CN109260518A - 一种口腔缺损修复膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种口腔缺损修复膜及其制备方法，具体涉及脱细胞基质材料及其制备、在修复口腔缺损中的应用。该制备包括：(1)取猪小肠空肠段，清洗，径向切开，去除粘膜层、肌膜层、浆膜层，获得猪小肠粘膜下层组织膜；(2)将步骤(1)所得猪小肠粘膜下层组织膜置于过氧乙酸溶液或者氢氧化钠溶液中浸泡，取出清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质；(3)用多巴胺溶液浸泡步骤(2)所得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质，灭菌，获得脱细胞基质材料。本发明能够避免猪小肠粘膜下层组织膜中的细胞生长因子的损失，确保所得脱细胞基质材料具有较好组织微孔结构和机械性能，能够满足口腔骨损伤修复的需求；免疫原性低、安全性好。

Description

一种口腔缺损修复膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及组织修复材料技术领域，特别是涉及一种口腔缺损修复膜及其制备方法，具体是一种脱细胞基质材料及其制备、在修复口腔缺损中的应用。

背景技术

目前针对口腔缺损的在上世纪70年代后期到80年代初期，聚缩醛、聚四氟乙烯、钛合金等不可吸收膜首先被应用于引导组织再生，这类材料具有很强的生物惰性，性质稳定，不与组织发生反应，但因其不能被组织吸收，需要在植入人体后4～6周后进行二次手术取出，增加创伤机会，因而难以被患者接受，临床效果也不理想，因此逐渐被可吸收膜所取代。80年代中后期出现了大量可吸收性膜材料，例如：Biogide、Biomend和Biomesh等胶原类膜产品。

细胞外基质(ECM)是一种结构和功能性的天然生物材料，它几乎围绕身体所有组织中的细胞。ECM经过机械法、化学法、酶法等方法，除去原组织中的D NA及细胞，再通过交联、消毒等处理后制备而成，它是一种具有一定的机械强度、低免疫原性的动物源性材料。其中，胶原蛋白是天然的活组织中的主要结构框架，是ECM中最丰富的蛋白质。ECM被动地支持着细胞，并调节细胞与细胞之间的联系，影响细胞的迁移、增殖和分化。ECM还提供了组织修复所需的微孔结构和环境。由于ECM是组织维持所必需的，它在组织修复中也起着重要作用。没有功能性ECM，修复就会停止，因为ECM不再能够支持正常的细胞过程。

细胞外基质(ECM)已经广泛应用于现代生物医学领域，如肌腱重建、下泌尿道重建、硬脑膜修补、血管重建、修复部分或全层皮肤损伤、生物疝修补，抗粘连和骨修复引导膜等方面。例如：现有技术采用京尼平交联改善猪小肠粘膜脱细胞基质的降解性能，同时采用多巴胺作为还原剂还原纳米银，由于多巴胺同时还具有良好的粘附性，使纳米银更为牢固的结合在材料上，纳米银在材料表面可以长期存在，因此其抗菌时效更长，增强了材料的抗菌效果和持续抗菌能力，该材料能够在高应力部位组织修复中应用。例如：现有技术通过取材、预处理、消毒、脱脂、酶处理、去细胞、漂洗、灭菌的步骤制备天然软组织脱细胞基质。但是，这些传统方法受限于制备方法的不合理以及动物源性材质的不合适，因此多数细胞外基质(ECM)材料并不适于口腔缺损修复。

因此，亟待提供一种合适的工艺以及匹配的动物源性材料来用于口腔缺损修复的脱细胞基质材料。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一种口腔缺损修复膜及其制备方法。该制备方法能够尽可能避免细胞生长因子的损失，并且确保所得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料具有较好的组织微孔结构，良好的机械性能，非常适合用于口腔缺损修复。

本发明的主要目的是通过以下技术方案实现的：

一种脱细胞基质材料的制备方法，所述的制备方法包括：

(1)取猪小肠空肠段，清洗，径向切开，去除粘膜层、肌膜层、浆膜层，获得猪小肠粘膜下层组织膜；

(2)将步骤(1)所得猪小肠粘膜下层组织膜置于过氧乙酸溶液或者氢氧化钠溶液中浸泡，取出清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质；

(3)用多巴胺溶液浸泡步骤(2)所得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质，灭菌，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料。

在其中一些实施例中，步骤(2)中，所述的过氧乙酸溶液的质量浓度为0.05％～0.15％；所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.05％～0.15％；所述浸泡的时间为6h～8h。

在其中一些实施例中，所述的过氧乙酸溶液的质量浓度为0.1％；所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.1％；所述浸泡的时间为7h。

在其中一些实施例中，步骤(2)中，清洗后的猪小肠粘膜下层组织膜继续用质量浓度为0.5％～3％的TritonX-100溶液或者丙酮浸泡。

在其中一些实施例中，步骤(3)中，所述多巴胺溶液为含1.5mg/mL～3mg/mL多巴胺的pH8.5、10mM的Tris缓冲液，用所述多巴胺溶液浸泡的时间为10h～13h。

在其中一些实施例中，步骤(1)中，去除猪小肠粘膜下层组织膜内层的粘膜层的方式为采用木质刮板均匀刮除。

在其中一些实施例中，步骤(1)中，去除猪小肠粘膜下层组织膜外层的肌膜层、浆膜层的方式为采用木质刮板、手术刀刮除。

在其中一些实施例中，所述的清洗的方式采用磷酸缓冲盐溶液清洗。

本发明的另一目的是提供一种上述的制备方法获得的脱细胞基质材料。

本发明的再一目的是提供一种上述的脱细胞基质材料作为修复材料在修复口腔缺损中的应用。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明从猪小肠组织中挑选猪小肠粘膜下层组织膜，并采用过氧乙酸溶液或者氢氧化钠溶液浸泡的方式去除DNA等制备猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质，特别是配合采用合适浓度的过氧乙酸溶液或者氢氧化钠溶液并控制浸泡时间，然后再在猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质上积累一层多巴胺，从而获得脱细胞基质材料。该制备工艺获得的脱细胞基质材料生物安全性得到了提高、免疫原性降到了可以接受的范围，具有较好的组织微孔结构和机械性能，拉伸强度变大满足临床所需要的机械性能安全性，同时避免了交联剂增强物理性能带来的细胞毒性；特别是，该制备工艺在实施过程中，能够避免猪小肠粘膜下层组织膜中的细胞生长因子的损失。本发明的脱细胞基质材料很好的满足口腔损伤修复的需求，使骨缺损和口腔上皮组织和结缔组织得到了修复。

附图说明

图1、猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料的HE染色。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

本实施例提供一种猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料及其制备方法。该制备方法包括：

步骤1、取猪小肠空肠段，清洗并径向剪开，并使用PBS溶液(磷酸缓冲盐溶液)反复冲洗以去除污染物。

步骤2、物理去除粘膜，使用木质刮板，小心均匀地刮去SIS膜内层的粘膜层。

步骤3、物理去除肌膜和浆膜，木质刮板和手术刀配合使用，去除SIS膜外层的肌膜层和浆膜层。

步骤4、配置0.1％(质量分数)过氧乙酸溶液，然后将除去粘膜层、肌膜层和浆膜层的SIS膜浸泡在0.1％过氧乙酸溶液7个小时。

步骤5、取出过氧乙酸溶液处理后的SIS膜，使用PBS溶液反复清洗3次。

步骤6、将SIS膜放置于玻璃器皿中，使其完全铺展开并贴壁。

步骤7、配置10mM的Tris缓冲液，使其pH值为8.5，随后加入多巴胺粉末，使多巴胺粉末的终浓度为2mg/mL。

步骤8、将多巴胺溶液缓缓倒入放置SIS膜的玻璃器皿，使其完全浸没SIS膜，静止12小时。

步骤9、伽马射线辐照灭菌备用，辐照剂量25kGy～30kGy。

实施例2

本实施例提供一种猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料及其制备方法。该制备方法包括：

步骤1、取猪小肠空肠段，清洗并径向剪开，并使用PBS溶液反复冲洗以去除污染物。

步骤2、物理去除粘膜，使用木质刮板，小心均匀地刮去SIS膜内层的粘膜层。

步骤3、物理去除肌膜和浆膜，木质刮板和手术刀配合使用，去除SIS膜外层的肌膜层和浆膜层。

步骤4、配置1％(质量分数)氢氧化钠溶液和0.5％(质量分数)的TritonX-100溶液，将除去粘膜层、肌膜层和浆膜层的SIS膜浸泡在0.1％(质量分数)氢氧化钠溶液7个小时。

步骤5、取出氢氧化钠溶液处理后的SIS膜，使用PBS溶液反复清洗3次。

步骤6、将除去粘膜层、肌膜层和浆膜层的SIS膜浸泡在0.5％(质量分数)的TritonX-100溶液中冲洗4个小时。取出TritonX-100溶液处理后的SIS膜，使用PBS溶液反复清洗3次。

步骤7、将SIS膜放置于玻璃器皿中，使其完全铺展开。

步骤8、配置10mM的Tris缓冲液，使其pH值为8.5，随后加入多巴胺粉末，使其浓度为2mg/mL。

步骤9、将多巴胺溶液缓缓倒入放置SIS膜的玻璃器皿，使其完全浸没SIS膜。静止12小时。

步骤10、伽马射线辐照灭菌备用，辐照剂量25kGy～30kGy。

实施例3

本实施例提供一种猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料及其制备方法。该制备方法包括：

步骤1、清洗并径向剪开，并使用PBS溶液反复冲洗以去除污染物。

步骤2、物理去除粘膜，使用木质刮板，小心均匀地刮去SIS膜内层的粘膜层。

步骤3、物理去除肌膜和浆膜，木质刮板和手术刀配合使用，去除SIS膜外层的肌膜层和浆膜层。

步骤4、配置1％氢氧化钠溶液，然后将除去粘膜层、肌膜层和浆膜层的SIS膜浸泡在0.1％氢氧化钠溶液7个小时。

步骤5、取出氢氧化钠溶液处理后的SIS膜，使用PBS溶液反复清洗3次。

步骤6、取SIS膜放入丙酮中，搅拌2小时。随后取出用PBS溶液反复清洗3次。

步骤7、将SIS膜放置于玻璃器皿中，使其完全铺展开。

步骤8、配置10mM的Tris缓冲液，使其pH值为8.5，随后加入多巴胺粉末，使其浓度为2mg/mL。

步骤9、将多巴胺溶液缓缓倒入放置SIS膜的玻璃器皿，使其完全浸没SIS膜。静止12小时。

步骤10、伽马射线辐照灭菌备用，辐照剂量25kGy～30kGy。。

实施例4～5

本实施例4～5都是实施例1的变化例，变化之处主要在于：

实施例4中，过氧乙酸溶液的质量浓度为0.15％、浸泡的时间为6h。

实施例5中，过氧乙酸溶液的质量浓度为0.05％、浸泡的时间为8h。

对比例1

本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别包括：步骤4中，采用脱氧胆酸钠溶液代替过氧乙酸溶液。

对比例2

本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1的主要差别包括：过氧乙酸溶液的质量浓度为0.3％、浸泡时间为12h。

性能测试

(1)细胞生长因子检测：称取猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料粉碎后样品5mg，加入1mL Buffer 1，高速低温匀浆20～30min至液体呈胶体状，14000rpm高速离心30min，提取上清液，定容到1mL，4℃保存。TGFβ和VEGF采用双抗夹心ELISA法。

(2)微观结构观察：将猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料进行HE染色并观察其微观结构。如图1所示。按照实例1中操作步骤制备的猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料具备完整的微观结构，细胞去除完全，胶原纤维排列规整，因此为脱细胞基质保留良好的机械性能提供了坚实基础。

(3)机械性能：将猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料裁剪成固定性状，在机械万能试验机上面测试其拉伸强度、断裂伸长率和弹性模量。

(4)免疫原性：依据“组织工程医疗器械产品动物源性支架材料残留α-gal抗原检测”行业标准草案(报批稿)中介绍的方法，分别对猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料进行了α-Gal抗原含量测定，成品α-Gal抗原清除率分析。

结果参见表1。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：

(1)取猪小肠空肠段，清洗，径向切开，去除粘膜层、肌膜层、浆膜层，获得猪小肠粘膜下层组织膜；

(2)将步骤(1)所得猪小肠粘膜下层组织膜置于过氧乙酸溶液或者氢氧化钠溶液中浸泡，取出清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质；

(3)用多巴胺溶液浸泡步骤(2)所得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质，灭菌，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料。

2.根据权利要求1所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的过氧乙酸溶液的质量浓度为0.05％～0.15％；所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.05％～0.15％；所述浸泡的时间为6h～8h。

3.根据权利要求2所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的过氧乙酸溶液的质量浓度为0.1％；所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.1％；所述浸泡的时间为7h。

4.根据权利要求1至3任一项所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，清洗后的猪小肠粘膜下层组织膜继续用质量浓度为0.5％～3％的TritonX-100溶液或者丙酮浸泡。

5.根据权利要求1至3任一项所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述多巴胺溶液为含1.5mg/mL～3mg/mL多巴胺的pH8.5、10mM的Tris缓冲液，用所述多巴胺溶液浸泡的时间为10h～13h。

6.根据权利要求1至3任一项所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，去除粘膜层的方式为采用木质刮板均匀刮除。

7.根据权利要求1至3任一项所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，去除肌膜层、浆膜层的方式为采用木质刮板、手术刀刮除。

8.根据权利要求1至3任一项所述的脱细胞基质材料的制备方法，步骤(1)、步骤(2)中，所述的清洗的方式采用磷酸缓冲盐溶液清洗。

9.权利要求1至8任一项所述的制备方法获得的脱细胞基质材料。

10.权利要求9所述的脱细胞基质材料作为修复材料在修复口腔缺损中的应用。