CN110960731A - 一种医用外科生物补片的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种医用外科生物补片的制备方法，包括：提取动物源材料进行预处理；将所述预处理后的动物源材料，用有机溶剂处理后，再用梯度酒精脱水，进行脱脂操作；将所述脱脂后的动物源材料进行反复冻融，进行脱细胞；将所述脱细胞后的动物源材料在酶的酸性溶液中浸泡，进行酶消化；将所述酶消化后的动物源材料在不同浓度的碱性溶液中进行碱处理；将碱处理后的动物源材料进行除垢和灭菌后得到医用外科补片。本发明提供一种医用外科生物补片的制备方法，得到的生物补片具备优良的生物力学性能和生物相容性，无免疫排异性，可诱导自身组织生长。

Description

一种医用外科生物补片的制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种医用外科生物补片的制备方法。
背景技术
生物补片是人类的再生系统，它不仅能修补宿主缺损的组织或器官还能引导内源性组织的再生。
在疝、腹壁及脑膜等外科领域，脱细胞、脱脂等免疫原性去除的生物补片，是目前最具再生医学特征的生物材料，其修复组织缺损的原理是“内源性诱导再生”，即吸引并调控宿主细胞在支架内生长和分化形成新的自身组织替换植入的材料从而完成对缺损的修复。在临床上，生物补片已应用于各种组织或器官的损伤修复，如：硬脑/脊膜缺损、心脏瓣膜、胸膜、疝气、血管、心包等的缺损修补。
为满足这些缺损组织或器官的修补需要，国内外已研发出多种不同类型的“外科补片”供应临床需求，但每种材料都存在各自的问题如生物力学性能，生物相容性，免疫排异，可诱导自身组织长入等问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种具备优良的生物力学性能和生物相容性，无免疫排异性，可诱导自身组织生长的一种生物外科补片的制备方法。
为解决以上技术问题，本发明的技术方案为采用一种医用外科生物补片的制备方法，包括：
提取动物源材料进行预处理；
将所述预处理后的动物源材料，用有机溶剂处理后，再用梯度酒精脱水，进行脱脂操作。
将所述脱脂后的动物源材料进行反复冻融，进行脱细胞；
将所述脱细胞后的动物源材料在酶的酸性溶液中浸泡，进行酶消化；
将所述酶消化后的动物源材料在不同浓度的碱性溶液中进行碱处理；
将碱处理后的动物源材料进行除垢和灭菌后得到医用外科补片。
优选的，所述动物源材料为动物源心包膜。
优选的，所述预处理具体为：
提取成年健康的动物的心包膜，裁剪并去除异物后盐洗去除血渍。
优选的，所述有机溶剂选自：氯仿、丙酮、无水乙醇中的一种或多种。
优选的，所述梯度酒精脱水具体为：
将经过有机溶剂处理后的动物源材料，分别在质量浓度为98％，60％和20％酒精中分别处理6、2和1小时。
优选的，所述脱细胞具体为：
将所述脱脂操作后的动物源材料在-80℃～-50℃下速冻4-8h，取出快速融化10-30min，放入高浓度盐溶液中震荡清洗0.5-1h，反复上述操作1～3次。
优选的，所述酶消化具体为：
将所述脱细胞后的动物源材料在0.5M的酶的醋酸溶液中酶解15-20h；所述动物源材料湿重与酶的重量比为1000：1。
优选的，所述在不同的碱性溶液中进行碱处理具体为：
将所述酶消化处理后的动物源材料，用0.1-0.3M的NaOH水溶液处理0.5-1h，用超纯水清洗至pH<12,再用pH为10-12的NaOH水溶液处理12-24h,超纯水清洗至中性。
优选的，所述除垢具体为：
将所述碱处理后的动物源材料，用高浓度盐中震荡清洗2-3h。用TritonX-100和脱氧胆酸钠溶液处理。
优选的，所述灭菌具体为：将所述除垢后的动物源材料，保存至生理盐水封装后，通过钴-60辐射灭菌。
与现有外科补片材料相比，本发明有显著优点和有益效果为：
本发明通过脱脂、脱细胞、酶处理等处理工艺，去除了心包补片中的免疫源性物质，并保留的心包材料的天然细胞外基质结构的三维结构具有较好的力学性能和生物学特性，免疫原性低，是一种良好的生物材料补片。采用有机物质脱脂后酒精梯度脱水处理组织，可去除不溶于水的有机物质的同时，使心包外基质的胶原纤维的结构不被破坏，这种脱细胞外基质具有优异的柔韧性、良好的生物相容性。采用胃蛋白酶消化处理蛋白后，采用一定浓度的碱处理可使酶失活还可进行微生物灭菌，同时在酸碱溶胀的过程中可有效的去除心包材料中细胞碎片、细胞基质中的蛋白、DNA片段等去除免疫原性。最后，使用高渗溶液、非离子洗涤剂TritonX-100和脱氧胆酸钠混合溶液进一步清理上诉过程中残留的DNA片段、杂蛋白细胞碎片等，进一步去除材料免疫原性，使心包材料中免疫原性物质彻底去除。
附图说明
图1实施例1～5制备的生物补片DAPI染色后的效果图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
还可以是木瓜蛋白酶，不过适用的pH要调整，
实施例一：
(1)取材和预处理：剪取成年健康的动物牛心包膜，立即投入4℃左右超纯水清洗3次，用手术工具去除表面脂肪和纤维，尽量避免接触污染物；裁取一定大小质地均匀无破损部位，放入10％NaCl溶液中震荡清洗1h，重复3次，再次放入超纯水清洗4次。
(2)脱脂：将上述脱脂后的心包材料加入氯仿：甲醇＝1:1混合液中，震荡脱脂3h,重复2次；梯度酒精脱水为98％，60％和20％酒精分别处理6、2和1小时，超纯水清洗4次。
(3)脱细胞：将上述脱脂后的心包材料铺平加入超纯水(超纯水覆盖上心包后即可)后放入-80℃冰箱速冻5h，取出置37℃水浴20min左右，放入3M NaCl溶液中震荡清洗1h，如此反复冻融2次，再次放入超纯水清洗4次。
(4)酶消化：将上述脱细胞后的心包0.5M的醋酸溶液(心包湿重：胃蛋白酶＝1000:1)20h，超纯水清洗至中性置，置入0.01M PBS溶液中缓冲6h。
(5)碱处理：将上述酶消化处理后的心包，用0.3M的NaOH溶液处理1h，用超纯水清洗至pH<9,加入0.01M NaOH处理16h,超纯水清洗至中性置0.01M PBS溶液中。
(6)除垢：将上述碱处理后的心包材料用3M NaCl+0.05M Tris-HCl震荡清洗2h，超纯水清洗4次。用0.25％的Triton X-100+0.25％的脱氧胆酸钠溶液(溶剂为10mM TrisHCl，5mM EDTA，pH 7.4)于4℃处理24h，放入超纯水清洗4次。
(7)包装灭菌处理：将上述除垢后的心包材料，保存至生理盐水封装钴-60辐射25kGy灭菌。
操作时均在无菌环境下操作，环境温度需在0-10℃条件下保存。
实施例二：
(1)取材和预处理：剪取成年健康的动物牛心包膜，立即投入4℃左右超纯水清洗3次，用手术工具去除表面脂肪和纤维，尽量避免接触污染物；裁取一定大小质地均匀无破损部位，放入4％NaCl溶液中震荡清洗1h，重复3次，再次放入超纯水清洗4次。
(2)脱脂：将上述脱脂后的心包材料加入氯仿：乙醇＝1:1混合液中，震荡脱脂4h,重复3次；梯度酒精脱水为90％，50％和30％酒精分别处理6、2和1小时，超纯水清洗4次。
(3)脱细胞：将上述脱脂后的心包材料铺平加入超纯水(超纯水覆盖上心包后即可)后放入-80℃冰箱速冻5h，取出置37℃水浴20min左右，放入3M NaCl溶液中震荡清洗1h，如此反复冻融2次，再次放入超纯水清洗4次。
(4)酶消化：将上述脱细胞后的心包0.5M的醋酸溶液(心包湿重：胃蛋白酶＝1000:1)20h，超纯水清洗至中性置，置入0.01M PBS溶液中缓冲6h。
(5)碱处理：将上述酶消化处理后的心包，用0.3M的NaOH溶液处理1h，用超纯水清洗至pH<9,加入0.01M NaOH处理16h,超纯水清洗至中性置0.01M PBS溶液中。
(6)除垢：将上述碱处理后的心包材料用3M NaCl+0.05M震荡清洗2h，超纯水清洗4次。用0.3-0.8％的Triton X-100于4℃震荡处理3h，重复2次，放入超纯水清洗4次，置生理盐水中暂存。
(7)包装灭菌处理：将上述除垢后的心包材料，保存至生理盐水封装钴-60辐射25kGy灭菌。
操作时均在无菌环境下操作，环境温度需在0-10℃条件下保存。
实施例三：
(1)取材和预处理：剪取成年健康的动物牛心包膜，立即投入4℃左右超纯水清洗3次，用手术工具去除表面脂肪和纤维，尽量避免接触污染物；裁取一定大小质地均匀无破损部位，放入4％NaCl溶液中震荡清洗1h，重复3次，再次放入超纯水清洗4次。
(2)脱脂：将上述脱脂后的心包材料加入氯仿：乙醇＝1:1混合液中，震荡脱脂4h,重复3次；梯度酒精脱水为90％，50％和30％酒精分别处理6、2和1小时，超纯水清洗4次。
(3)脱细胞：将上述脱脂后的心包材料铺平加入超纯水(超纯水覆盖上心包后即可)后放入-80℃冰箱速冻5h，取出置37℃水浴20min左右，放入3M NaCl溶液中震荡清洗1h后放入超纯水清洗4次。
(4)酶消化：将上述脱细胞后的心包0.5M的醋酸溶液(心包湿重：胃蛋白酶＝1000:1)20h，超纯水清洗至中性置，置入0.01M PBS溶液中缓冲6h。
(5)碱处理：将上述酶消化处理后的心包，用0.3M的NaOH溶液处理1h，用超纯水清洗至pH<9,加入0.01M NaOH处理16h,超纯水清洗至中性置0.01M PBS溶液中。
(6)除垢：将上述碱处理后的心包材料用3M NaCl+0.05M震荡清洗2h，超纯水清洗4次。用0.3-0.8％的Triton X-100于4℃震荡处理3h，重复2次，放入超纯水清洗4次，置生理盐水中暂存。
(7)包装灭菌处理：将上述除垢后的心包材料，保存至生理盐水封装钴-60辐射25kGy灭菌。
操作时均在无菌环境下操作，环境温度需在0-10℃条件下保存。
实施例四：
(1)取材和预处理：剪取成年健康的动物牛心包膜，立即投入4℃左右超纯水清洗3次，用手术工具去除表面脂肪和纤维，尽量避免接触污染物；裁取一定大小质地均匀无破损部位，放入4％NaCl溶液中震荡清洗1h，重复3次，再次放入超纯水清洗4次。
(2)脱脂：将上述脱脂后的心包材料加入氯仿：乙醇＝1:1混合液中，震荡脱脂4h,重复3次；梯度酒精脱水为90％，50％和30％酒精分别处理6、2和1小时，超纯水清洗4次。
(3)脱细胞：将上述脱脂后的心包材料铺平加入超纯水(超纯水覆盖上心包后即可)后放入-20℃冰箱速冻5h，取出后放入3M NaCl溶液中震荡清洗1h后放入超纯水清洗4次。
(4)酶消化：将上述脱细胞后的心包0.5M的醋酸溶液(心包湿重：胃蛋白酶＝1000:1)20h，超纯水清洗至中性置，置入0.01M PBS溶液中缓冲6h。
(5)碱处理：将上述酶消化处理后的心包，用0.3M的NaOH溶液处理1h，用超纯水清洗至pH<9,加入0.01M NaOH处理16h,超纯水清洗至中性置0.01M PBS溶液中。
(6)除垢：将上述碱处理后的心包材料用3M NaCl+0.05M震荡清洗2h，超纯水清洗4次。用0.3-0.8％的Triton X-100于4℃震荡处理3h，重复2次，放入超纯水清洗4次，置生理盐水中暂存。
(7)包装灭菌处理：将上述除垢后的心包材料，保存至生理盐水封装钴-60辐射25kGy灭菌。
操作时均在无菌环境下操作，环境温度需在0-10℃条件下保存。
实施例五：
(1)取材和预处理：剪取成年健康的动物牛心包膜，立即投入4℃左右超纯水清洗3次，用手术工具去除表面脂肪和纤维，尽量避免接触污染物；裁取一定大小质地均匀无破损部位，放入4％NaCl溶液中震荡清洗1h，重复3次，再次放入超纯水清洗4次。
(2)脱脂：将上述脱脂后的心包材料加入氯仿：乙醇＝1:1混合液中，震荡脱脂4h,重复3次；梯度酒精脱水为90％，50％和30％酒精分别处理6、2和1小时，超纯水清洗4次。
(3)脱细胞：将上述脱脂后的心包材料铺平加入超纯水(超纯水覆盖上心包后即可)后放入-20℃冰箱速冻5h，取出后放入1M NaCl溶液中震荡清洗2h后放入超纯水清洗5次。
(4)酶消化：将上述脱细胞后的心包0.5M的醋酸溶液(心包湿重：胃蛋白酶＝1000:1)20h，超纯水清洗至中性置，置入0.01M PBS溶液中缓冲6h。
(5)碱处理：将上述酶消化处理后的心包，用0.3M的NaOH溶液处理1h，用超纯水清洗至pH<9,加入0.01M NaOH处理16h,超纯水清洗至中性置0.01M PBS溶液中。
(6)除垢：将上述碱处理后的心包材料用3M NaCl+0.05M震荡清洗2h，超纯水清洗4次。用0.3-0.8％的Triton X-100于4℃震荡处理3h，重复2次，放入超纯水清洗4次，置生理盐水中暂存。
(7)包装灭菌处理：将上述除垢后的心包材料，保存至生理盐水封装钴-60辐射25kGy灭菌。
操作时均在无菌环境下操作，环境温度需在0-10℃条件下保存。
如图1所示，为了保证生物补片的生物活性和减少移植后的并发症，需要在制备生物补片过程中尽可能保证细胞脱除完全，实施例3，4，5减少了一些脱细胞过程，因此对比实施例1及实施例2通过DAPI染色后可以发现实施例3，4，5均残留大量细胞核，说明实施例3，4，5脱细胞不完全，内部残留大量未脱去细胞。说明实施例1和实施例2提供的方法制备的生物补片细胞残留少，效果更好。
另外，表1为现有市售的生物补片在使用过程中具有的缺点，通过和本发明对比，也说明本发明提供的生物补片具有一定的优势。
表1现有市售生物补片的缺点
Figure BDA0002315249280000081
Figure BDA0002315249280000091
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种医用外科生物补片的制备方法，其特征在于，包括：
提取动物源材料进行预处理；
将所述预处理后的动物源材料，用有机溶剂处理后，再用梯度酒精脱水，进行脱脂操作；
将所述脱脂后的动物源材料进行反复冻融，进行脱细胞；
将所述脱细胞后的动物源材料在酶的酸性溶液中浸泡，进行酶消化；
将所述酶消化后的动物源材料在不同浓度的碱性溶液中进行碱处理；
将碱处理后的动物源材料进行除垢和灭菌后得到医用外科补片。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述动物源材料为动物源心包膜。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述预处理具体为：
提取成年健康的动物的心包膜，裁剪并去除异物后盐洗去除血渍。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自：氯仿、丙酮、无水乙醇中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述梯度酒精脱水具体为：
将经过有机溶剂处理后的动物源材料，分别在质量浓度为98％，60％和20％酒精中分别处理6、2和1小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞具体为：
将所述脱脂操作后的动物源材料在-80℃～-50℃下速冻4-8h，取出快速融化10-30min，放入高浓度盐溶液中震荡清洗0.5-1h，反复上述操作1～3次。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶消化具体为：
将所述脱细胞后的动物源材料在0.5M的胃蛋白酶、的醋酸溶液中酶解15-20h；所述动物源材料湿重与酶的重量比为1000：1。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述在不同的碱性溶液中进行碱处理具体为：
将所述酶消化处理后的动物源材料，用0.1-0.3M的NaOH水溶液浸泡0.5-1h，用超纯水清洗至pH<12,再用pH为10-12的NaOH水溶液处理12-24h,超纯水清洗至中性。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述除垢具体为：
将所述碱处理后的动物源材料，用1M/L的盐溶液中中震荡清洗2-3h。用0.25％的TritonX-100和0.25％的脱氧胆酸钠溶液处理。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌具体为：将所述除垢后的动物源材料，保存至生理盐水封装后，使用25kGy钴-60辐射灭菌。
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