIS相比,本发明制备的修复材料可以降低组织修复时间、促进组织上皮化、减少炎症发生、促进血管修复,且与受体组织愈合良好,能较好地促进犬颈段食管缺损的修复。
实验证明,在铜元素毒性阈值下,本发明修复材料可以促进组织缺损的修复与再生,综合考虑修复效果与成本,本发明复合材料优选为复合了0.562~0.766mg/g铜的小肠黏膜下层(使用小肠黏膜下层SIS与25μMCu按照实施例1所述方法制备)。
综上,本发明成功地制备得到了复合铜元素的小肠黏膜下层,在毒性阈值下的剂量范围内,其可用于修复组织缺损,具有良好的市场应用前景。
Claims (9)
1.一种缺损修复材料,其特征在于:它包括小肠黏膜下层和铜元素,每1g小肠黏膜下层中含有0.005mg~0.766mg铜元素。
2.根据权利要求1所述的材料,其特征在于:每1g小肠黏膜下层中含有0.562mg~0.766mg铜元素。
3.根据权利要求1所述的材料,其特征在于:它是由如下方法制备:
(1)取小肠黏膜下层和含有铜离子的溶液,将小肠黏膜下层浸泡在含有铜离子的溶液中8~16h,每1g小肠黏膜下层浸泡在含有5μM ~25μM铜离子的溶液中;
(2)冻干,消毒灭菌。
4.根据权利要求3所述的材料,其特征在于:步骤(1)所述含有铜离子的溶液中铜离子的浓度为25μM。
5.一种制备权利要求1~4任意一项所述的缺损修复材料的方法,其特征在于:它包括如下步骤:
(1)取小肠黏膜下层和含有铜离子的溶液,将小肠黏膜下层浸泡在含有铜离子的溶液中8~16h,每1g小肠黏膜下层浸泡在含有5μM ~25μM铜离子的溶液中;
(2)冻干,消毒灭菌。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:步骤(1)所述含有铜离子的溶液中铜离子的浓度为25μM。
7.权利要求1~4任意一项所述的缺损修复材料在制备修复组织缺损的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途,其特征在于:所述组织缺损为尿道、膀胱、血管、胆道、肠道、肌腱、神经、骨、肌肉、皮肤或者食管缺损。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于:所述骨缺损为软骨缺损。
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