CN114796615B - 一种软骨脱细胞基质及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种软骨脱细胞基质及其制备方法，所述制备方法包括如下步骤：使用酶类溶液对洁净软骨进行处理；使用非离子型试剂对浅层的细胞成分进行去除；使用离子型试剂对深层的细胞成分进行初步去除；使用两性离子型试剂对深层的细胞成分进行二次去除；使用纯化水进行清洗，得到脱细胞后的软骨材料；使用有机溶剂进行脱脂处理，得到脱脂后的软骨材料；对脱脂后的软骨材料进行病毒灭活得到灭活后的软骨材料；对灭活后的软骨材料进行冷冻干燥，得到软骨脱细胞基质。本发明提供的软骨脱细胞基质的制备方法，软骨材料不需要进行破坏重建，在不破坏软骨本身结构的情况下获得软骨脱细胞基质，很好的保护了软骨材料本身的Ⅱ型胶原网络。

Description

一种软骨脱细胞基质及其制备方法
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，具体而言，涉及一种软骨脱细胞基质及其制备方法。
背景技术
鼻部整形手术已经发展成为整形外科中一种较为成熟的术式。随着时代的发展，好多患者已不是由于面部缺损而寻求鼻整形手术。爱美之心使得医疗美容行业发展迅速，对鼻部整形的市场需求日益增大，因此,一种合适的鼻部软骨移植物将成为鼻整形技术未来发展的关键需求。
目前广泛使用的隆鼻假体包括膨体聚四氟乙烯（ePTFE）、固体硅胶、玻尿酸、人工骨材料等，但由于这几种材料有各自的局限性，因此目前大多使用的鼻整形材料来源于自体软骨。但自体软骨取材于患者自身，这会带给患者不可避免的手术伤害，因此,目前研究人员寄希望于开发出一种来源于异体的软骨材料，以避免对患者身体的损伤,并且能实现很好的整形效果。
异体软骨材料来源广泛，易于获得，成本较低，经过脱细胞处理后材料本身保留了软骨组织中的天然细胞外基质（ECM）微环境，去除了其中的细胞、核成分，避免了潜在的免疫排斥反应，且经过脱脂、灭菌处理后去除了软骨组织中潜在的致敏原。这样获得的脱细胞软骨材料可以安全替代患者本身的软骨，使异体软骨隆鼻技术获得极大发展。
软骨属于致密组织，各种脱细胞方法对软骨的脱细胞效果影响差别较大。目前的软骨脱细胞基质的获得都是通过将材料本身粉碎，结合其他材料重建软骨组织体;将材料粉碎后与其他高分子材料混合重建的方法,面临着一个重大的问题是高分子材料都不可避免的会发生生物体内快速降解现象，随着高分子材料的降解，组织体可能会面临崩碎等情况；而鼻部整形手术大多数寻求的材料为降解缓慢或较难降解的材料，天然的软骨材料本身的Ⅱ型胶原网络结构就可以满足这样的降解需求，因此，在不破坏软骨本身结构的情况下获得软骨脱细胞基质将成为异体软骨材料研究的方向。
发明内容
本发明解决的问题是如何在不破坏软骨本身结构的情况下获得软骨脱细胞基质。
为解决上述问题，本发明提供一种软骨脱细胞基质的制备方法，包括如下步骤：
S1：取哺乳动物的软骨，对所述软骨进行预处理，得到洁净软骨；
S2：使用酶类溶液对所述洁净软骨进行处理，打开所述洁净软骨表层的孔隙结构，得到软骨材料A；
S3：使用非离子型试剂对所述软骨材料A浅层的细胞成分进行去除，得到软骨材料B；
S4：使用离子型试剂对所述软骨材料B深层的细胞成分进行初步去除，得到软骨材料C；
S5：使用两性离子型试剂对所述材料C深层的细胞成分进行二次去除，得到软骨材料D；
S6：使用纯化水对所述软骨材料D进行清洗，得到脱细胞后的软骨材料；
S7：使用有机溶剂对所述脱细胞后的软骨材料进行脱脂处理，得到脱脂后的软骨材料；
S8：对所述脱脂后的软骨材料进行病毒灭活，得到灭活后的软骨材料；
S9：对所述灭活后的软骨材料进行冷冻干燥，得到软骨脱细胞基质。
可选地，步骤S1中对所述软骨进行预处理包括：使用刀具去除所述软骨表面的肉及骨膜，再使用纯化水对所述软骨进行清洗。
可选地，步骤S2中的所述酶类溶液包括胰酶溶液；使用酶类溶液对所述洁净软骨进行处理包括：使用质量浓度为1%的胰酶溶液对所述洁净软骨进行消化，在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡8-12h。
可选地，步骤S3中的所述非离子型试剂包括Triton X-100/乙醇溶液；使用非离子型试剂对所述软骨材料A浅层的细胞成分进行去除包括：使用质量浓度为1%的 Triton X-100/乙醇溶液消化所述软骨材料A，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，震荡14-17h。
可选地，步骤S4中的所述离子型试剂包括脱氧胆酸钠缓冲液；使用离子型试剂对所述软骨材料B深层的细胞成分进行初步去除包括：使用质量浓度为1%的脱氧胆酸钠缓冲液处理所述软骨材料B，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，震荡4-6h。
可选地，步骤S5中的所述两性离子型试剂为CHAPS缓冲液；使用两性离子型试剂对所述软骨材料C深层的细胞成分进行二次去除包括：使用质量浓度为4%的CHAPS缓冲液处理所述软骨材料C，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速160r条件下，震荡14-17h。
可选地，使用有机溶剂对所述脱细胞后的软骨材料进行脱脂处理包括：将所述脱细胞后的软骨材料置于有机溶剂中震荡脱脂3次，随后用纯化水进行洗涤；所述震荡脱脂包括：在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡2h。
可选地，对所述灭活后的软骨材料进行冷冻干燥包括：将所述灭活后的软骨材料置于-20℃的冰箱中冷冻2h，随后置于真空冷冻干燥机中，于-64℃、10pa的条件下干燥处理24h。
可选地，还包括：S10：采用环氧乙烷对所述软骨脱细胞基质进行灭菌。
本发明的另一目的在于提供一种软骨脱细胞基质，通过如上所述的软骨脱细胞基质的制备方法进行制备。
与现有技术相比，本发明提供的软骨脱细胞基质的制备方法具有如下优势：
本发明提供的软骨脱细胞基质的制备方法，软骨材料不需要进行破坏重建，在不破坏软骨本身结构的情况下获得软骨脱细胞基质，很好的保护了软骨材料本身的Ⅱ型胶原网络，这样获得的软骨脱细胞基质可以很好的实现材料原本的机械性能；同时，由于Ⅱ型胶原网络结构完整，材料的抗降解性能更加贴近于软骨材料本身，可以减少植入体内后由于其网络结构降解而产生的破损、崩碎等现象。
附图说明
图1为本发明制备的软骨脱细胞基质的图片；
图2为本发明对比例1制备的软骨脱细胞基质的图片
图3为本发明实施例2及对比例制备的软骨脱细胞基质的DNA残留检测结果对比图；
图4为本发明实施例2及对比例制备的软骨脱细胞基质的细胞毒性检测结果对比图；
图5为本发明实施例2制备的软骨脱细胞基质的扫描电镜检测图；
图6为本发明对比例2制备的软骨脱细胞基质的扫描电镜检测图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为能够在不破坏软骨本身结构的情况下获得软骨脱细胞基质，本发明提供一种软骨脱细胞基质的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
S1：取哺乳动物的软骨，对软骨进行预处理，得到洁净软骨；
S2：使用酶类溶液对洁净软骨进行处理，打开洁净软骨表层的孔隙结构，得到软骨材料A；
S3：使用非离子型试剂对软骨材料A浅层的细胞成分进行去除，得到软骨材料B；
S4：使用离子型试剂对软骨材料B深层的细胞成分进行初步去除，得到软骨材料C；
S5：使用两性离子型试剂对软骨材料C深层的细胞成分进行二次去除，得到软骨材料D；
S6：使用纯化水对软骨材料D进行清洗，得到脱细胞后的软骨材料；
S7：使用有机溶剂对脱细胞后的软骨材料进行脱脂处理，得到脱脂后的软骨材料；
S8：对脱脂后的软骨材料进行病毒灭活，得到灭活后的软骨材料；
S9：对灭活后的软骨材料进行冷冻干燥，得到软骨脱细胞基质。
本申请优选哺乳动物选自猪、牛、羊中的一种；为能够在不破坏软骨本身结构的情况下，获得软骨脱细胞基质，需要对选自哺乳动物的软骨中的细胞成分进行彻底去除。
由于哺乳动物的软骨材料材质致密，传统的脱细胞基质方法，脱细胞溶液难以进入软骨材料的内部，导致在不对软骨材料进行破碎的情况下，难以将软骨材料内部的细胞成分进行去除，导致制备的脱细胞软骨材料中存在潜在的致敏源，因此，现有的软骨脱细胞基质的获得都是通过将异体软骨材料本身粉碎，再结合其他高分子材料混合重建；对鼻部整形技术而言，为获得持久的整形效果，要求植入的软骨材料为不降解或难降解材料；而高分子材料不可避免的会发生降解，因此，通过将异体软骨粉碎后与高分子材料结合得到的软骨材料，难以满足鼻部整形效果持久的要求。
为便于对软骨中的细胞成分进行彻底去除，本申请首先使用酶类溶液对经预处理得到的洁净软骨进行处理，在去除洁净软骨表面以及浅层细胞成分的同时，能够打开软骨表面致密的孔隙结构，从而使得脱细胞溶液能够进入软骨材料的内部，以便于实现对软骨材料内部的细胞成分进行去除；为便于理解，将得到的软骨材料记为软骨材料A；进一步使用非离子型试剂对软骨材料A进行处理，利用非离子型试剂作用条件温和，不破坏材料本身结构的特点，在不伤害软骨材料A结构的基础上，进一步较为彻底的去除残留于软骨材料A浅层的细胞及细胞碎片成分，得到软骨材料B；但是该非离子型试剂难以深入软骨材料的内部，再使用离子型试剂对软骨材料B进行处理，得到软骨材料C；这种离子型试剂作用强烈，在通过酶类溶液以及非离子型试剂对软骨材料进行处理的基础上，该离子型试剂能够快速渗透至软骨材料的内部，在短时间内能够对软骨材料深层的细胞成分进行去除，同时又不会对软骨材料自身的结构造成伤害；为能够彻底的对软骨材料深层的细胞成分进行去除，本申请进一步使用性能较离子型试剂温和的两性离子型试剂对软骨材料C进行处理，在通过离子型试剂进行处理的基础上，使得该两性离子型试剂能够很好地深入到软骨材料的内部，从而能够在不对软骨材料的Ⅱ型胶原网络造成较大破坏的基础上，彻底的对软骨材料内部的细胞成分进行去除，得到软骨材料D。
为能够更加彻底的对软骨材料中的细胞成分进行去除，可重复上述步骤S2~S5两次或多次，多次循环处理可以使各溶液交替进行反应，从而可以很彻底的去除软骨材料各层次的细胞及细胞残留物，并且可以防止溶液长时间放置而滋生细菌的情况发生；再使用纯化水对软骨材料D进行彻底清洗，完成脱细胞过程，得到脱细胞后的软管材料；本申请优选该清洗过程为：在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速为200r条件下，震荡72h，其中每12h更换新鲜的纯化水。
为进一步去除软骨材料中的致敏源，依次对脱细胞后的软骨材料进行脱脂处理、病毒灭活处理以及冷冻干燥，得到适用于鼻部整形手术的软骨脱细胞基质；其中病毒灭活处理方法可以为使用酒精或氢氧化钠灭活。
本发明提供的软骨脱细胞基质的制备方法，软骨材料不需要进行破坏重建，在不破坏软骨本身结构的情况下获得软骨脱细胞基质，很好的保护了软骨材料本身的Ⅱ型胶原网络，这样获得的软骨脱细胞基质可以很好的实现材料原本的机械性能；同时，由于Ⅱ型胶原网络结构完整，材料的抗降解性能更加贴近于软骨材料本身，可以减少植入体内后由于其网络结构降解而产生的破损、崩碎等现象。
此外，该制备方法中，对软骨材料使用阶段性酶处理，一方面可以消化去除材料中的细胞成分，另一方面可以防止由于长期酶作用而破坏软骨材料本身的Ⅱ型胶原网络结构；阶段性酶处理可以打开不同层次的致密网络结构，使软骨材料的孔隙结构稍微变得疏松，为后续其他化学试剂的进入提供良好的条件。
具体的，本申请优选步骤S1中对软骨进行预处理包括：使用刀具去除软骨表面的肉及骨膜，再使用纯化水对软骨进行清洗。
该步骤中，取哺乳动物的自体软骨，使用刀具去除软骨表面的肉及骨膜，以获得洁白软骨材料为处理目标，要求其表面无任何肉质残渣和微粉色的骨膜残留；再使用纯化水对获得的软骨材料进行清洗，首先使用流水冲洗至软骨洁净，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速为200r条件下对软骨材料震荡清洗4次，每次30分钟，得到洁净软骨。
本申请优选步骤S2中的酶类溶液包括胰酶溶液；使用酶类溶液对洁净软骨进行处理包括：使用质量浓度为1%的胰酶溶液对洁净软骨进行消化，在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡8h-12h。
其中胰酶溶液为胰酶溶解在无菌的PBS溶液中得到；通过轻微震荡可以使得胰酶溶液能够始终均匀的对洁净软骨进行反应，从而能够更好的去除洁净软骨表面以及浅层细胞成分，同时轻微打开洁净软骨表面致密的孔隙结构，进而使得本申请中后续的溶液处理能够进入软骨组织体内部。
本申请优选步骤S3中的非离子型试剂包括Triton X-100/乙醇溶液；使用非离子型试剂对软骨材料A浅层的细胞成分进行去除包括：使用质量浓度为1%的 Triton X-100/乙醇溶液消化软骨材料A，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，震荡14-17h。
该步骤中使用的Triton X-100/乙醇溶液为Triton X-100溶解在75%的乙醇溶液中得到；本申请通过Triton X-100/乙醇溶液配合强烈震荡处理，可以在不伤害材料的情况下，进一步去除浅层的细胞残留，同时75%乙醇的使用可以防止材料反应过程中细菌生长，且可以发挥脱水作用使细胞溶解，以去除细胞残留。此外，这种非离子型洗涤剂不易残留于材料内部，可以很轻易的被洗脱干净。
本申请优选步骤S4中的离子型试剂包括脱氧胆酸钠缓冲液；使用离子型试剂对软骨材料B深层的细胞成分进行初步去除包括：使用质量浓度为1%的脱氧胆酸钠缓冲液处理软骨材料B，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，震荡4-6h。
本申请中的脱氧胆酸钠缓冲液为脱氧胆酸钠溶解在1mol/L的氯化钠溶液中得到；脱氧胆酸钠处理可以深入软骨组织内部，清除软骨组织体内部的细胞成分；这种离子型洗涤剂作用强烈，但短时间使用不会破坏材料结构；其容易渗透致密组织内部，可以很好的去除软骨材料深层的细胞成分，随后使用CHAPS缓冲液彻底洗脱出材料深层及浅层的细胞成分，随后进行的一次循环可以保证将细胞等成分去除的更加彻底；且软骨的Ⅱ型胶原网络本身不易粘连脱氧胆酸钠，可以使用较为彻底的清洗方法将其洗出，从而不会造成细胞毒性伤害。
本申请优选步骤S5中的两性离子型试剂为CHAPS缓冲液；使用两性离子型试剂对软骨材料C深层的细胞成分进行二次去除包括：使用质量浓度为4%的CHAPS缓冲液处理软骨材料C，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速160r条件下，震荡14-17h。
CHAPS缓冲液为CHAPS溶解在纯化水中得到；对软骨材料使用CHAPS缓冲液进行处理，这种溶液作用较为温和，不似碱性溶液的强破坏性，它可以很好的深入到软骨组织体内部，长时间的作用辅以强烈震荡作用可以较为彻底的洗脱出材料深层的细胞成分，且不会对Ⅱ型胶原网络造成较大破坏。
本申请通过阶段性酶处理，同时辅以震荡处理，一方面可以消化去除材料中的细胞成分，另一方面可以防止由于长期酶作用而破坏软骨材料本身的Ⅱ型胶原网络结构，辅以震荡处理可以使该脱细胞方法变得可控，从而能更好的控制每一阶段下酶的活性。
本申请优选使用有机溶剂对脱细胞后的软骨材料进行脱脂处理包括：将脱细胞后的软骨材料置于有机溶剂中震荡脱脂3次，随后用纯化水进行洗涤；震荡脱脂包括：在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡2h。
本申请中的有机溶剂选自丙酮、异丙醇、甲醇、乙醇、正己烷、乙酸乙酯和石油醚中至少一种；进行脱脂处理后，随后用纯化水将软骨材料洗净。
本申请通过脱细胞与脱脂处理，去除软骨材料本身的致敏源，从而实现完整软骨脱细胞基质的制备。
本申请优选对灭活后的软骨材料进行冷冻干燥包括：将灭活后的软骨材料置于-20℃的冰箱中冷冻2h，随后置于真空冷冻干燥机中，于-64℃、10pa的条件下干燥处理24h。
该步骤中，需等待真空冷冻干燥机冷阱温度降至-60℃以下时，方能将灭活后的软骨材料放入干燥机进行干燥，防止灭活后的软骨材料提前融化。
相比于风干、烘干和真空加热干燥方法，通过冷冻干燥技术可以保证材料维持原本的状态，不至于发生皱缩，避免较大的冰晶破坏材料本身致密的纤维结构，同时能将孔隙结构完整的保存下来。
进一步的，本申请提供的软骨脱细胞基质的制备方法还包括：S10：采用环氧乙烷对软骨脱细胞基质进行灭菌，以便于得到可直接用于软骨组织的修复与软骨组织的替换及植入的软骨脱细胞基质。
本发明的另一目的在于提供一种软骨脱细胞基质，通过如上所述的软骨脱细胞基质的制备方法进行制备。
本发明提供的软骨脱细胞基质，结构完整，脱细胞彻底，无完整的细胞结构和细胞碎片残留、DNA残留和试剂残留，完整的保留了软骨材料本身优异的物理性能，同时完整的去除了材料内部会导致排异、过敏等反应的组织成分，能够维持良好的抗降解性能，可以很好的满足移植需求。
本申请采用胰酶酶处理脱细胞，Triton X-100、脱氧胆酸钠、CHAPS化学处理辅以高浓度盐溶液脱细胞的方法，从浅层至深层彻底的脱除软骨基质中的细胞成分，然后采用有机溶剂脱脂，冷冻干燥处理及灭菌的步骤，制得一种新型的软骨脱细胞基质；所得到的基质材料保留了软骨本身的高机械性能与弹性，略微增大、平衡了孔隙结构，保持了材料本身优异的可降解性能。适用于软骨损伤、鼻软骨、耳软骨类假体重建。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
实施例1
本实施例提供一种软骨脱细胞基质的制备方法，包括如下步骤：
S1：取猪肋软骨，使用手术刀去除软骨表面的肉，刮去肋软骨表面骨膜，获得洁白软骨材料，其表面无任何肉质残渣和微粉色的骨膜残留；使用纯化水对获得的软骨材料进行清洗，首先使用流水冲洗至软骨洁净，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速为200r条件下对软骨材料震荡清洗4次，每次30分钟，得到洁净软骨；
S2：使用质量浓度为1%的胰酶溶液对洁净软骨进行消化，在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡8h，得到软骨材料A；
S3：使用质量浓度为1%的 Triton X-100/乙醇溶液消化软骨材料A，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，震荡三次；前两次每次震荡时间震荡4h，第三次震荡时间14h，得到软骨材料B；
S4：使用质量浓度为1%的脱氧胆酸钠缓冲液处理软骨材料B，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，震荡4h，得到软骨材料C；
S5：使用质量浓度为4%的CHAPS缓冲液处理软骨材料C，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速160r条件下，震荡14h得到软骨材料D；
重复上述步骤S2~S5三次；
S6：使用纯化水对软骨材料D进行清洗，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡处理72h，其中每12h更换新鲜的纯化水，得到脱细胞后的软骨材料；
S7：将所获得的脱细胞后的软骨材料置于无水乙醇中，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡脱脂三次，每次震荡2h，随后用纯化水将材料洗净，得到脱脂后的软骨材料；
S8：将脱脂后的软骨材料浸泡在75%酒精中，室温下浸泡6h，每2h换一次新鲜的75%酒精溶液，随后纯化水将材料洗净，得到灭活后的软骨材料；
S9：将灭活后的软骨材料置于-20℃冰箱中冷冻2h，随后置于真空冷冻干燥机中，-64℃、10pa的条件下干燥处理24h；采用环氧乙烷灭菌后，得到软骨脱细胞基质。
本实施例以猪肋软骨为原材料，脂肪含量较高，骨质较软；通过脱细胞处理后材料维持了原本的机械、生物性能，同时DNA残留量少，软骨组织体未发生裂痕、断裂等现象；材料孔隙结构多且致密，材料表面光滑，冻干之前和复水之后均易于进行裁切等加工处理。
实施例2
本实施例提供一种软骨脱细胞基质的制备方法，包括如下步骤：
S1：取牛肋软骨，使用手术刀去除软骨表面的肉，刮去肋软骨表面骨膜，获得洁白软骨材料，其表面无任何肉质残渣和微粉色的骨膜残留；使用纯化水对获得的软骨材料进行清洗，首先使用流水冲洗至软骨洁净，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速为200r条件下对软骨材料震荡清洗4次，每次30分钟，得到洁净软骨；
S2：使用质量浓度为1%的胰酶溶液对洁净软骨进行消化，在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡12h，得到软骨材料A；
S3：使用质量浓度为1%的 Triton X-100/乙醇溶液消化软骨材料A，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，震荡三次；前两次每次震荡时间震荡4h，第三次震荡时间17h，得到软骨材料B；
S4：使用质量浓度为1%的脱氧胆酸钠缓冲液处理软骨材料B，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，震荡6h，得到软骨材料C；
S5：使用质量浓度为4%的CHAPS缓冲液处理软骨材料C，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速160r条件下，震荡17h得到软骨材料D；
重复上述步骤S2~S5三次；
S6：使用纯化水对软骨材料D进行清洗，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡处理72h，其中每12h更换新鲜的纯化水，得到脱细胞后的软骨材料；
S7：将所获得的脱细胞后的软骨材料置于无水乙醇中，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡脱脂三次，每次震荡2h，随后用纯化水将材料洗净，得到脱脂后的软骨材料；
S8：将脱脂后的软骨材料浸泡在1M 氢氧化钠中，室温下浸泡4h，每1h换一次新鲜的1M 氢氧化钠，随后纯化水将材料震荡清洗三次，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，每次震荡1h；
S9：将灭活后的软骨材料置于-20℃冰箱中冷冻2h，随后置于真空冷冻干燥机中，-64℃、10pa的条件下干燥处理24h；采用环氧乙烷灭菌后，得到软骨脱细胞基质。
本实例以牛肋软骨为原材料，脂肪含量低，筋膜组织较硬，骨质较硬;通过脱细胞处理后材料维持了原本的机械、生物性能，同时DNA残留量少，软骨组织体未发生裂痕、断裂等现象;材料孔隙结构多且致密，材料表面光滑，冻干之前和复水之后均易于进行裁切等加工处理。由于牛源性组织存在朊病毒风险，因此病毒灭活阶段采用1M NaOH溶液进行，可以在病毒灭活的同时更彻底的脱除残留的细胞成分。
对比例1
本对比例提供一种软骨脱细胞基质的制备方法，包括如下步骤：
S1：取牛肋软骨，使用手术刀去除软骨表面的肉，刮去肋软骨表面骨膜，获得洁白软骨材料，其表面无任何肉质残渣和微粉色的骨膜残留；使用纯化水对获得的软骨材料进行清洗，首先使用流水冲洗至软骨洁净，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速为200r条件下对软骨材料震荡清洗4次，每次30分钟，得到洁净软骨；
S2：使用质量浓度为1%的胰酶溶液对洁净软骨进行消化，在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡12h；于转速200r条件下，震荡六次；前两次每次震荡时间震荡4h，第三次震荡时间17h，第四次震荡6h，第五次震荡24h，再静置处理24h，第六次震荡处理24h，每阶段进行换液处理，得到软骨材料A；
重复上述步骤S2三次；
S3：使用纯化水对软骨材料A进行清洗，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡处理72h，其中每12h更换新鲜的纯化水，得到脱细胞后的软骨材料；
S4：将所获得的脱细胞后的软骨材料置于无水乙醇中，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡脱脂三次，每次震荡2h，随后用纯化水将材料洗净，得到脱脂后的软骨材料；
S5：将脱脂后的软骨材料浸泡在1M 氢氧化钠中，室温下浸泡4h，每1h换一次新鲜的1M 氢氧化钠，随后纯化水将材料震荡清洗三次，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，每次震荡1h；
S6：将灭活后的软骨材料置于-20℃冰箱中冷冻2h，随后置于真空冷冻干燥机中，-64℃、10pa的条件下干燥处理24h；采用环氧乙烷灭菌后，得到软骨脱细胞基质。
对比例2
本对比例提供一种软骨脱细胞基质的制备方法，包括如下步骤：
S1：取牛肋软骨，使用手术刀去除软骨表面的肉，刮去肋软骨表面骨膜，获得洁白软骨材料，其表面无任何肉质残渣和微粉色的骨膜残留；使用纯化水对获得的软骨材料进行清洗，首先使用流水冲洗至软骨洁净，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速为200r条件下对软骨材料震荡清洗4次，每次30分钟，得到洁净软骨；
S2：使用质量浓度为1%的 Triton X-100/乙醇溶液对洁净软骨进行消化，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡12h；于转速200r条件下，震荡六次；前两次每次震荡时间震荡4h，第三次震荡时间17h，第四次震荡6h，第五次震荡24h，再静置处理24h，第六次震荡处理24h，每阶段进行换液处理，得到软骨材料A；
重复上述步骤S2三次；
S3：使用纯化水对软骨材料A进行清洗，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡处理72h，其中每12h更换新鲜的纯化水，得到脱细胞后的软骨材料；
S4：将所获得的脱细胞后的软骨材料置于无水乙醇中，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡脱脂三次，每次震荡2h，随后用纯化水将材料洗净，得到脱脂后的软骨材料；
S5：将脱脂后的软骨材料浸泡在1M 氢氧化钠中，室温下浸泡4h，每1h换一次新鲜的1M 氢氧化钠，随后纯化水将材料震荡清洗三次，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，每次震荡1h；
S6：将灭活后的软骨材料置于-20℃冰箱中冷冻2h，随后置于真空冷冻干燥机中，-64℃、10pa的条件下干燥处理24h；采用环氧乙烷灭菌后，得到软骨脱细胞基质。
对比例3
本对比例提供一种软骨脱细胞基质的制备方法，包括如下步骤：
S1：取牛肋软骨，使用手术刀去除软骨表面的肉，刮去肋软骨表面骨膜，获得洁白软骨材料，其表面无任何肉质残渣和微粉色的骨膜残留；使用纯化水对获得的软骨材料进行清洗，首先使用流水冲洗至软骨洁净，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速为200r条件下对软骨材料震荡清洗4次，每次30分钟，得到洁净软骨；
S2：使用质量浓度为1%的胰酶溶液对洁净软骨进行消化，在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡12h，得到软骨材料A；
S3：使用质量浓度为1%的 Triton X-100/乙醇溶液消化软骨材料A，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，震荡六次；前两次每次震荡时间震荡4h，第三次震荡时间17h，第四次震荡6h，第五次震荡24h，再静置处理24h，第六次震荡处理24h，每阶段进行换液处理，得到软骨材料A；
重复上述步骤S2~S3三次；
S4：使用纯化水对软骨材料D进行清洗，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡处理72h，其中每12h更换新鲜的纯化水，得到脱细胞后的软骨材料；
S5：将所获得的脱细胞后的软骨材料置于无水乙醇中，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡脱脂三次，每次震荡2h，随后用纯化水将材料洗净，得到脱脂后的软骨材料；
S6：将脱脂后的软骨材料浸泡在1M 氢氧化钠中，室温下浸泡4h，每1h换一次新鲜的1M 氢氧化钠，随后纯化水将材料震荡清洗三次，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，每次震荡1h；
S7：将灭活后的软骨材料置于-20℃冰箱中冷冻2h，随后置于真空冷冻干燥机中，-64℃、10pa的条件下干燥处理24h；采用环氧乙烷灭菌后，得到软骨脱细胞基质。
对比例4
本对比例提供一种软骨脱细胞基质的制备方法，包括如下步骤：
S1：取牛肋软骨，使用手术刀去除软骨表面的肉，刮去肋软骨表面骨膜，获得洁白软骨材料，其表面无任何肉质残渣和微粉色的骨膜残留；使用纯化水对获得的软骨材料进行清洗，首先使用流水冲洗至软骨洁净，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速为200r条件下对软骨材料震荡清洗4次，每次30分钟，得到洁净软骨；
S2：使用质量浓度为1%的脱氧胆酸钠缓冲液对洁净软骨进行消化，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡12h；于转速200r条件下，震荡六次；前两次每次震荡时间震荡4h，第三次震荡时间17h，第四次震荡6h，第五次震荡24h，再静置处理24h，第六次震荡处理24h，每阶段进行换液处理，得到软骨材料A；
重复上述步骤S2三次；
S3：使用纯化水对软骨材料A进行清洗，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡处理72h，其中每12h更换新鲜的纯化水，得到脱细胞后的软骨材料；
S4：将所获得的脱细胞后的软骨材料置于无水乙醇中，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡脱脂三次，每次震荡2h，随后用纯化水将材料洗净，得到脱脂后的软骨材料；
S5：将脱脂后的软骨材料浸泡在1M 氢氧化钠中，室温下浸泡4h，每1h换一次新鲜的1M 氢氧化钠，随后纯化水将材料震荡清洗三次，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，每次震荡1h；
S6：将灭活后的软骨材料置于-20℃冰箱中冷冻2h，随后置于真空冷冻干燥机中，-64℃、10pa的条件下干燥处理24h；采用环氧乙烷灭菌后，得到软骨脱细胞基质。
对比例5
本对比例提供一种软骨脱细胞基质的制备方法，包括如下步骤：
S1：取牛肋软骨，使用手术刀去除软骨表面的肉，刮去肋软骨表面骨膜，获得洁白软骨材料，其表面无任何肉质残渣和微粉色的骨膜残留；使用纯化水对获得的软骨材料进行清洗，首先使用流水冲洗至软骨洁净，随后使用纯化水在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速为200r条件下对软骨材料震荡清洗4次，每次30分钟，得到洁净软骨；
S2：使用质量浓度为4%的CHAPS缓冲液对洁净软骨进行消化，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡12h；于转速200r条件下，震荡六次；前两次每次震荡时间震荡4h，第三次震荡时间17h，第四次震荡6h，第五次震荡24h，再静置处理24h，第六次震荡处理24h，每阶段进行换液处理，得到软骨材料A；
重复上述步骤S2三次；
S3：使用纯化水对软骨材料A进行清洗，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡处理72h，其中每12h更换新鲜的纯化水，得到脱细胞后的软骨材料；
S4：将所获得的脱细胞后的软骨材料置于无水乙醇中，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡脱脂三次，每次震荡2h，随后用纯化水将材料洗净，得到脱脂后的软骨材料；
S5：将脱脂后的软骨材料浸泡在1M 氢氧化钠中，室温下浸泡4h，每1h换一次新鲜的1M 氢氧化钠，随后纯化水将材料震荡清洗三次，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，每次震荡1h；
S6：将灭活后的软骨材料置于-20℃冰箱中冷冻2h，随后置于真空冷冻干燥机中，-64℃、10pa的条件下干燥处理24h；采用环氧乙烷灭菌后，得到软骨脱细胞基质。
对各实施例以及对比例制备的软骨脱细胞基质进行检测；参见图1所示，采用本发明制备方法制备的软骨脱细胞基质维持了软骨本身的形态，硬度、弹性也与处理前一致；参见图2所示，对比例1中胰酶长期处理后的材料明显发黄，硬度软，弹性也明显不足；因此，通过本申请提供的方法制备的软骨脱细胞基质有利于进行复水以及细胞和细胞外基质的进入，便于其重建材料内部的微环境。
参见图3所示，经本发明提供的制备方法制备的软骨脱细胞基质中，脱细胞效果明显优于各对比例中制备的软骨脱细胞基质的脱细胞效果，且本发明提供的制备方法制备的软骨脱细胞基质中，DNA残留值远低于安全植入限值，可以很安全的满足植入的需要。
参见图4所示，经本发明提供的制备方法制备的软骨脱细胞基质中，细胞活性明显优于各对比例中制备的软骨脱细胞基质的细胞活性，且本发明提供的制备方法制备的软骨脱细胞基质中，细胞活性高于安全植入限值，可以很安全的满足植入的需要。
参见图5所示，可看出通过本申请方法所获得的材料具有均匀致密的孔隙，很好的保留了软骨本身的Ⅱ型胶原蛋白的三维空间结构，这有助于细胞、细胞外基质等成分进入软骨组织内部并附着生长。而仅通过TritonX-100处理的样品孔隙数量明显少了很多，许多孔隙呈封闭状态。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种软骨脱细胞基质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：取哺乳动物的软骨，对所述软骨进行预处理，得到洁净软骨；
S2：使用酶类溶液对所述洁净软骨进行处理，打开所述洁净软骨表层的孔隙结构，得到软骨材料A；
S3：使用非离子型试剂对所述软骨材料A浅层的细胞成分进行去除，得到软骨材料B；所述非离子型试剂包括Triton X-100/乙醇溶液；
S4：使用离子型试剂对所述软骨材料B深层的细胞成分进行初步去除，得到软骨材料C；所述离子型试剂包括脱氧胆酸钠缓冲液；
S5：使用两性离子型试剂对所述软骨材料C深层的细胞成分进行二次去除，得到软骨材料D；所述两性离子型试剂为CHAPS缓冲液；
S6：使用纯化水对所述软骨材料D进行清洗，得到脱细胞后的软骨材料；
S7：使用有机溶剂对所述脱细胞后的软骨材料进行脱脂处理，得到脱脂后的软骨材料；
S8：对所述脱脂后的软骨材料进行病毒灭活，得到灭活后的软骨材料；
S9：对所述灭活后的软骨材料进行冷冻干燥，得到软骨脱细胞基质；
步骤S2中的所述酶类溶液包括胰酶溶液；使用酶类溶液对所述洁净软骨进行处理包括：使用质量浓度为1%的胰酶溶液对所述洁净软骨进行消化，在气浴恒温震荡箱中于37℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡8-12h。
2.如权利要求1所述的软骨脱细胞基质的制备方法，其特征在于，步骤S1中对所述软骨进行预处理包括：使用刀具去除所述软骨表面的肉及骨膜，再使用纯化水对所述软骨进行清洗。
3.如权利要求1所述的软骨脱细胞基质的制备方法，其特征在于，步骤S3中使用非离子型试剂对所述软骨材料A浅层的细胞成分进行去除包括：使用质量浓度为1%的 Triton X-100/乙醇溶液消化所述软骨材料A，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，震荡14-17h。
4.如权利要求1所述的软骨脱细胞基质的制备方法，其特征在于，步骤S4中使用离子型试剂对所述软骨材料B深层的细胞成分进行初步去除包括：使用质量浓度为1%的脱氧胆酸钠缓冲液处理所述软骨材料B，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速200r条件下，震荡4-6h。
5.如权利要求1所述的软骨脱细胞基质的制备方法，其特征在于，步骤S5中使用两性离子型试剂对所述软骨材料C深层的细胞成分进行二次去除包括：使用质量浓度为4%的CHAPS缓冲液处理所述软骨材料C，在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速160r条件下，震荡14-17h。
6.如权利要求1所述的软骨脱细胞基质的制备方法，其特征在于，使用有机溶剂对所述脱细胞后的软骨材料进行脱脂处理包括：将所述脱细胞后的软骨材料置于有机溶剂中震荡脱脂3次，随后用纯化水进行洗涤；所述震荡脱脂包括：在气浴恒温震荡箱中于25℃、料液比1：10、转速120r条件下，震荡2h。
7.如权利要求1所述的软骨脱细胞基质的制备方法，其特征在于，对所述灭活后的软骨材料进行冷冻干燥包括：将所述灭活后的软骨材料置于-20℃的冰箱中冷冻2h，随后置于真空冷冻干燥机中，于-64℃、10pa的条件下干燥处理24h。
8.如权利要求1~7任一项所述的软骨脱细胞基质的制备方法，其特征在于，还包括：S10：采用环氧乙烷对所述软骨脱细胞基质进行灭菌。
9.一种软骨脱细胞基质，其特征在于，通过如权利要求1~8任一项所述的软骨脱细胞基质的制备方法进行制备。
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