CN101433735A

CN101433735A - 一种sis组织修复材料的制备方法

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Publication number: CN101433735A
Application number: CNA2007101772856A
Authority: CN
Inventors: 李次会
Original assignee: BEIJING DAQING BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Beijing Daqing biotechnology Limited by Share Ltd
Priority date: 2007-11-13
Filing date: 2007-11-13
Publication date: 2009-05-20
Anticipated expiration: 2027-11-13
Also published as: CN101433735B

Abstract

本发明提供了一种SIS组织修复材料的制备方法，其包括如下步骤：将小肠黏膜下层以任意顺序进行消毒处理、脱脂处理、脱细胞处理、去垢处理，最后经冷冻干燥而成。本发明所述的SIS组织修复材料可以作为生长因子、细胞、药物等的单独和共同的支架载体，通过体外培养成为组织工程材料。其为无抗原性、无免疫性天然无毒的生物材料。SIS组织修复材料在临床上可用于疝，皮肤缺损，泌尿系统组织缺损，粘膜缺损及其他体表体内软组织缺损的修复。

Description

一种SIS组织修复材料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种组织修复材料的制备方法，具体地说，涉及一种SIS(small intestinal submucosa，小肠黏膜下层)组织修复材料的制备方法。

背景技术

哺乳动物小肠主要由4层组成，由里到外分别为黏膜层，黏膜下层、肌层和浆膜层。黏膜下层由一层致密的结缔组织构成，主要成分为I、III型胶原纤维，含有少量细胞及部分较大的血管、淋巴管和神经。小肠黏膜下层(small intestinal submucosa，以下简称SIS)是天然细胞外基质类生物衍生材料。由于SIS具有无免疫原性、抗微生物活性，能促进组织再生等，在体内能通过生物降解得到代谢，因而得到了广泛的研究。

SIS一般由猪空肠制备，将新鲜的猪空肠反复用清水冲洗，采用机械方法去除外面的浆膜层和肌层，翻转后取出黏膜层。采用高渗盐水或酶-去垢剂消化法可彻底去除材料中的残留细胞。为避免人畜共患疾病的交叉传染，常用过氧乙酸-乙醇混合溶液处理，这样可达到完全消毒作用。有研究指出，用这样的消毒液处理猪小肠和同类的SIS，通过测定荚膜病毒、无荚膜病毒，包括猪细小病毒、猪呼吸道肠道病毒、鼠白血病逆转录酶病毒和猪伪狂犬病毒，证明荚膜病毒容易出去，5分钟即可灭活，处理30分钟后所有病毒均被灭活，因而不易导致疾病的交叉感染。

SIS含有大量的胶原蛋白，主要由主要成分为I、III型胶原纤维，含有少量V型和VI型胶原纤维，均由α₁、α₂、α₃肽链组成。其中α₁肽链可与细胞表面的特异受体结合，激活信号传导通路，促进细胞的粘附、增殖和分化。大量的羟基基团也能促进细胞粘附。胶原蛋白参与细胞分化，控制细胞粘附，调节细胞生长，有助于维持细胞基质的网状结构。同时SIS是一种天然细胞外基质生物材料，含有多种活性生长因子，比用于组织工程的其他合成材料具有更过的优越性。例如有研究者曾经从SIS中提取出转化生长因子TGFβ1和bFGF，尽管在制备过程中经过消毒、冻干等处理，但最终材料仍具有生物活性。TGFβ1可以促进间充质细胞分化增殖，增加I型胶原、骨连接蛋白和骨桥蛋白的合成，同时能够调节多种基质蛋白的转录，包括胶原、纤维结合素、葡糖胺、基质降解蛋白酶及其抑制物等，最终使基质蛋白积聚和增加。bFGF能够刺激大多数与创面愈合有关的细胞增殖，包括血管内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、成骨细胞和软骨细胞等，能够刺激毛细血管内皮细胞的增殖和迁移并创造其他血管在生长入的条件。

也有研究证实SIS的细胞外基质中有VEGF，以及与促进内皮细胞分裂素有密切关系的血小板源生长因子。SIS所固有的这些生长因子在组织的修复和重构中起着重要的促进作用。此外，SIS具有部位特异性的组织再生的能力，能迅速诱导细胞浸润，刺激血管生成和宿主细胞的长入和分化，产生的再生组织在结构和功能上均与原组织相似。因此无论是实验还是临床，SIS都具有良好的组织修复性能。

组织工程支架材料应该具备如下条件：1.有良好的生物相容性和无抗原作用，不会与受体发生免疫排斥反应；2.可降解性和降解速率可控性；3.维持生长其上的细胞形态和表型，并增进细胞的粘附和生殖，诱导组织再生最终形成完整的生物组织；4.有一定的空隙率便于组织间的营养和物质空气的交换；5.有一定的机械强度能够对组织的生长起到支持作用。

SIS作为一种天然细胞外基质生物材料，几乎拥有上述所有特性。SIS用作组织工程支架材料已经进行了广泛的研究，，在生物体内能引导、支持宿主细胞的生长，最终逐渐完全降解，再生的组织结构得到重塑成形。可以用于神经、膀胱、血管、肌腱、腹壁等组织缺损的修复，并具有独特的优势。

目前在生物材料领域内也有很多关于利用SIS作为组织修复材料的制备和相关动物实验的报道，但工艺过程简单，大多都局限在单独脱细胞和去垢上，总体来说都会存在脱脂脱蛋白或者消毒不充分的问题，从而导致材料存在一定的免疫性和抗原性，也有的方法存在一些去除有机溶剂不充分的问题，从而会导致材料对受体存在一定的抗原性。国外也有注射型和粉末状SIS制备和使用的相关报道，但其制备方法相对较为复杂，并且也没有涉及到对材料进行脱脂和脱细胞的步骤，因而材料也会存在一定的抗原性，并且在使用上也受到一定程度的限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种SIS(small intestinal submucosa，小肠黏膜下层)组织修复材料的制备方法，该方法可获得无抗原性、无免疫性天然无毒的生物材料。

为了实现本发明目的，本发明的一种SIS(small intestinalsubmucosa，小肠黏膜下层)组织修复材料的制备方法，其采用机械法、物理化学法和生物学等处理方法，经过分别经过消毒，脱脂，脱细胞，去垢，灭菌等工艺处理，脱水加工和碾压成特定形状制备而成。

本发明的组织修复支架材料SIS(small intestinal submucosa)是采用天然细胞外基质类生物衍生材料。

SIS组织修复材料的原料来源为猪、羊、狗等哺乳动物小肠黏膜下层。主要是通过机械法去除动物小肠外面的浆膜层、黏膜层和肌层，而取出黏膜下层。

所述对SIS的处理方法是机械法、物理化学法和生物学等处理方法间的组合。

本发明的SIS组织修复材料的制备方法，其包括如下步骤：将小肠黏膜下层以任意顺序进行消毒处理、脱脂处理、脱细胞处理、去垢处理，最后经冷冻干燥而成。

其中，所述的消毒处理为在常温下采用消毒液对小肠黏膜下层(SIS)进行浸泡处理，SIS与消毒液的质量体积比1:1～10。

具体消毒方式为：用0.08～1.5％的过氧乙酸和5～20％的乙醇的混合水溶液浸泡10～60分钟，或者0.05～1.5％的乙二胺四乙酸溶液与0.01～2％氢氧化钠的单独或混合溶液浸泡6～12小时，5～20％的硫酸新霉素溶液浸泡15～60分钟，碘伏(聚维酮碘)浸泡10～30分钟等具有消毒作用的溶液浸泡消毒。

消毒处理完后用纯化水彻底超声清洗，根据需要清洗时可换纯化水进行多次清洗，一般清洗2～4次。

所述脱脂处理为采用有机溶剂常温下对SIS经1～5次浸泡处理，每次浸泡8～20小时。SIS与有机溶剂的质量体积比1:1～10。

所述有机溶剂为甲醇、氯仿、甲醛、二氯甲烷、三氯甲烷中一种或多种混合的溶液，优选混合比例为1:6～1:1。每次要换新鲜溶液，为保证充分脱脂，处理过程可通过超声作用的辅助处理；处理完后用纯水分1～5次超声清洗。

所述脱细胞处理是常温下用具有脱细胞作用的溶液浸泡处理，SIS与脱细胞溶液的体积比1:1～10。所述脱细胞溶液为高渗盐水(浸泡4-10小时)、酶溶液(如0.1～0.5％的胰蛋白酶溶液浸泡10～30小时)、酸溶液(如0.1～1M盐酸，2～8％乙酸溶液或0.08～1％的丙烯酸溶液浸泡3～6小时)、碱溶液(如0.02～0.1％氢氧化钠溶液或0.5～1.5％氨水溶液浸泡1～2.5小时)中的一种或两种以上混合溶液。

所述去垢处理是常温下用表面活性剂溶液分1～5次浸泡清洗处理，每次更换新鲜溶液。每次用0.1～15％的表面活性剂溶液浸泡8～24小时。所述表面活性剂为曲拉通(Triton X114)、十二烷基磺酸钠(SDS)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)或胆酸钠等。

本发明的小肠黏膜下层(SIS)在处理前，可以先对小肠黏膜下层进行表面消毒处理，比如用碘酒进行消毒处理。

在本发明的消毒、脱脂、脱细胞和去垢过程中，还可适当加入磷酸盐、叠氮化纳、氯化钠等缓冲溶液来调节工艺处理中的溶液体系平衡。

所述的冷冻干燥可采用本领域常规的方法及设备进行。

本发明所述的SIS组织修复材料可以进一步加工成单层厚度为10～200μm的薄膜状材料，可以分为单层、双层、四层、八层等。复合层通过脱水加工和碾压而成。

为了进一步灭菌，经过内包装后，加工成成品的SIS组织修复材料还要经过辐照灭菌，剂量范围在5～25kGy。

本发明所述的SIS组织修复材料的制备方法，其工艺过程严格完整，具有很强的系统性和完整性，能够在保证产品性能的同时，达到有效去除产品免疫性，减少组织修复时产生的排斥和过敏反应，降低病人痛苦和手术风险，提高安全性。

本发明所述的SIS组织修复材料可以作为生长因子、细胞、药物等的单独和共同的支架载体，通过体外培养成为组织工程材料。其为无抗原性、无免疫性天然无毒的生物材料。

SIS组织修复材料在临床上可用于疝，皮肤缺损，泌尿系统组织缺损，粘膜缺损及其他体表体内软组织缺损的修复。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

取屠宰4小时内的新鲜猪小肠，将小肠的浆膜层、黏膜层和肌层去除保留黏膜下层，用纯水冲洗干净，碘酒消毒后再冲洗干净。将制得的SIS浸泡在0.5％的过氧乙酸-10％乙醇混合溶液中进行消毒处理，SIS与溶液的质量体积比为1:5，浸泡1小时；浸泡完之后用纯水超声清洗2次，每次20分钟并换水；取出漂洗干净，放入2％的SDS溶液中进行去垢处理，SIS与溶液的质量体积比为1:5，浸泡18小时；超声清洗2次，每次20分钟并换水；漂洗到溶液清亮；用1mmol/L的NaCl的磷酸盐缓冲溶液(PBS)浸泡16小时，SIS与溶液的质量体积比为1:10。用纯水清洗到pH值为5.8之间；再用含有0.05％叠氮化纳的PBS清洗2小时，用纯水超声清洗30分钟并漂洗后，将材料置于0.4％的胰蛋白酶按质量体积比为1:4的比例在室温下消化14小时进行脱细胞处理。超声清洗后用质量体积比为1:5的比例甲醇溶液进行浸泡处理8小时，取出材料超声清洗5次，每次30分钟并换水，漂洗后将清洗液送检直到有机溶剂含量合格为止，然后-80度预冻2小时，-55度冻干48小时。

实施例2

取屠宰4小时内的新鲜羊小肠，将小肠的浆膜层、黏膜层和肌层去除保留黏膜下层，用纯水冲洗干净，碘酒消毒后再冲洗。将制得的SIS浸泡在将机械方法制得的SIS浸泡在1.5％的过氧乙酸-10％乙醇混合溶液中，SIS与溶液的质量体积比为1:5，浸泡40分钟；浸泡完之后用纯水超声清洗2次，每次20分钟并换水；漂洗干净后放入1mmol/L的HCl和1mmol/LNaCl的混合溶液中(pH值为0～1之间)浸泡6小时进行脱细胞处理，SIS与溶液的质量体积比为1:10；用纯水超声清洗2次每次20分钟，漂洗干净后用1mmol/L的NaCl的磷酸盐缓冲溶液(PBS)浸泡16小时，SIS与溶液的质量体积比为1:10。纯水清洗30分钟后用体积比为1:5的甲醇和三氯甲烷混合溶液浸泡18小时进行脱脂处理，SIS与溶液的质量体积比为1:5。取出材料纯水超声清洗2次，每次20分钟并换水。漂洗干净后放入3％的SDS溶液中进行去垢处理，浸泡10小时，SIS与溶液的质量体积比为1:5；取出材料超声清洗5次，每次30分钟并换水，漂洗后将清洗液送检直到有机溶剂含量合格为止，冻干保存，-80度预冻2小时，-55度冻干48小时。

实施例3

取屠宰4小时内的新鲜狗小肠，将小肠的浆膜层、黏膜层和肌层去除保留黏膜下层，用纯水冲洗干净，碘酒消毒后再冲洗。将制得的SIS浸泡在将机械方法制得的SIS浸泡在0.05％的氢氧化钠中浸泡1小时，在1.5％的SDS溶液中浸泡10小时，进行脱细胞和去垢处理，SIS与溶液的质量体积比为1:5，每5小时换一次新鲜溶液；浸泡完之后用纯水超声清洗2次，每次20分钟并换水；漂洗干净后，放入质量体积比为0.1％的聚丙烯酸溶液中浸泡4小时再次脱细胞，SIS与溶液的质量体积比为1:5，用纯水超声清洗到pH值为7.0之间；将材料用含有0.8％的过氧乙酸和12％酒精溶液浸泡消毒5小时，SIS与溶液的质量体积比为1:5；再用含有0.05％叠氮化纳的PBS清洗2小时，纯水超声清洗3次每次15分钟；浸泡完之后用纯水超声清洗2次，每次20分钟并换水。最后用体积比为1:1的甲醇和二氯甲烷混合溶液浸泡15小时进行脱脂处理，SIS与溶液的质量体积比为1:5。用纯水超声清洗5次，每次30分钟并换水，漂洗后将清洗液送检直到有机溶剂含量合格为止。完毕后-26度预冻24小时，-55度冻干72小时。

实施例4

取屠宰4小时内的新鲜猪小肠，将小肠的浆膜层、黏膜层和肌层去除保留黏膜下层，用纯水冲洗干净，碘酒消毒后再冲洗。将制得的SIS浸泡在将机械方法制得的SIS浸泡在0.8％的过氧乙酸-10％乙醇混合溶液中进行消除病毒处理，SIS与溶液的质量体积比为1:5，浸泡50分钟。取出材料后用清水超声清洗2次，每次20分钟并换水，漂洗至清亮。将材料取出放在0.5％的胰蛋白酶溶液中消化10小时进行脱细胞处理，SIS与溶液的质量体积比为1:5，取出材料在清水中清洗超声清洗2次，每20分钟换一次清水，然后漂洗到无胰蛋白酶活性残留。将溶液用体积比为3:1的甲醇和氯仿的混合溶液浸泡12小时进行脱脂处理，SIS与溶液的质量体积比为1:5，中途换液1-3次至溶液清亮，超声清洗2次，每20分钟并换纯水，最后漂洗至无有机溶剂残留。将材料浸泡在浓度为2.5％的SDS中16小时进行去垢处理，SIS与溶液的质量体积比为1:10。用纯水超声清洗5次，每次30分钟并换水，漂洗后将清洗液送检直到有机溶剂含量合格为止。将材料-80度冷冻5小时，-55度冷冻干燥48小时。

实施例5

取屠宰4小时内的新鲜羊小肠，将小肠的浆膜层、黏膜层和肌层去除保留黏膜下层，用纯水冲洗干净，碘酒消毒后再冲洗。将制得的SIS浸泡在将机械方法制得的材料浸泡在0.25％的过氧乙酸-15％乙醇混合溶液中，材料与溶液的质量体积比为1:5，浸泡1小时。取出材料后用清水超声清洗至清亮。将材料取出放在0.5％的胰蛋白酶溶液中消化12小时，材料与溶液的质量体积比为1:5，取出材料在清水中清洗超声清洗2次，每次20分钟并换水。然后漂洗到无胰蛋白酶活性残留。将溶液用体积比为3:1的甲醇和氯仿的混合溶液浸泡20小时，材料与溶液的质量体积比为1:5，中途换液1-3次至溶液清亮。取出材料用纯水超声清洗2次，每20分钟并换纯水，最后漂洗至无有机溶剂残留。将材料浸泡在1.25％的SDS中20小时，材料与溶液的质量体积比为1:10。用纯水超声清洗5次，每次30分钟并换水，漂洗后将清洗液送检直到有机溶剂含量合格为止。将材料-80度冷冻5小时，-55度冷冻干燥48小时。

实施例6

取屠宰4小时内的新鲜猪小肠，将小肠的浆膜层、黏膜层和肌层去除保留黏膜下层，用纯水冲洗干净，碘酒消毒后再冲洗。将制得的SIS浸泡在将机械方法制得的SIS浸泡在0.08％的乙二胺四乙酸溶液中浸泡10小时进行消除病毒处理，SIS与溶液的体积比为1:5。取出材料后用清水超声清洗2次，每次20分钟并换水，漂洗至清亮。将材料取出放在5％氨水中处理10小时进行脱细胞处理，SIS与溶液的质量体积比为1:5，取出材料在清水中清洗超声清洗2次，每20分钟换一次清水，然后漂洗到无溶剂残留。将溶液用甲醛溶液浸泡12小时进行处理，SIS与溶液的体积比为1:5，中途换液1-3次至溶液清亮，超声清洗2次，每20分钟并换纯水，最后漂洗至无有机溶剂残留。将材料浸泡在浓度为8.5％的Triton X114中16小时进行去垢处理，SIS与溶液的质量体积比为1:10。用纯水超声清洗5次，每次30分钟并换水，漂洗后将清洗液送检直到有机溶剂含量合格为止。将材料-80度冷冻5小时，-55度冷冻干燥48小时。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.SIS组织修复材料的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：将小肠黏膜下层以任意顺序进行消毒处理、脱脂处理、脱细胞处理、去垢处理，最后经冷冻干燥而成。

2.根据权利要求1所述的SIS组织修复材料的制备方法，其特征在于，所述的消毒处理为在常温下采用消毒液对小肠黏膜下层进行浸泡处理。

3.根据权利要求2所述的SIS组织修复材料的制备方法，其特征在于，所述消毒液的处理方式为：用0.08～1.5％的过氧乙酸和5～20％的乙醇的混合水溶液浸泡10～60分钟，或者0.05～1.5％的乙二胺四乙酸溶液浸泡6～12小时，或者0.01～2％氢氧化钠溶液浸泡6～12小时，5～20％的硫酸新霉素溶液浸泡15～60分钟，碘伏浸泡10～30分钟。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的SIS组织修复材料的制备方法，其特征在于，所述脱脂处理为采用有机溶剂常温下对SIS经1～5次浸泡处理，每次浸泡8～20小时。

5.根据权利要求4所述的SIS组织修复材料的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、氯仿、甲醛、二氯甲烷、三氯甲烷中一种或多种混合的溶液。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的SIS组织修复材料的制备方法，其特征在于，所述脱脂处理完后用纯水分1～5次超声清洗。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的SIS组织修复材料的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理是常温下用高渗盐水、酶溶液、酸溶液或碱溶液中的一种或两种以上混合溶液进行浸泡处理。

8.根据权利要求7所述的SIS组织修复材料的制备方法，其特征在于，所述酶溶液处理为0.1～0.5％的胰蛋白酶溶液浸泡10～30小时；所述酸溶液处理为0.1～1M盐酸、2～8％乙酸溶液或0.08～1％的聚丙烯酸溶液浸泡3～6小时；所述碱溶液处理为0.02～0.1％氢氧化钠溶液或0.5～1.5％氨水溶液浸泡1～2.5小时。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的SIS组织修复材料的制备方法，其特征在于，所述去垢处理是常温下用表面活性剂溶液分1～5次浸泡清洗处理。

10.根据权利要求9所述的SIS组织修复材料的制备方法，其特征在于，所述去垢处理是常温下用0.1～15％的曲拉通、十二烷基磺酸钠、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐或胆酸钠溶液浸泡8～24小时。