CN106139250A - 一种脱细胞异种神经移植物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脱细胞异种神经移植物及其制备方法。该方法，包括如下步骤：将离体的哺乳动物的周围神经依次用碱溶液、表面活性剂溶液、脱脂剂、PBS缓冲液进行浸泡处理后，冻干，灭菌，得到所述脱细胞异种神经移植物。本发明所制备的脱细胞异种神经移植物具有良好的组织相容性，能重建神经再生通路，引导轴突再生，加速神经功能修复，在周围神经的损伤修复领域具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种脱细胞异种神经移植物及其制备方法。
背景技术
周围神经损伤是临床常见的创伤疾病。随着社会的发展以及近些年自然灾害的频发，事故、肿瘤、战争、地震等导致的神经损伤人数逐年增加，据统计，全球每年约超过一百万人会遭遇周围神经损伤，并造成不同程度的功能损害、丧失、畸形甚至残疾，给患者带来了极大痛苦。由于周围神经损伤后病理过程复杂、成熟的神经元不能分裂和复制、神经修复和再生缓慢等因素，如何对周围神经损伤进行有效治疗一直是医学界的难题。
目前，周围神经损伤的治疗主要是药物保守治疗和外科手术治疗。药物保守治疗是针对小段神经缺损，可依赖内在神经再生能力自动修复神经损伤，为损伤部位提供药理作用和为神经修复提供营养物质；同时也为外科手术提供辅助治疗的作用。外科手术治疗针对的是长段的周围神经损伤，包括直接手术缝合和神经移植技术等，其中神经移植技术包括自体移植及神经修复材料等，前者因其能提供神经生长因子、免疫排异小，被视为周围神经修复的金标准，但存在来源有限、造成新创和引发供区麻木、瘢痕、神经瘤等并发症的弊端。目前临床中采用的神经修复材料如同种异体神经多取材自残肢，通过脱细胞以保证安全、无免疫排斥、不带病毒，但存在取材困难和价格昂贵等问题。
基于自体神经移植和同种异体神经移植物所存在的缺陷，临床上急需一种取材方便、制备过程简单、能最大程度上保留天然神经细胞外基质微结构同时价格低廉的周围神经再生修复材料。
发明内容
本发明采用碱法与表面活性剂相结合的工艺，在温和的条件下去除细胞，能最大限度保留神经细胞外基质的完整性及其生物学活性。
本发明的目的是提供一种脱细胞异种神经移植物及其制备方法。该神经移植物完整保留了天然周围神经的细胞外基质微结构，同时无免疫原性，促缺损神经再生修复效果良好。
本发明还提供了一种制备脱细胞异种神经移植物的方法。该方法包括如下步骤：
将离体的哺乳动物的周围神经依次用碱溶液、表面活性剂溶液、脱脂剂、PBS缓冲液进行浸泡处理后，冻干，灭菌，得到所述脱细胞异种神经移植物。
上述方法中，所述哺乳动物为猪、牛、羊、马、犬或猕猴等。
所述周围神经可为坐骨神经、尺神经、桡神经或腓丛神经等。
所述离体的哺乳动物的周围神经可按照如下步骤获得：将屠宰后的哺乳动物在无菌操作下切取周围神经，取下后立即进行余下操作。
所述碱溶液为碱性化合物的水溶液；
所述碱性化合物具体选自NH3·H2O、NaOH、Ca(OH)2、KOH、Na2CO3和NaHCO3中的至少一种；
所述碱溶液的浓度为0.2-2M，具体可为0.5M或1.5M；
用碱溶液进行浸泡处理步骤中，温度为0-25℃，具体可为4℃或10℃或15℃或20℃，时间为1-2小时，具体可为40分钟或1小时或90分钟或100分钟。
所述表面活性剂溶液为表面活性剂的水溶液；
所述表面活性剂具体为硫代甜菜碱10(SB-10)或曲拉通X-200(TritonX-200)；
用表面活性剂溶液进行浸泡处理具体包括如下步骤：先用SB-10的水溶液进行一次浸泡处理，再用由TritonX-200与SB-10的混合水溶液进行二次浸泡处理；
所述一次浸泡处理中，SB-10的水溶液的浓度具体为125mmol/L；
所述二次浸泡处理中，由TritonX-200与SB-10的混合水溶液中，TritonX-200的质量百分浓度为0.14％；SB-10的浓度为0.6mmol/L；
所述一次浸泡处理和二次浸泡处理步骤中，温度均为0-25℃，具体可为4℃或10℃或20℃，时间均为7-24小时，具体可为10小时或12小时或20小时。
所述脱脂剂选自异丙醇、丙酮、三氯甲烷和二氯甲烷中的一种或几种的混合物；
用脱脂剂进行浸泡处理步骤中，温度为0-25℃，具体可为4℃或10℃或20℃；浸泡的方式为振荡浸泡；时间为8-10小时，具体可为9小时或10小时。
所述PBS缓冲液的pH值为5.8-7.8，具体可为7.4；
用PBS缓冲液进行浸泡处理的温度为0-25℃，具体可为4℃或10℃或20℃；时间为8-18小时，具体可为10小时或12小时或18小时。
所述冻干步骤中，冻干的时间为8-12小时，具体可为10小时。
所述灭菌步骤中，灭菌的方式为环氧乙烷灭菌、钴-60辐照或电子束灭菌。
所述环氧乙烷灭菌中，灭菌温度为30-70℃，湿度为30-80RH，环氧乙烷的浓度为400-800mg/L，灭菌的时间为2-4小时，具体可为3小时；
所述钴-60辐照灭菌或电子束灭菌工艺中，辐照剂量为13-25KGy。
该方法所得脱细胞异种神经移植物结构示意图如图1所示。
另外，按照上述方法制备得到的脱细胞异种神经移植物及该脱细胞异种神经移植物在神经损伤修复或制备修复神经损伤材料中的应用，也属于本发明的保护范围。其中，所述神经为周围神经、坐骨神经、尺神经、桡神经或腓丛神经。
本发明提供的脱细胞异种神经移植物，是用化学方法脱除动物源性神经中的细胞成分，得到脱细胞神经外基质。该方法去除了能引起免疫反应的异种细胞，保留了除细胞外大部分的基质、纤维，无免疫排异反应、生物相容性好、使用安全，为神经纤维再生、恢复神经传导功能提供天然的管道支架和营养环境。
附图说明
图1为脱细胞异种神经移植物结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1、猪脱细胞异种神经移植物的制备
1、前处理：将屠宰场已经屠宰完毕的健康成年猪，无菌操作取坐骨神经，用纯化水充分洗涤。
2、碱处理：1.5M NH3·H2O水溶液，4℃浸泡处理60分钟，用纯化水充分洗涤。以去除细胞膜中的非胶原类蛋白。
3、表面活性剂处理：首先进行SB-10处理，在125mmol/L SB-10中4℃浸泡处理12小时，PBS充分洗涤；然后用0.14％TritonX-200、0.6mmol/L SB-10混合溶液处理，4℃浸泡处理7小时。以破坏细胞膜的磷脂双分子层结构，使细胞破裂，释放细胞质和核物质。
4、脱脂处理：将产物置于异丙醇中20℃振荡浸泡8小时。脱去神经中的脂肪。
5、PBS缓冲处理：pH 7.4的PBS缓冲液，4℃处理12小时。
6、冻干与灭菌处理：冻干机冷冻干燥10小时后，进行钴-60辐照灭菌，25KGy，无菌封装。
实施例2：牛脱细胞异种神经移植物的制备
1、前处理：将屠宰场已经屠宰完毕的健康成年牛，无菌操作取尺神经，用纯化水充分洗涤。
2、碱处理：2M KOH水溶液，10℃浸泡处理100分钟，用纯化水充分洗涤。以去除细胞膜中的非胶原类蛋白。
3、表面活性剂处理：首先进行SB-10处理，在125mmol/L SB-10中10℃浸泡处理12小时，PBS充分洗涤；然后用0.14％TritonX-200、0.6mmol/L SB-10混合溶液处理，10℃浸泡处理7小时。以破坏细胞膜的磷脂双分子层结构，使细胞破裂，释放细胞质和核物质。
4、脱脂处理：将产物置于丙酮中25℃振荡浸泡10小时。脱去神经中的脂肪。
5、PBS缓冲处理：pH 7.4的PBS缓冲液，10℃处理18小时。
6、冻干与灭菌处理：冻干机冷冻干燥10小时后，进行环氧乙烷灭菌，无菌封装。
灭菌参数：温度在30-70℃之间、湿度在30-80RH之间，环氧乙烷的浓度在400-800mg/L之间，灭菌3小时。
实施例3：犬脱细胞异种神经移植物的制备
1、前处理：将屠宰场已经屠宰完毕的健康成年犬，无菌操作取桡神经，用纯化水充分洗涤。
2、碱处理：0.5M Ca(OH)2水溶液，20℃浸泡处理40分钟，用纯化水充分洗涤。以去除细胞膜中的非胶原类蛋白。
3、表面活性剂处理：首先进行SB-10处理，在125mmol/L SB-10中20℃浸泡处理12小时，PBS充分洗涤；然后用0.14％TritonX-200、0.6mmol/L SB-10混合溶液处理，20℃浸泡处理7小时。以破坏细胞膜的磷脂双分子层结构，使细胞破裂，释放细胞质和核物质。
4、脱脂处理：将产物置于三氯甲烷中10℃振荡浸泡9小时。脱去神经中的脂肪。脱去神经中的脂肪。
5、PBS缓冲处理：pH 7.4的PBS缓冲液，20℃处理10小时。
6、冻干与灭菌处理：冻干机冷冻干燥10小时后，进行电子束灭菌，无菌封装。
实施例4：马脱细胞异种神经移植物的制备
1、前处理：将屠宰场已经屠宰完毕的健康成年马，无菌操作取腓丛神经，用纯化水充分洗涤。
2、碱处理：1.5M KOH水溶液，15℃浸泡处理90分钟，用纯化水充分洗涤。以去除细胞膜中的非胶原类蛋白。
3、表面活性剂处理：首先进行SB-10处理，在125mmol/L SB-10中4℃浸泡处理20小时，PBS充分洗涤；然后用0.14％TritonX-200、0.6mmol/L SB-10混合溶液处理，10℃浸泡处理10小时。以破坏细胞膜的磷脂双分子层结构，使细胞破裂，释放细胞质和核物质。
4、脱脂处理：将产物置于二氯甲烷中4℃振荡浸泡10小时。脱去神经中的脂肪。
5、PBS缓冲处理：pH 7.4的PBS缓冲液，10℃处理18小时。
6、冻干与灭菌处理：冻干机冷冻干燥10小时后，进行钴-60辐照灭菌，25KGy，无菌封装。
实施例5：动物实验
选用健康成年雌性猕猴为实验动物，以坐骨神经为缺损模型，以实施例1制备得到的产品为实验品，分为脱细胞神经修复组(A组)、原位逆行神经对照组(B组)、神经缺损对照组(C组)，分别进行暴露术部、桥接神经、缝合。
术后1、3、5月，分三个时间点对三组实验动物进行大体观察、外周血淋巴细胞分析(术前检测一次)、神经电生理检测、组织学观察、透射电镜观察的检测，验证本发明脱细胞异种神经移植物的神经修复功能。
术后三组猕猴均存活，进食、饮水均正常，创口愈合良好，无感染，A、B组跛行步态逐渐转好，C组跛行依然明显；A、B组CD4+/CD8+T淋巴细胞比值术前、术后无差异；A、B组神经传导速度逐渐提高，A组略高于B组；A、B组术部神经逐步增粗，无塌陷、变扁，均有轻度粘连；HE染色A、B组神经纤维逐渐髓鞘化、纤维呈有规律的紧密排列，A组髓鞘化和规律性均略高于B组；透射电镜观察到术后5个月，A、B组横切面均可见大量再生有髓神经纤维和无髓纤维混合，施旺细胞包绕在轴突外侧形成有髓纤维，大多数髓鞘结构发育良好，呈同心圆板层样结构，B组有少数不成熟的髓鞘，A组髓鞘厚度显著比B组厚。
Claims (10)
1.一种制备脱细胞异种神经移植物的方法，包括如下步骤：
将离体的哺乳动物的周围神经依次用碱溶液、表面活性剂溶液、脱脂剂、PBS缓冲液进行浸泡处理后，冻干，灭菌，得到所述脱细胞异种神经移植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述哺乳动物为猪、牛、羊、马、犬或猕猴；
所述周围神经为坐骨神经、尺神经、桡神经或腓丛神经。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述碱溶液为碱性化合物的水溶液；或者，
所述碱溶液为如下至少一种化合物的水溶液：NH3·H2O、NaOH、Ca(OH)2、KOH、Na2CO3和NaHCO3；
所述碱溶液的浓度为0.2-2M；
用碱溶液进行浸泡处理步骤中，温度为0-25℃；时间为1-2小时。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂溶液为表面活性剂的水溶液、SB-10的水溶液或TritonX-200的水溶液；
用表面活性剂溶液进行浸泡处理具体包括如下步骤：先用SB-10的水溶液进行一次浸泡处理，再用由TritonX-200与SB-10的混合水溶液进行二次浸泡处理；
所述一次浸泡处理中，SB-10的水溶液的浓度具体为125mmol/L；
所述二次浸泡处理中，由TritonX-200与SB-10的混合水溶液中，TritonX-200的质量百分浓度具体为0.14％；SB-10的浓度具体为0.6mmol/L；
所述一次浸泡处理和二次浸泡处理步骤中，温度具体为0-25℃，时间具体为7-24小时。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述脱脂剂选自异丙醇、丙酮、三氯甲烷和二氯甲烷中的至少一种；
用脱脂剂进行浸泡处理步骤中，温度为0-25℃；浸泡的方式为振荡浸泡；时间为8-10小时。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述PBS缓冲液的pH值为5.8-7.8；
用PBS缓冲液进行浸泡处理的温度0-25℃，时间为8-18小时。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述灭菌步骤中，灭菌的方式为环氧乙烷灭菌、钴-60辐照或电子束灭菌。
8.权利要求1-7中任一所述方法制备得到的脱细胞异种神经移植物。
9.权利要求8所述脱细胞异种神经移植物在神经损伤修复或制备修复神经损伤材料中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述神经为周围神经、坐骨神经、尺神经、桡神经或腓丛神经。
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