KR101410533B1 - 생체조직 유래 소재의 처리방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체조직 유래 소재의 탈세포 처리제, 이를 이용한 처리방법 및 이로부터 수득된 생체 재료에 관한 것으로, 생체조직 중 면역 및 이물반응 유발 물질인 세포, 유전자, 지방 및 바이러스와 엔도톡신을 효율적으로 제거 가능한 탈세포 처리제를 제공할 수 있으며, 이 같은 특정 탈세포 처리제로 처리함으로써 수득된 생체 재료가 생체적합성이 우수하고, 생체 이식에 적합한 강도를 가짐으로써 연조직 재건 및 조직수복 용도로 사용될 수 있다.

Description

생체조직 유래 소재의 처리방법 {A method for treating material derived from biological tissue}

본 발명은 생체조직 유래 소재의 처리방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생체조직 유래 소재 중 면역 및 이물반응 유발 물질인 세포, 유전자, 지방 및 바이러스와 엔도톡신을 효율적으로 제거 가능한 탈세포 처리제와, 상기 탈세포 처리제로 처리함으로써 결과적으로 생체적합성이 우수하고, 생체 이식에 적합한 강도를 갖는 생체 재료에 관한 것이다.

손상되거나 기능이 저하된 조직 또는 장기의 치료에 사용되는 생체 소재는 매우 다양하다. 그 중에서 조직유래 생체 소재는 생체 적합성이 뛰어나고 치료 및 재생 효과가 탁월하여 많은 연구가 진행되고 있다. 상기 조직유래 생체 소재는 동종 혹은 이종 조직에서 세포를 제거하는 다양한 방법을 통하여 얻어진다.

이때, 세포, 지방, 바이러스, 기타 이물질의 제거는 매우 중요하다. 종래 사용되는 세포 제거 법으로는 물리적, 화학적, 효소 처리법 등이 있으며, 이중 물리적 세포 제거 법은 급속 냉동, 가압, 초음파 처리 방법이 대표적이고 이 방법들은 가장 쉽게 세포를 제거할 수 있는 방법 중 하나이다.

또한 산, 알칼리 처리, 디터젼트(degergent), 삼투압을 이용한 화학적 처리 방법은 세포 제거 효율이 높아 가장 널리 사용되고 있는 세포 제거법이며, 효소를 이용한 세포 제거법은 트립신(trypsin)과 같은 단백질 분해 효소를 사용하여 세포막을 분해시키는 방법이다.

이 같은 종래의 세포 제거법은 오랜 기간 많은 연구를 통하여 안정적으로 세포를 제거할 수 있는 장점이 있다. 이에 반해, 지방 및 기타 이물질의 제거가 용이하지 않으며, 디터젼트와 효소처리 방법은 세포 제거 후 디터젼트 및 효소제거 공정에서 소요되는 비용과 시간이 긴 단점이 있고, 물리적 처리 방법은 세포 제거 효율과 염증 유발의 원인이 되는 지방의 제거가 떨어진다는 단점이 있다. 또한, 이들 종래의 세포 제거법에 따르면, 바이러스 불활화와 엔도톡신 불활화 공정을 후처리 하여야 하는 단점도 갖는다.

한편, 동종(allogenic), 또는 이종(xenogenic) 세포외 기질막은 공여 조직으로부터 진피, 인대, 소장, 심근막, 근막 등으로부터 채취하여 세포 제거 공정을 거쳐 제품으로 사용되고 있으며, 현재까지 진피조직, 소장점막하조직(SIS), 방광(UBM), 양막(HAM) 등이 제품화되어 판매되고 있다.

관련 종래 기술로서, 미국 특허 제5,397,353호에 제시된 돼지진피 유래 이식용 소재는 인간 또는 동물유래 조직을 트립신, 포스페이트, 소디움아자이드를 사용하여 세포, 글리코프로테인 등의 면역 유발 물질을 제거한 비분해성 이식제에 대한 것으로 처리 시간이 매우 길고, 바이러스 및 엔도톡신 불활화 공정이 포함되지 않은 것을 확인할 수 있다.

또한, 국내 등록특허 제10-0791502호에 제시된 바이러스 불활화된 무세포 인체 이식재 생산방법에 따르면, 데옥시콜릭산, SDS, 트린 80, 트리톤 x-100, 소디움 콜레이트 등의 계면활성제와 TNBP 용매를 사용하여 탈세포 및 바이러스 불활화를 처리 하는 것을 개시하고 있다.

현재의 혈장 유래 의약품은 열, 계면활성제, 필터, 크로마토그래피 등의 같은 공정을 통하여 바이러스를 제거하거나 불활화하고 있는 것으로, 이같은 방법은 액체 형태의 제품에는 효율적으로 적용할 수 있지만, 3차원 구조의 조직 유래 제품에서는 기존 방법으로 바이러스를 제거 및 불활화하기가 쉽지 않다.

대표적인 바이러스에는 돼지를 숙주로 하는 파보 바이러스(Parvoviruses), 가성광견병 바이러스(Pseudorabies viruses), 소를 숙주로 하는 소 바이러스성 설사 바이러스(BVDV), 소낭 구내염 바이러스, 인간을 숙주로 하는 인간 면역결핍 바이러스, A형 간염 등이 있다. 이러한 바이러스는 에탄올, 산 및 알칼리에 의해 불활화 될 수 있는데, ‘세포치료제 및 조직공학제제용 콜라겐의 바이러스 불활화 검증 시험법 확립’이라는 연구보고서에서는 70% 에탄올과 수산화나트륨, 산처리 각 공정별 BHV, BVDV, BPIV-3, BPV, 및 PPV 바이러스가 불활화 됨을 확인하였다.

엔도톡신(endotoxin, ET)은 단백질 및 인지질과 함께 그램-음성 박테리아의 외부세포막을 형성하는 리포다당체를 가리킨다. 엔도톡신은 상기 박테리아군에서만 발생하며 외부세포막의 조직, 안정성 및 장벽 기능에 있어서 중요한 역할을 한다. 다수의 박테리오파지는 숙주 박테리아를 찾는 특이법으로 엔도톡신이나 일반적인 리포다당체를 사용한다.

엔도톡신의 세 부위 중 인간과 동물의 면역체계를 자극시키는 부위는 리피드A(lipid A) 부위이다. 리피드 A는 세포나 기관에 직접 작용하지 않고 면역세포들을 자극하여 인체에 유해한 물질의 방출을 유도한다. 엔도톡신은 지구상 어디에나 존재하기 때문에 인간은 항상 내독소와 접촉하면서 생활하고 있고 대부분의 경우 큰 영향을 받지 않는다.

하지만 단백질 의약품의 경우 인슐린의 10 EU/㎎, 알파 인터페론의 경우 100 EU/㎎, 주사용수 0.25 EU/㎎. 세균배양으로 단백질을 만들어 내는 경우 ㎖당 백만 유닛 이상의 엔도톡신이 존재하므로 제거가 매우 중요하다.

일반적인 엔도톡신의 제거 방법으로는 200℃ 이상의 고온, 산 및 염기 처리, 미세투과법(ultrafilteration), 2상 분획법(two-phase extraction), 흡착법 등을 들 수 있지만, 조직 유래 제품은 단백질 제품이므로 200℃ 이상 고온으로 처리하기가 불가능하고, 3차원 구조로 인하여 미세투과법, 2상 분획법 및 흡착법의 적용 또한 어려운 실정이다. 이뿐 아니라, 강산 및 강염기도 단백질의 변성을 유발할 수 있어 적절한 농도 및 시간으로 처리하여야 하므로, 관련 연구가 계속 필요하다.

이에 본 발명자들은 종래보다 우수한 가공성과 물성을 얻기 위한 연구, 실험을 계속한 결과, 결손되거나 기능이 저하된 조직의 수복 및 재생에 사용될 생체 소재로서, 바이러스 불활화와 엔도톡신 불활화를 포함하여 세포 제거 효율과 지방 및 이물질 제거의 효율을 동시에 높인 기술을 완성하고 본 발명을 제공하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 목적은 생체조직 유래 소재 중 면역 및 이물반응 유발 물질인 세포, 유전자, 지방 및 바이러스와 엔도톡신을 효율적으로 제거 가능한 탈세포 처리제와, 상기 탈세포 처리제로 처리함으로써 결과적으로 생체적합성이 우수하고, 생체 이식에 적합한 강도를 갖는 생체 재료를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알칼리 및 극성 용매를 기반으로 하고, 생체조직 유래 소재 중 면역 및 이물반응 유발 물질인 세포, 유전자, 지방 및 바이러스와 엔도톡신을 효율적으로 제거 가능한 탈세포 처리제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 탈세포 처리제를 사용하여 생체조직 유래 소재를 처리하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득되며, 콜라겐과 엘라스틴을 주성분으로 포함하고, 10 ㎛ ~ 3 ㎜ 정도의 두께를 갖고, 0.01 ~ 20 MPa의 인장강도와 0.01 ~ 20 MPa의 봉합강도를 갖는 연조직 재건 및 조직수복용 생체 소재를 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

본 발명은 알칼리 및 극성 용매를 기반으로 하고, 생체조직 유래 소재 중 면역 및 이물반응 유발 물질인 세포, 유전자, 지방 및 바이러스와 엔도톡신을 효율적으로 제거 가능한 탈세포 처리제를 제공하는데 기술적 특징을 갖는다.

이때 알칼리로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 및 암모니아 중에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하고, 수산화나트륨을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 알칼리의 농도는 0.01 M ~ 1 M인 것이 바람직하고, 0.4 M ~ 0.6 M인 것이 반응의 효율성을 고려할 때 보다 바람직하다.

한편, 상기 극성 용매로는 이에 한정하는 것은 아니나, 메탄올, 이소프로판올, 에탄올 등 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올류를 사용하는 것이 바람직하고, 에탄올을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 극성용매의 농도는 10 ~ 100%인 것이 바람직하고, 50 ~ 80%인 것이 반응의 효율성을 고려할 때 보다 바람직하다. 또한, 상기 알칼리는 극성 용매에 0.01 ~ 1 M 농도로 배합하는 것이 가장 바람직하다.

이 같은 탈세포 처리제는 극성 용매로 전처리한 다음 사용되는 것이 바람직한 것으로, 극성 용매로 일차적으로 지방을 제거하고, 바이러스와 엔도톡신을 불활화된 상태에서 탈세포 처리제가 이차적으로 지방을 제거하고, 바이러스와 엔도톡신을 불활화시킬 수 있기 때문이다.

참고로, 본원 발명에서 제공하는 탈세포 처리제의 반응 메카니즘에 대하여 살펴보면 다음과 같다.

우선, 생체조직을 NaOH로 처리하면 조직에 존재하는 지방과 NaOH가 반응하여 다음과 같은 비누화 반응이 일어난다: RCOO-R + NaOH -> RCOO-Na + R-OH

이 같은 비누화 반응 하에 에탄올 등의 극성 용매가 존재하면 반응속도를 더욱 증가시켜 비누가 뭉치는 현상 및 지방 제거 효과가 더욱 촉진된다.

즉, 본 발명에 따르면, 종래에 별도로 사용하던 디터젼트를 사용하는 것과 동일한 효과를 얻을 수 있다.

이 같은 탈세포 처리제는 생체 조직에 12 시간 내지 48 시간 동안 처리하는 것이 바람직한 것으로, 12 시간 미만 처리 시에는 지방 제거 효율이 미흡하며, 48 시간 초과 처리시에는 증가한 처리시간 대비 제거 효율이 크게 개선되지 않기 때문이다.

또한, 본 발명에서는 상술한 탈세포 처리제를 사용하여 생체조직 유래 소재를 처리하는 방법을 제공할 수 있다. 이때 생체 조직이란 이에 한정하는 것은 아니나, 돼지, 소, 말 등 인간을 제외한 동물의 뼈, 연골, 치아 등의 경조직, 혹은 혈관, 심근막, 소장점막하조직, 양막, 경막, 피부, 인대 등의 연 조직을 포함하는 의미이다.

구체적으로는, 생체 조직(피부조직)으로부터 진피층을 물리적으로 분리한 다음(제1 단계), 분리한 진피층을 극성 용매를 사용하여 전처리하고(제2 단계), 이어서 상술한 탈세포 처리제를 사용하여 탈세포 처리한 다음(제3 단계) 세척 후 산을 이용하여 pH를 조절하는 총 4단계로 이루어질 수 있다.

이중 제1 단계로서, 생체 조직으로부터 진피층을 물리적으로 분리하는 단계는 수술용 칼, 수술용 가위, 지방제거 탈피기 혹은 피부절제기(제품명 DERMATOME) 등을 이용하여 지방과 진피층을 분리하여 수행할 수 있다. 이중 피부절제기를 사용하여 표피층으로부터 진피층을 두께 100 ㎛ ~ 2 ㎜ 까지 분리해내는 것이 지방층을 제거시키고 최종 제품의 두께를 고려하여 보다 바람직하다.

이어서 제2 단계로서, 분리한 진피층을 극성 용매를 사용하여 전처리하는 단계는 분리한 진피층을 극성용매를 사용하여 세균 및 기타 이물질을 제거하면서, 지방을 제거하고, 더불어 바이러스와 엔도톡신을 1차 불활화 하는 단계로서 제공된다.

이때 사용가능한 극성용매는 메탄올, 이소프로판올, 에탄올 등 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올류 중에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하고, 에탄올을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 극성용매의 농도는 10 ~ 100%인 것이 바람직하고, 50 ~ 80%인 것이 반응의 효율성을 고려할 때 보다 바람직하다.

이때 처리 시간은 이에 한정하는 것은 아니나, 12 내지 48 시간 동안 처리하는 것이 바람직한 것으로, 12 시간 미만 처리시에는 지방 제거, 탈세포 및 바이러스 불활화 효율이 미흡하며, 48 시간 초과 처리 시에는 처리시간 대비 효율이 크게 개선되지 않기 때문이다.

그런 다음 제3 단계로서, 탈세포 처리제에 의해 탈세포 처리하는 단계는 상술한 극성용매, 및 알칼리 중 1종 이상의 용액, 보다 바람직하게는 극성용매와 알칼리 혼합 용액에 처리하여 지방 제거 및 바이러스와 엔도톡신을 2차 불활화하는 단계로서 제공된다.

이때 극성 용매로는 앞서 살펴본 바와 같이, 메탄올, 이소프로판올, 에탄올 등의 알코올류 중에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하고, 에탄올을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 극성용매의 농도는 10 ~ 100%인 것이 바람직하고, 50 ~ 80%인 것이 반응의 효율성을 고려할 때 보다 바람직하다.

또한, 알칼리로는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘, 및 암모니아 중에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하고, 수산화나트륨을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 알칼리의 농도는 0.01 M ~ 1 M인 것이 바람직하고, 0.4 M ~ 0.6 M인 것이 반응의 효율성을 고려할 때 보다 바람직하다.

특히, 상기 극성용매와 알칼리의 혼합 용액은 에탄올 50 ~ 80%와 수산화나트륨 0.4 M ~ 0.6 M을 배합하여 사용될 수 있다.

마지막으로, 제4 단계로서, 세척 후 산을 이용하여 pH를 조절하는 단계는세척 후 산처리를 통하여 알칼리를 중화함과 더불어, 바이러스를 3차 불활화 하는 단계로서 제공된다.

이때 산으로는 염산, 황산, 퍼아세트산, 아세트산 등에서 선택된 1종 이상을 사용하여 pH를 2 내지 10으로 조절할 수 있고, 염산, 아세트산에서 선택된 1종 이상을 사용하여 pH를 2 내지 6으로 조절하는 것이 보다 바람직하다.

상기 산처리 공정을 포함하여 제2 단계 내지 제4 단계는 각각 0 ~ 37 ℃ 범위 내에서 물리적 교반을 이용하여 처리할 수 있다.

이 같은 처리를 통하여 수득된 생체 재료는 하기 실시예에서 규명된 바와 같이, 콜라겐과 엘라스틴을 주 구성 성분으로 갖고 있으며, 10 ㎛ ~ 3 ㎜ 정도의 두께를 갖고, 0.01 ~ 20 MPa의 인장강도와 봉합강도를 가지며, 생체적합성이 우수하고, 세포 친화적인데다 면역적합성 또한 우수하다.

본 발명에 의해 수득된 생체 재료는 이에 한정하는 것은 아니나, 탈장 치료용 생체막, 피부 재생용, 연골 재생용, 경막 재생용, 성형 보형용, 내부 장기 및 연조직 재생용 등과 같은 연조직 재건용도 혹은 조직 수복 용도의 이식재로 사용될 수 있으며, 세포 또는 성장인자 등의 전달체로서 사용될 수도 있다.

본 발명에 따르면, 생체조직 유래 소재를 제작함에 있어 극성용매와 산, 알칼리 처리 공정을 통하여 세포, 지방, 바이러스, 엔도톡신 등을 안정적으로 제거할 수 있고, 제거 공정이 매우 간단하여 처리 시간과 비용을 감소시킬 수 있으며, 역반응과 섬유화 반응을 유발하는 세포, 유전자 및 지방을 제거하여 생체적합성 및 조직재생능이 우수한 생체 소재를 제공할 수 있는 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명에 따라 제조된 실시예 1의 생체 재료의 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 생체 재료의 헤마톡실린/에오신(hematoxylin/eosin)으로 염색한 조직 이미지 사진으로, 돼지 진피층 원료와 대비한 결과이다. (A) 탈세포 전 원자재, (B) 실시예 1에세 제작된 생체 재료, (C) 비교예 1에서 제작된 생체 재료, (D) 비교예 2에서 제작된 생체 재료)
도 3은 타사 제품인 Permacol (TLS, USA, Surgical Implant, Porcine dermis) 과 본 발명에 따라 제조된 실시예 1, 비교예 1, 2의 생체 재료의 DNA 정량값을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 생체 재료의 표면(A, ×100)과 단면(B, ×100)의 주사전자현미경(SEM) 사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 생체 재료(실시예1, 비교예1, 비교예2)간 인장강도 측정 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 생체 재료의 조지방 정량값을 나타낸 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 생체 재료의 전기영동(SDS-PAGE) 분석 결과를 도시한 사진으로, A,B는 타입 Ⅰ 콜라겐의 결과에 해당하고, C는 실시예 1에서 제작된 생체 재료에 해당한다.
도 8은 본 발명에 따른 생체 재료의 세포독성 평가 결과로, 양성 대조군, 음성 대조군, 배지 대조군 및 실시예 1에서 제작된 생체 재료의 세포독성을 분석한 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다. 즉, 이하 실시예에서는 돼지 피부를 예로 들었으나, 다른 생체 피부, 조직을 이용하여 제조하는 것 또한 본 발명에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<제조예 1> 탈세포 처리제 제조1

70% 에탄올에 수산화나트륨 0.5M 농도로 혼합하여 제조한다. 70% 에탄올 1L에수산화나트륨 20 g을 넣고 완전히 용해될 때 까지 교반하여 1L의 혼합 용액을 제조하였다.

<제조예２>　디터젼트 제조

디터젼트로서 탈세포 공정에서 일반적으로 사용되는 Triton-X100을 1%의 농도로 준비하였다. 정제수 1L 에 Triton-X100을 10g을 넣고 혼합하여 1%의 Triton-X100 1 L를 준비하였다.

<제조예 3> 탈세포 처리제 제조2

0.5 M 수산화나트륨을 정제수에 녹여 용액으로 준비하였다.

<실시예 1>

<진피층 분리단계(제1 단계)>

도살장 및 SPF 등급의 시설에서 사육한 돼지의 피부를 준비하고, 제모기와 소디움 설파이드 용액을 사용하여 제모하였다. 제모된 피부에 탈포기를 사용하여 지방을 1차로 제거하였으며, 수술용 칼을 사용하여 7 × 15 ㎠ 사이즈로 절개한 다음 피부절제기(제품명 DERMATOME)를 사용하여 표피층에서 진피층까지의 조직을 2 ㎜ 정도의 두께로 채취하였다.

<극성 용매 전처리 단계(제2 단계)>

상기 제1 단계에서 채취한 진피층을 정제수로 깨끗이 세척한 후, 반응기에 넣고 진피층 무게 대비 20배의 70% 에탄올, 진피 100g에 70% 에탄올 2 L를 넣고 100 rpm 하에 24시간 동안 교반하였다.

<탈세포 처리제로 처리하는 단계(제3 단계)>

전처리 후 정제수 2 L 로 30분간 3회 세척 후 제조예 1에서 준비한 탈세포 처리제를 진피층 무게 대비 20배의 비율, 진피 100g에 탈세포 처리제 2 L를 투입하고 100 rpm 하에 24시간 동안 교반하였다.

<후처리 단계(제4 단계)>

탈세포 처리 후 정제수로 3회 세척 후 염산 혹은 아세트산을 사용하여 pH 3으로 조절한 정제수를 넣고 4 ℃ 온도에서 24 시간동안 100 rpm하에 교반하였다. 마지막으로 정제수로 3회 세척하여 생체 재료로서 4 ℃ 온도에 보관하였다.

<비교예 1>

<진피층 분리단계(제1 단계)>

실시예 1과 동일하게 진행하였다.

<극성 용매 전처리 단계(제2 단계)>

실시예 1과 동일하게 진행하였다.

< 탈세포 처리제로 처리하는 단계(제3 단계)>

극성 용매 전처리 후 정제수 2 L 로 30분간 3회 세척 후 제조예 2에서 준비한 디터전트 처리제를 진피층 무게 대비 20배의 비율, 진피 100g에 탈세포 처리제 2 L를 투입하고 100 rpm 하에 24시간 동안 교반하였다.

<후처리 단계(제4 단계)>

실시예 1과 동일하게 진행하였다.

< 비교예 2>

<진피층 분리단계(제1 단계)>

실시예 1과 동일하게 진행하였다.

<극성 용매 전처리 단계(제2 단계)>

실시예 1과 동일하게 진행하였다.

< 탈세포 처리제로 처리하는 단계(제3 단계)>

극성 용매 전처리 후 정제수 2 L 로 30분간 3회 세척 후 제조예 3에서 준비한 탈세포 처리제를 진피층 무게 대비 20배의 비율, 진피 100g에 탈세포 처리제 2 L를 투입하고 100 rpm 하에 24시간 동안 교반하였다.

<후처리 단계(제4 단계)>

실시예 1과 동일하게 진행하였다.

<시험 항목>

1. 생체 재료의 탈세포 분석

앞서 실시예 1에서 수득된 생체 재료의 세포 및 유전자 제거 효과를 분석하였다. 더불어, 비교예 1, 2에서 제작된 생체 재료의 분석도 함께 진행하였다. 구체적으로는, 생체 재료를 4% 포르말린 용액으로 24시간 동안 고정하고, 파라핀을 침투시키고, 포매하여 절편을 제작하였다. 이렇게 제작된 절편을 헤마톡실린/에오신(hematoxylin & eosin, H&E)으로 염색하여 조직을 관찰하였다.

현미경을 이용하여 조직을 분석한 결과를 도 2에 나타내었다. 초기 돼지 피부 원료에서는 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)에 세포와 세포핵이 관찰되지만, 실시예 1에서 제조된 생체 재료에서는 세포와 세포핵이 전혀 관찰되지 않았다. 비교예 1, 2에서 제작된 생체 재료에서는 세포와 세포핵의 잔해가 관찰되어 완벽한 탈세포가 진행되지 않았음을 확인할 수 있었다.

또한, 생체 재료 내 DNA 함량을 피코그린 DNA 정량법을 사용하여 정량하였다. 그 결과, 도 3의 그래프에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1에서 제작된 생체 재료의 경우 P제품과 유사한 DNA 함량을 나타냈으나, 비교예 1, 2에서 제작된 생체 재료에서는 DNA 함량이 실시예 1에서 제작된 생체 재료에서 보다 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다.

2. 생체 재료의 물리화학적 분석

<2-1: 미세구조 분석>

주사전자현미경(scanning electron microscope)을 이용하여 조직유래 생체소재의 미세구조를 분석하고 도 4에 나타내었다. 그 결과, 실시예 1에서 제조한 조직유래 생체소재를 동결건조한 후 주사전자현미경 (JEOL, JSM-6380, 일본; 20KV)으로 표면과 단면을 촬영한 결과 100 ㎛ 내외의 다공을 모두 관찰할 수 있었다.

<2-2: 인장강도 분석>

만능물성측정기(Universal Testing Machine, 3366, Instron)을 이용하여 조직유래 생체소재의 인장강도를 측정하고 도 5에 나타내었다.

구체적으로는 실시예 1과 비교예 1, 2에서 제조한 생체 재료를 50 mm × 10 ㎜ 크기로 절단한 후 PBS에 24시간 수화시킨 후 인장 강도를 측정하였다. 수화된 시편의 단면적을 측정한 후 로드셀에 연결된 지그에 장착하고 20 ㎜/min의 속도로 잡아당겨 파손될 때의 최대 인장 강도와 변형률을 측정하였다. 측정된 최대 인장 강도를 단위 면적당 강도로 계산한 최대 인장 응력으로 비교를 진행하였다.

측정 결과, 실시예 1에서 제작된 생체 재료의 최대 인장 응력과 비교예 1, 2에서 제작된 생체 재료의 최대 인장 응력에서 유사한 차이를 확인할 수 없었다. 또한, 최대 인장 변형률에서도 실시예 1과 비교예 1, 2에서 제작된 생체 재료간 유사한 차이는 확인할 수 없었다.

<2-3 : 조지방 정량>

Soxhlet 추출법을 이용하여 본 발명에서 제작된 생체 재료의 조지방을 정량하여 도 6에 나타내었다.

구체적으로 본 특허에서 제작된 실시예 1, 비교예 1, 비교예 2의 생체 재료를 준비한 뒤, 2~3g 사이의 시편을 정확하게 무게를 측량한 뒤 원통 여지에 넣는다. Soxhlet 추출장치 중 수기의 항량을 정확하게 측정하고 에테르를 이용하여 조지방을 추출한 뒤 조지방이 들어있는 수기의 항량을 정확하게 측정하여 각각의 시편의 조지방 함량을 확인하였다.

측정 결과, 실시예 1에서 제작된 생체 재료의 조지방 함량이 비교예 1, 2의 생체 재료보다 낮게 나타난 것을 확인할 수 있었다.

<2-4: 전기영동법(SDS-PAGE) 분석>

전기 영동법을 이용하여 생체 재료의 주성분에 대한 분석을 진행하고 결과를 도 7에 정리하였다.

구체적으로는 실시예 1의 실험 초기 돼지 진피 원료를 아세트산과 펩신을 이용하여 용해시킨 뒤 분석에 사용하였다. 8% 아크릴아마이드 겔을 제작하고 여기에 준비된 시험액을 적용하여 전기영동을 하여 결과를 확인하였다.

전기영동법 분석 결과, 전기영동 결과 대조군으로 사용된 제 1형 콜라겐과 유사한 α1, α2 및 β 밴드를 확인할 수 있어 주성분이 제 1형 콜라겐임을 확인할 수 있었다.

3. 세포독성 분석

상기 실시예 1, 비교예 1과 2에서 수득된 생체 재료의 생물학적 안전성을 확인하기 위하여 ISO 10993-5를 근거로 세포 독성 시험을 실시하였다. 구체적으로는 세포주(cell lines)로서 American Type Culture Collection CCL1(NCTC clone 929)를 배양액 (DMEM + 10%FBS +1% 페니실린-스트렙토마이신)으로 배양하였다. ISO 10993-12를 근거로 실시예 1, 비교예 1과 2에서 수득된 생체 재료를 37도에서 24시간 동안 용출하였으며 이를 이용하여 세포 독성 평가를 진행하였다.

용출물의 세포독성에 대한 정량적 측정법으로 MTT cytotoxicity test를 사용하였다. 본 발명에서 제작된 생체 재료에 대한 세포 독성 결과는 도 8에 나타내었다. 본 발명에서 제작된 생체 재료의 용출물을 첨가한 실험군과 음성 대조군, 배지 대조군을 각각 비교하였을 때 실험군에 대한 세포 독성은 없는 것으로 확인함과 동시에 세포의 생장에 도움이 되는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 비교예 1과 2에서 제작된 생체 재료에서는 대조군 대비 90% 이하의 세포 생장률을 나타냄을 확인할 수 있었다.

4. 엔도톡신 분석

실시예 1에서 수득한 생체 재료를 엔도톡신 프리 워터 (Enodotoxin free water)에 37℃하에 1시간동안 용출시킨 후 시험법의 정밀도 및 유효성을 보증하기 위해 예비 실험과 반응간섭인자 실험을 실시 한 후 용출액에 라이세이트 시약을 첨가하여 미리 설정한 탁도에 도달하는 시간을 계산하여 엔도톡신의 양을 정량화하고 표 1에 정리하였다.

상기 표에서 보듯이, 본 발명의 실시예 1에서 제작된 생체 재료의 엔도톡신 수치는 0.1EU/device 이하였으나 비교예 1과 2에서 제작된 생체 재료의 엔도톡신 수치는 실시예 1에서 제작된 생체 재료보다 높게 측정되는 것을 확인할 수 있었다.

이상의 실시예 1과 비교예 1 내지 2의 결과를 대비한 결과, 이물질 함량 (조지방, 세포 잔해)이 낮고 탈세포 효율 우수하며 세포 독성, 엔도톡신 안전성이 우수함과 더불어, 물리적 특성은 유사한 점으로부터, 첫째, 조직학적 분석과 화학적 분석 결과를 토대로 확인된 바, 비교예의 생체 재료에 비해 탈세포 효율이 우수하며, 염증 반응을 유발시키는 원인이 되는 지방의 함량이 낮은 것으로 확인되었고, 둘째, 세포 독성과 엔도톡신에 대한 안전성도 우수한 것으로 확인되었으며, 셋째, 물리적 특성(인장강도, 봉합강도)이 유사한 것을 규명할 수 있었다.

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6. 피부, 심근막, 뼈, 연골, 소장점막하조직, 양막 및 연조직 중 선택된 생체 조직(인간 제외)의 표피층으로부터 진피층을 물리적으로 분리하는 제1 단계;
   분리한 진피층을 탄소수 1 내지 4의 알코올 중에서 1종 이상 선택되고, 10 ~ 100% 농도인 극성 용매를 사용하여 전처리하는 제2 단계;
   상기 전처리물을 에탄올 50 ~ 80%와 수산화나트륨 0.4 M ~ 0.6 M을 배합한 탈세포 처리제를 사용하여 처리하는 제3 단계; 및
   탈세포 처리물을 세척 후 산을 이용하여 pH를 조절하는 제4 단계; 로 이루어지는 것을 특징으로 하는 생체 조직 유래 소재의 처리 방법.
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8. 제6항에 있어서,
   상기 제1 단계를 통하여 표피층으로부터 진피층을 두께 100 ㎛ ~ 2 ㎜ 까지 분리하는 것을 특징으로 하는 생체 조직 유래 소재의 처리 방법.
   
9. 제6항에 있어서,
   상기 제2 단계는, 상기 극성 용매를 사용하여 1시간에서 72 시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 생체 조직 유래 소재의 처리 방법.
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11. 제6항에 있어서,
    상기 제4 단계에서 산으로는 염산, 황산, 퍼아세트산, 및 아세트산 중에서 선택된 1종 이상을 사용하여 pH 2~10으로 조절하는 것을 특징으로 하는 생체 조직 유래 소재의 처리 방법.
12. 제6항에 있어서,
    상기 제2 내지 제4 단계는 0 ~ 37 ℃ 온도 하에 물리적 교반하여 수행되는 것을 특징으로 하는 생체 조직 유래 소재의 처리 방법.
    
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