WO2022173066A1 - 유방재건용 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법 - Google Patents

유방재건용 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법 Download PDF

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free skin
dermis
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김기민
김상열
신광훈
이현승
김형구
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Definitions

  • the present invention relates to a cell-free skin substitute for breast reconstruction and a method for manufacturing the same.
  • Acellular Dermal Matrix is a dermal matrix obtained through acellularization technology from human or animal skin, and is a bio-derived skin substitute in the form of an Extracellular Matrix (ECM) composed of pure collagen and elastin.
  • ECM Extracellular Matrix
  • the process of obtaining acellular dermis is known as two major steps.
  • the first step is to remove the epidermal layer from the prepared skin tissue, and the ionic strength of the proteolytic enzyme or solution is changed to separate the epidermal layer and the dermal layer of the skin.
  • Step 2 is a step of removing the cells of the dermal layer after the epidermal layer separation of step 1.
  • the immune response is mainly caused by membrane proteins present in the cell membrane, and removal of the cells can minimize the immune response.
  • the above step uses a method of selectively removing only cells without tissue damage by using the difference in physicochemical properties between the cells and the extracellular matrix.
  • the main component of the cell membrane is phospholipids, and by using various surfactants or enzymes, cells can be removed without damaging the tissue.
  • the processed acellular dermis is cut by the medical staff to fit the size of the implant to be inserted into the patient in the breast reconstruction operating room.
  • the medical staff wraps the implant to be applied to the patient with the acellular dermis, and during the wrapping process, the overlapping parts of the dermis and the excess spare part are removed.
  • the medical staff spends a lot of time cutting and cutting the acellular dermis to fit the implant, the operation time is prolonged and a lot of the acellular dermis is not used by the patient and is thrown away. Accordingly, the operation cost increases and the consumption of limited resources increases.
  • the present invention it is an object of the present invention to provide a method of removing the epidermal layer and cells from the donated skin at once without sequentially proceeding, and removing the epidermal layer and cells by base treatment without using an enzyme or surfactant.
  • the acellular skin substitute is manufactured in an appropriate design and size to reduce the operation time and to use the donated and processed acellular skin substitute. We want to provide you with a way to save money.
  • the acellular skin substitute is accurately covered with the breast reconstruction implant to be inserted into the patient, serousoma caused by the occurrence of dead space is reduced, thereby minimizing the side effects of surgery. .
  • An object of the present invention is to provide a method of manufacturing a cell-free skin substitute having a shape and size optimized for breast reconstruction surgery.
  • the present invention obtains a cell-free skin substitute through the epidermal layer separation and cell-free process excluding the use of surfactants and enzymes, and wraps the implant for breast reconstruction without cutting and cutting the cell-free skin substitute in breast reconstruction surgery. It aims to provide a number design and form.
  • the present invention is a circular base portion
  • a plurality of slits are formed in at least one of the base part and the protrusion part radially along the circumferential direction of the base part with respect to the center point of the base part,
  • the slit has a starting point and an endpoint
  • An angle between the first virtual line extending from the center point of the base part to the center point of the slit and the second virtual line connecting the starting point and the end point of the slit is 60 to 120°.
  • the present invention comprises the steps of placing the acellularized dermis on a cooling plate maintained at -30 to 0 °C;
  • It provides a method for producing a cell-free skin substitute comprising the step of cutting the acellularized dermis in the frozen state with a cutting device.
  • the present invention comprises the steps of preparing an acellularized dermis by removing the epidermal layer and cells from the skin tissue;
  • the form of the acellularized dermis set through the design program includes a circular base
  • a plurality of slits are formed in at least one of the base part and the protrusion part radially along the circumferential direction of the base part with respect to the center point of the base part,
  • the slit has a starting point and an endpoint
  • the angle between the first virtual line extending from the center point of the base part to the center point of the slit and the second virtual line connecting the starting point and the end point of the slit is 60 to 120°.
  • a cell-free skin substitute can be prepared through the epidermal layer removal and cell-free process excluding the use of proteolytic enzymes and surfactants.
  • the cell-free skin substitute is cut through a design program to the appropriate size and shape to wrap the breast reconstruction implant and then cut and used with a CNC machine. seroma) may be reduced. This can reduce the side effects of surgery.
  • the cell-free skin substitute according to the present invention can act as a scaffold after implantation in the body, and act as a physiological space in which the transplanted cells can move and grow.
  • the cell-free skin substitute since the cell-free skin substitute becomes a transplant recipient's tissue over time due to angiogenesis, it can be used as a skin substitute for repair and plastic surgery of damaged tissue.
  • FIG. 1 shows the form of a cell-free skin substitute according to an example of the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of observation with an optical microscope and a fluorescence microscope after immunohistochemical staining and DAPI staining of the epidermis and cell nuclei, respectively, in order to confirm that the epidermis and cells are removed from the skin tissue after the decellularization solution treatment.
  • FIG. 5 shows a technical illustration of breast reconstruction by wrapping a cell-free skin substitute having a design and shape developed through the present invention in an implant for breast reconstruction.
  • FIG. 6 shows a CAD drawing expressing the shape of a cell-free skin substitute that can wrap and suture a breast reconstruction implant.
  • FIG. 7 is a photograph showing a cooling plate manufactured to maintain the cell-free skin substitute at -20°C.
  • Fig. 8 shows the result of pouring water to reach the acellularized dermal thickness on the cooling plate and then freezing the same as the acellularized skin substitute in order to fix the acellularized skin substitute placed on the cooling plate so that it does not move during the operation of the CNC machine.
  • FIG. 9 is a photograph showing the process of cutting the acellularized skin substitute according to the CAD drawing so as to properly cover the breast reconstruction implant.
  • FIG. 10 shows a photograph of a cell-free skin substitute cut with a CNC machine according to a CAD drawing.
  • the cut acellularized skin substitute may wrap and suture the breast reconstruction implant.
  • FIG. 11 is a photograph showing the front side of the acellular skin substitute cut and cut according to the present invention wrapped in an implant for breast reconstruction.
  • FIG. 12 is a photograph showing the back of the acellularized skin substitute cut and cut according to the present invention wrapped in an implant for breast reconstruction.
  • FIG. 13 shows photographs of cutting the cell-free skin substitute on which the freezing process has been performed and the cell-free skin substitute on which the freezing process has not been performed with a CNC machine.
  • the present invention is a circular base portion
  • a plurality of slits are formed in at least one of the base part and the protrusion part radially along the circumferential direction of the base part with respect to the center point of the base part,
  • the slit has a starting point and an endpoint
  • the angle between the first virtual line extending from the center point of the base part to the center point of the slit and the second virtual line connecting the starting point and the end point of the slit is 60 to 120°.
  • the cell-free skin substitute is in the form of a sheet, and can be used to wrap the breast reconstruction implant.
  • the cell-free skin substitute is a dermal layer matrix obtained through cell-free technology from human or animal skin, and may be referred to as acellularized dermis (ADM).
  • ADM acellularized dermis
  • a cell-free dermal product commercially available as a cell-free skin substitute may be used, or it may be used by removing the epidermal layer and cells from the skin tissue.
  • the cell-free skin substitute may be prepared through the step of removing the epidermal layer and cells from the skin tissue.
  • the step of removing the epidermal layer and cells may be prepared through a general step of removing the epidermal layer and cells in the art.
  • the epidermal layer and cells may be removed using a decellularization solution, specifically, NaOH.
  • the step of removing the epidermal layer and cells from the skin tissue will be described in more detail in the manufacturing method of a cell-free skin substitute to be described later.
  • Cell-free skin substitute according to the present invention is a circular base portion
  • the base part and the protrusion will be separated in order to more easily explain the form of the cell-free skin substitute according to the present invention, and the base part and the protrusion part are composed of a single sheet.
  • Figure 1 shows the form of a cell-free skin substitute according to an example of the present invention.
  • the form of a cell-free skin substitute will be described with reference to the drawings.
  • the base portion is a region A in FIG. 1 , and the base portion has a circular shape.
  • the circular shape is not limited to a perfect circle, and may mean any shape without an angle including an ellipse.
  • the radius (x) of the base portion may be 3 to 10 cm. It can be used for human breast reconstruction in the radius range, and can stably wrap the breast reconstruction implant.
  • the protrusion is a region B in FIG. 1 , and includes three or more protrusions that protrude outward from the periphery of the base part, and are provided at different positions along the circumferential direction of the base part.
  • the breast reconstruction implant is wrapped with an acellular skin substitute, but during the wrapping process, there is an excessive amount of overlap between the substitute parts, and many acellular skin substitutes are discarded without being used by the patient.
  • the present invention by forming a protrusion on the acellularized skin substitute, the amount of the acellularized skin substitute can be minimized, and the time for cutting and cutting the acellularized dermis to fit the implant can be reduced during the surgical procedure. This can reduce the operation time and cost.
  • three or more protrusions may be formed, and each of the protrusions may have the same shape.
  • the cell-free skin substitute may have a symmetrical structure.
  • one protrusion may form a surface in which a line originating from any two points around the periphery of the base part is connected from the outside of the base part. In this case, one protrusion may not intersect the other protrusion except for the two arbitrary points.
  • the protrusion may have a structure in which the area becomes smaller as it extends from the circumference of the base portion in the protrusion direction.
  • the protrusion may have a pointed end (end) formed toward the protruding direction.
  • the ends of these protrusions may be expressed as vertices.
  • the vertex may be connected to the center of the base part by a straight line.
  • the vertices of the three or more protrusions may have the same angle to each other.
  • the protrusion may have a triangular shape where two straight lines starting at any two points around the perimeter of the base part meet.
  • the length (y) between the center point of the base part and the ends of the protrusions may be 3 to 15 cm.
  • the ratio of the radius (x) of the base portion and the length (y) between the end of the protrusion at the center point of the base portion, that is, x:y may be 1:1 to 1:2 or 1:1 to 1:1.5. Having the above range can wrap the upper surface of the breast reconstruction implant, it is advantageous to suture the distal end of the protrusion from the back.
  • the side where the nipple is to be located in the breast reconstruction implant may be referred to as the upper side, and the side located at the patient's rib side may be expressed as the back side.
  • the thickness of the base portion and the protrusion may be 0.5 to 5 mm. Within the above range, it is possible to stably wrap the breast reconstruction implant, suture the protrusions of the skin substitute, and maintain mechanical properties.
  • a plurality of slits may be formed in at least one of the base part and the protrusion part radially along the circumferential direction of the base part based on the central point of the base part.
  • a slit is a narrow gap made by making two blades face each other side by side, and means an incision or penetration.
  • the area of the cell-free skin substitute may be increased by 20 to 100%.
  • no lifting phenomenon with the implant through the slit does not occur, so that a dead space does not occur.
  • the retention phenomenon of a body fluid can be prevented, and an inflammatory reaction and infection can be suppressed. That is, it is possible to most appropriately wrap the spherical implant through the slit.
  • the slit provides flexibility to obtain a kidney effect, and due to the flexibility, it is possible to reduce pain and discomfort even after transplantation.
  • the fine spaces of the slit provide a favorable environment for proliferation of fibroblasts and the like and the generation of new blood vessels during the transplantation process, so that it enables rapid recovery after surgery, reduction of side effects, reduction of foreign body sensation, and natural transplantation.
  • the formation position of the slit may be optimally designed according to the purpose of use, and specifically, the formation position of the slit may be designed to stably cover the breast reconstruction implant without empty space.
  • 100 to 400 slits may be formed in the acellularized skin substitute.
  • the slit has a starting point and an end point, and the angle between the first virtual line extending from the center point of the base part to the center point of the slit and the second virtual line connecting the starting point and the end point of the slit is 60 to 120° or 80 to 100°.
  • any two points on the circumference of the base portion forming one protrusion and the center point of the base portion form an imaginary triangle, and an imaginary triangle extending from the center point of the base portion to the midpoint of the slit within the imaginary triangle.
  • a second virtual line connecting the first line and the starting point and the ending point of the slit may be vertical.
  • slits having the same shape and size may be formed in the virtual triangle.
  • the shape of the slit is not particularly limited and may have one or more shapes selected from the group consisting of a straight line, a curved line, and a V shape (comb pattern).
  • the length of the slit is not particularly limited, and may be 1 to 20 mm. Also, the distance between the slits may be 1 to 5 mm.
  • the cell-free skin substitute according to the present invention can be expressed as having a star shape.
  • the cell-free skin substitute includes a circular base portion
  • two or more virtual circular lines having different radii are set with the center of the base part as a central point, and a slit is formed so as to be in contact with at least a part of the virtual circular line.
  • the imaginary circular line may have a circular grating structure having the center of the base portion as a central point.
  • a “grating structure” may mean a pattern having a periodic or quasi-periodic structure, and a circular grating structure may mean a pattern composed of two or more circular lines based on a central point. In this case, two or more virtual circular lines may be formed to be spaced apart from each other by a predetermined interval.
  • a plurality of slits may be formed per one virtual circularity, and the shape and size of the slits may be as described above.
  • the distance between the centers of the slits tangent to the circumference of the imaginary circular line may be 3 to 30 mm, and the distance between neighboring imaginary circular lines may be 1 to 5 mm.
  • the elongation effect is excellent at the length of the slit and the distance between the slits, the possibility of the occurrence of a dead space is small, and the skin substitute may not be torn when the protrusion is sutured.
  • the cell-free skin substitute has a polygonal shape, and the perimeter of the polygonal shape has a first interior angle larger than a flat angle and a smaller than a flat angle. It can be expressed that the second interior angles are formed alternately. In this case, the second interior angle smaller than the flat angle means the vertex of the protrusion.
  • the length (x) from the center of the polygonal shape to the vertex forming the second interior angle may be 3 to 10 cm, and the length (y) from the center of the polygonal shape to the vertex forming the first interior angle is 3 to 15 cm.
  • the cell-free skin substitute according to the present invention can be used to wrap the breast reconstruction implant. Through this, it is possible to prevent side effects such as adhesion and spherical contracture.
  • the implant for breast reconstruction may use a general implant used in the art.
  • the implant for breast reconstruction may be wrapped with a cell-free skin substitute, and the protrusion may be fixed (sutured) into an operating room and then inserted into the breast reconstruction site.
  • the suture may use a method of fixing the protrusion of the acellular skin substitute, specifically, the distal ends of the protrusion to the operating room.
  • the upper surface of the prosthesis is covered with the base part of the acellularized skin substitute, and the ends of the protrusions are gathered on the back side, and then the ends can be fixed in the operating room.
  • Threads used in the art can be used without limitation as the operating room, and specifically, polyglyconate sutures that are absorbable operating rooms can be used.
  • the present invention is a breast reconstruction implant; and a cell-free skin substitute according to the present invention that surrounds the breast reconstruction implant, wherein the ends of the protrusions of the acellular skin substitute are gathered on the back side of the implant, and the ends are fixed to an operating room. can do.
  • the present invention comprises the steps of (A) positioning the acellularized dermis on a cooling plate maintained at -30 to 0 °C;
  • (C) It relates to a method of manufacturing a cell-free skin substitute comprising the step of cutting the acellularized dermis in the frozen state with a cutting device.
  • the acellularized dermis that is, the acellularized skin substitute, is a dermal layer matrix obtained from human or animal skin through acellularization technology.
  • a cell-free dermal product commercially available as such acellularized dermis may be used, or it may be used by removing the epidermal layer and cells from the skin tissue.
  • the step of preparing acellularized dermis by removing the epidermal layer and cells from the skin tissue may be additionally performed.
  • the skin tissue may be allogeneic or heterogeneous skin tissue.
  • the homogeneous refers to a human
  • the heterogeneous refers to an animal other than a human, that is, a mammal such as a pig, a cow, or a horse.
  • a cell-free skin substitute can be prepared according to the preparation method of the present invention using allogeneic or heterogeneous skin tissue.
  • a step of pre-treating the skin tissue (hereinafter, the pre-treatment step) may be additionally performed.
  • the pretreatment step may include washing the skin tissue; using a scraper to remove fascia tissue, adipose tissue and other foreign substances attached to the dermis; and removing the remaining unnecessary tissue using scissors and tweezers; It may include one or more steps of
  • fascia tissue, adipose tissue, and other foreign substances may be removed from the skin tissue until the dermis part is visible.
  • the epidermal layer in the step of removing the epidermal layer and cells, may be separated and decellularized using a decellularization solution.
  • Decellularization refers to the removal of other cellular components other than the extracellular matrix from the skin tissue, for example, the nucleus, cell membrane, hexane, and the like.
  • a basic solution may be used as the decellularization solution, and specifically, one or more selected from the group consisting of sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, calcium carbonate, magnesium hydroxide, calcium hydroxide and ammonia may be used.
  • sodium hydroxide (NaOH) may be used as the decellularization solution.
  • decellularization was performed using a surfactant and an enzyme. However, if the enzyme is used, it may damage the dermal layer itself, and if the enzyme remains and is transplanted into the body, it may damage the original tissue of the patient, and in severe cases, there is a problem of causing an immune response.
  • the above-described problem can be solved by using a decellularization solution during decellularization, and also has the advantage that there is no cytotoxicity.
  • the concentration of the decellularization solution may be 0.01 to 1 M or 0.05 to 0.5 M. It is easy to remove the cells in the above concentration range.
  • the decellularization step may be performed for 30 minutes to 12 hours or 1 to 6 hours. Removal of cells in this time range is easy.
  • step (A) is a step of placing the acellularized dermis on a cooling plate maintained at -30 to 0°C.
  • the temperature of the cooling plate can be maintained at -30 to 0°C or -25 to -5°C by flowing the cooling fluid in the vicinity of the cooling plate, or by flowing the cooling fluid in contact with the surface of the cooling plate. have.
  • the acellularized dermis can be placed on a cooling plate and kept flat without lifting the tissue.
  • step (B) is a step of adding water to a thickness of 20 to 150% of the acellularized dermis on a cooling plate and freezing the acellularized dermis.
  • the acellularized dermis is not hard and has soft properties as a biological material, it is difficult to accurately cut by the blade of a cutting device. For this reason, it is possible to use a method of cutting the acellularized dermis with a CNC machine after freeze-drying, but the method requires freezing at -60 ° C or lower, so the collagen structure inherent in the acellularized dermis is destroyed during the freeze-drying process, resulting in a sloppy tissue. and is likely to be easily decomposed in vivo. In addition, there may be a problem of tissue stiffness, which may occur in dehydration.
  • the acellularized dermis is frozen in a hydrated form by placing the acellularized dermis on a cooling plate that can be maintained at -30 to 0°C and adding water. This allows the acellularized dermis to have hard properties and then be cut with a cutting machine.
  • the acellularized dermis since the acellularized dermis is frozen using water, the acellularized dermis can be kept flat on a cooling plate without using a separate means such as negative pressure, and also cut at -30 to 0°C below zero. It has the advantage that this is possible.
  • water may be added to be 20 to 150% or 50 to 100% of the thickness of the acellularized dermis.
  • freezing of the acellularized dermis may be performed for 1 to 6 hours.
  • step (C) is a step of cutting the frozen acellularized dermis with a cutting device.
  • the cutting machine may be a CNC machine having a circular blade with a diameter of 0.1 to 5 mm.
  • the acellularized dermis may be cut into a shape and size set through a design program.
  • a design program may be a CAD program.
  • the acellularized dermis when used for wrapping the breast reconstruction implant, the acellularized dermis is designed so that it has a shape and size that can be accurately covered without lifting or separating from the breast reconstruction implant. and converts the design into a CAD program so that the design can be driven on a CNC machine.
  • the present invention comprises the steps of (a) removing the epidermal layer and cells from the skin tissue to prepare an acellularized dermis;
  • (E) It relates to a method of manufacturing a cell-free skin substitute for breast reconstruction, comprising the step of cutting the frozen acellularized dermis in the shape and size set through the design program using a cutting device.
  • the cell-free skin substitute prepared according to the present invention was wrapped in a breast reconstruction implant and fixed in an operating room. And through this, it was confirmed that the cell-free skin substitute according to the present invention can be simply used for wrapping the breast reconstruction implant.
  • steps (a), (b) and (c) are the same as the steps of removing the epidermal layer and cells, (A) and (B).
  • step (d) is a step of setting the shape and size of a cell-free skin substitute for breast reconstruction that can wrap the breast reconstruction implant through a design program.
  • a design program may be a CAD program.
  • the acellularized dermis according to the present invention is used to wrap the breast reconstruction implant, and the acellularized dermis is designed so that it has a shape and size that can be accurately covered without lifting or separating from the breast reconstruction implant. , the design can be converted into a CAD program so that it can be driven on a CNC machine.
  • the design program can be carried out so that the size of the acellularized dermis of the present invention can be variously manufactured with a diameter of 5 to 30 cm. Specifically, it is possible to design a slit with a predetermined interval of 1 to 20 mm on the surface of the acellularized dermis to eliminate the possibility of dead space and increase the area by 20 to 100%.
  • the form of a cell-free skin substitute for breast reconstruction is a circular base portion
  • Doedoe protruding outward from the circumference of the base portion may include three or more projections provided at different positions along the circumferential direction of the base portion.
  • a plurality of slits are radially formed in at least one of the base part and the protrusion part along the circumferential direction of the base part with respect to the central point of the base part, and the slits have a starting point and an ending point, and a slit at the center point of the base part.
  • An angle between the first virtual line extending to the midpoint of the slit and the second virtual line connecting the start and end points of the slit may be 60 to 120°.
  • step (e) is a step of cutting the frozen acellularized dermis in the shape and size set through the CAD program using a cutting device.
  • the acellularized dermis is frozen for 1 to 6 hours on a cooling plate that can be maintained at -30 to 0°C, and the acellularized dermis is cut into the shape and size set in the design program using a CNC circular blade.
  • the cutting direction can start from the outermost part in a clockwise or counterclockwise direction and cut to the center. Alternatively, a method of cutting from the center to the outside may be used.
  • the present invention it is possible to additionally perform the step of covering and wrapping the prepared acellular skin substitute in the breast reconstruction implant and then fixing it in the operating room.
  • the implant for breast reconstruction may be wrapped with a cell-free skin substitute, and the protrusion may be fixed (sutured) into an operating room and then inserted into the breast reconstruction site.
  • the suture may be performed by fixing the protrusion of the acellularized dermis, specifically, the distal end to the operating room.
  • a cell-free skin substitute capable of sufficiently enclosing the implant for breast reconstruction with a size of 300 to 600 cc is placed on the center of the implant, and the slit of the dermis is stretched to the extent that the slit of the dermis is widened, and the end of the protrusion of the skin substitute (star-shaped) on the back of the implant. edges) are pulled together.
  • the ends of the pulled acellularized skin substitute are connected to each other in the operating room to prevent the possibility of the acellularized dermis from being separated from the implant during insertion into the patient's breast, and to help maintain the shape after insertion.
  • Skin tissue (collected from a cadaver donated by a tissue bank for non-profit patient care) was prepared.
  • the washed skin tissue was placed on a sterile table, and using a sterile scraper, the fascia tissue, adipose tissue, and other foreign substances attached to the dermis were removed until the dermis part was visible. Using a sterile scraper, the remaining fat in the dermis was removed as much as possible, and the remaining unnecessary tissue was removed using sterile scissors and tweezers. It was washed several times with sterile distilled water.
  • a 0.05 to 0.5 M NaOH solution was used as a decellularization solution for removing the epidermal layer and cells.
  • the skin tissue from which fat was removed was placed in a NaOH solution and stirred at room temperature for 1 to 6 hours.
  • the agitated skin tissue was taken out and the epidermis and debris were removed with a scraper.
  • the skin tissue from which the epidermis and cells were removed was washed 10 times with distilled water, added distilled water, and stirred and washed at room temperature at 150 rpm for 1 to 6 hours (manufactured as a cell-free skin substitute).
  • the epidermis and cell nuclei were stained with immunohistochemistry and DAPI, respectively.
  • the acellularized dermis was fabricated with paraffin blocks to prepare slides. After removing paraffin from the prepared slide, antigen retrivel was performed to sequentially attach primary and secondary antigens, and then confirmed using an optical microscope.
  • DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole
  • the epidermis is dyed brown, and the nucleus of the cell is dyed blue.
  • FIG. 2 it can be seen that a lot of blue DAPI is expressed in raw skin.
  • the skin tissue (NaOH) treated with the decellularization solution the part expressed in blue color hardly appeared as the cells were removed. That is, it can be confirmed that the epidermis and cells seen in the raw skin are removed after the decellularization solution treatment.
  • the acellularized dermis prepared through the (2) epidermal layer and cell removal process of Example 1 was photographed by SEM, treated with a decellularization solution, and then, deformation or damage of collagen fibers was confirmed.
  • the acellularized dermis was minced.
  • the chopped dermis was treated with protease K, and then completely dissolved by heating at 56° C. overnight, and then treated with the same amount of phenol-chloroform.
  • a supernatant was obtained, mixed with 1/10 volume of sodium acetate and 100% ethanol of the supernatant, and stored at -20°C for 30 minutes. Thereafter, a DNA pellet was prepared using centrifugation, the supernatant was discarded, 70% ethanol was added, and the DNA pellet was washed again by centrifugation to obtain high-purity DNA. After all ethanol was dried naturally, it was dissolved in distilled water and DNA was quantified using Nanodrop.
  • the amount of DNA is significantly reduced in the acellularized dermis (ADM after NaOH treatment) prepared by treating the decellularization solution compared to the raw skin. That is, it can be confirmed that the cells are removed from the skin after the decellularization solution treatment.
  • Example 2 Preparation of a cell-free skin substitute that can cover and fix breast reconstruction implants
  • a design was devised to cover the breast reconstruction implant.
  • a cell-free skin substitute was designed so that the area of the acellularized skin substitute could be increased by 20 to 100% by determining the size of the breast reconstruction implant as a unit and cutting the slits and corners with a CNC machine.
  • FIG. 5 shows a technical illustration of a cell-free skin substitute having a design and shape surrounding a breast reconstruction implant.
  • a CAD drawing expressing the shape of a cell-free skin substitute for breast reconstruction that can cover and suture the breast reconstruction implant was prepared based on FIG. 5 ( FIG. 6 ).
  • the acellularized skin substitute printed on the CNC machine can be manufactured to have a diameter of 5 to 25 cm.
  • the area can be increased through the slit, the size of the implant is not affected at all.
  • the cell-free skin substitute prepared in Example 1 is a biomaterial with high flexibility and tensile strength, and has a soft and tough property without being hard. For this reason, it is difficult for the blade of a CNC machine to cut within the expected cutting range for a cell-free skin substitute.
  • a cooling plate P200525-HS-100 that can be maintained at -5 to -25°C was used.
  • the cell-free skin substitute prepared in Example 1 was placed on the cooling plate, and 100% of the thickness of the cell-free skin substitute was filled with water and frozen.
  • the blade of the CNC machine can cut the acellular skin substitute, and the frozen water fixes the cell-free skin substitute and does not wash. Saturated skin substitute does not shake, so it can be cut into a cut shape.
  • FIG. 10 shows an acellularized skin substitute cut according to a CAD drawing.
  • the cell-free skin substitute may be used for breast reconstruction.
  • the breast reconstruction implant has a size of 300 to 600cc to fit the patient's original breast size.
  • acellularized skin substitutes were manufactured with a diameter ranging from 5 to 25 cm.
  • comb-shaped slits at regular intervals of 1 to 20 mm were placed on the surface of the acellularized skin substitute so that they could be easily enlarged, and no dead space was generated to reduce the side effects of serousoma.
  • the acellular skin substitute prepared in (2) was covered on the breast reconstruction implant.
  • the side where the nipple will be located is called the top side
  • the side that is located on the patient's rib side is called the back side.
  • FIG. 11 is a state in which the acellular skin substitute surrounds the upper surface of the breast reconstruction implant
  • FIG. 12 is an absorbable operating room with the ends of the protrusion of the acellular skin substitute on the back side of the breast reconstruction implant, polyglyconate suture Maxon (Covidien) operating room It is fixed and covered with
  • the cell-free skin substitute subjected to the freezing process refers to a cell-free skin substitute in which a cell-free skin substitute is placed on a cooling plate as in (2) of Example 2, water is poured, and the freezing process is performed for 1 to 6 hours,
  • the cell-free skin substitute on which the freezing process has not been performed refers to the cell-free skin substitute on which the freezing process as described above has not been performed.
  • FIG. 13 shows images of a cell-free skin substitute on which the freezing process has been performed and a cell-free skin substitute on which the freezing process has not been performed by a CNC machine.
  • FIG. 13 when the freezing process according to the present invention is not performed, the tissue is not fixed and the surrounding tissue is pulled and the tissue is not cut while being pushed ( FIG. 13A ). On the other hand, when the freezing process is performed, it can be confirmed that the tissue is fixed while the water is frozen, and thus cutting into a desired shape is possible ( FIG. 13b ).
  • a cell-free skin substitute can be prepared through the epidermal layer removal and cell-free process excluding the use of proteolytic enzymes and surfactants.
  • the cell-free skin substitute is cut through a design program to the appropriate size and shape to wrap the breast reconstruction implant and then cut and used with a CNC machine. seroma) may be reduced. This can reduce the side effects of surgery.

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Abstract

본 발명은 유방재건용 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 단백질 분해효소 및 계면활성제 사용을 배제한 표피층 제거 및 무세포화 공정을 통해 무세포화 피부대체재를 제조할 수 있다. 또한, 무세포화 피부대체재는 유방재건 보형물을 감쌀 수 있는 적절한 크기와 형태로 디자인 프로그램을 통해 재단 된 뒤 CNC 기기로 절단되어 사용되므로, 유방재건 수술 시간을 줄일 수 있으며 봉합 후에 데드 스페이스가 생기지 않아 장액종의 발생이 줄어들 수 있다. 이를 통해 수술 부작용을 낮출 수 있다.

Description

유방재건용 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법
본 발명은 유방재건용 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법에 관한 것이다.
무세포 진피(Acellular Dermal Matrix, ADM)란, 사람 내지 동물 피부로부터 무세포화 기술을 통해 얻어지는 진피층 기질로서, 순수한 콜라겐 및 엘라스틴 등으로 구성되는 세포외기질(Extracellular Matrix, ECM) 형태의 생체유래 피부대체재를 의미한다. 이러한 생체유래 피부대체재는 이식용 장기와는 달리 면역거부반응이 상대적으로 낮은 것으로 알려져 있다. 사람유래 피부대체재와 동물유래 피부대체재의 이식 시 면역거부반응 정도의 차이가 있기도 하나, 일반적으로 사람유래 피부대체재가 생물학적 성능 및 안전성에 대해서 동물유래 피부대체재 보다 우수한 것으로 보고되어 있다. 다만, 사람유래 피부대체재는 사후 기증자로부터 피부조직을 기증받아야 하므로, 원료수급 면에서는 제한이 있을 수 있다.
반면, 수술을 요하는 대부분의 의료분과에서 사람 유래인 인체조직의 수요가 날로 증가하는 추세이다. 특히 피부에 관한 수요가 가파르게 상승 중이며, 원재료 및 인체조직 완제품의 수입의존도가 91.5%에 이르는 것으로 보고되었다. 한국 건강보험심사평가원 자료에 따르면, 2016년 무세포 진피 국내시장(보험급여 기준, 비급여 제외) 규모는 단일품목으로 약 500~1,000억원 정도로 추산되고 있다. 이러한 추세에 따라, 인공피부 또는 창상피복재 등의 의료기기 개발이 활발하게 이루어지고는 있으나, 실제 사람유래 무세포 진피의 생물학적 성능을 뛰어넘을 만한 피부대체재는 아직까지 보고된 바 없다. 이러한 의료기기 피부대체재의 세계시장규모는 2016년 18억 달러 규모로 평가되고 있다.
국내외 사람유래 무세포 진피 시장 규모가 확대되는 원인 중에 하나는 세계 1위일 정도로 높은 유방암 환자의 증가이다. 유방암 치료를 위한 전절제 외과수술 후에, 유방재건이 진행된다. 그리고, 유방재건 시 유방의 부피와 형태 유지를 위해 실리콘과 같은 보형물과 더불어 유착 및 구형구축 등의 부작용을 방지하기 위해 사람유래 무세포 진피 또는 동물유래 무세포 진피가 사용된다. 국내에서 연간 6천 건 이상의 유방재건 수술이 이루어지고 있으며, 보형물을 무세포 진피로 둘러싸서 유방재건 부위에 삽입하게 된다. 위에서 서술한 대로 동물유래 무세포 진피 보다는 사람유래의 무세포 진피를 선호하는 의료현장 분위기로 인해 사람유래 무세포 진피의 수요는 계속 증가하고 있다.
무세포 진피를 얻는 과정은 크게 2 단계로 알려져 있다. 1 단계는 준비된 피부 조직으로부터 표피층을 제거하는 단계로서, 단백질 분해 효소 또는 용액의 이온강도를 변화시켜 피부의 표피층과 진피층을 분리한다.
2 단계는 1 단계의 표피층 분리 후, 진피층의 세포를 제거하는 단계이다. 면역반응은 주로 세포막에 존재하는 막단백질에 의해 야기되는데, 세포를 제거하면 면역반응을 최소화할 수 있다. 상기 단계는 세포와 세포외기질과의 물리화학적 특성 차이를 이용하여 조직의 손상없이 세포만 선별적으로 제거하는 방법을 이용한다. 세포막의 주성분은 인지질로, 여러 가지 계면활성제 또는 효소를 이용하면 조직의 손상없이 세포를 제거할 수 있다.
가공된 무세포 진피는 유방재건 수술실에서 환자에게 삽입될 보형물의 사이즈에 맞게 의료진에 의해 재단된다. 의료진은 환자에게 적용할 보형물을 무세포 진피로 감싸는데, 감싸는 과정에서 진피 부분끼리 겹치는 부분과 과도한 여유 부분을 제거하게 된다. 의료진이 무세포 진피를 보형물에 맞게 재단하고 절단하는데 많은 시간을 소비하므로, 수술시간이 길어지고 많은 무세포 진피가 환자에게 쓰이지 못하고 버려지는 문제가 발생한다. 따라서, 수술비용이 커지고 한정된 자원의 소모가 커지게 된다.
따라서, 본 발명에서는 기증 받은 피부에서 표피층 제거와 세포 제거를 순차적으로 진행하지 않고 한번에 처리하며, 효소 또는 계면활성제를 사용하지 않고 염기 처리로 표피층 및 세포를 제거하는 방법을 제공하고자 한다. 또한, 유방재건 수술 현장에서 무세포화 진피를 환자의 보형물에 맞게 재단하고 절단하는 시간을 없애기 위해, 무세포화 피부대체재를 적절한 디자인과 크기로 제작하여 수술 시간을 줄이고 기증 받아 가공된 무세포화 피부대체재를 절약할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명에서는 무세포화 피부대체재가 환자에게 삽입될 유방재건용 보형물과 정확하게 밀착하여 덮히기 때문에 데드 스페이스의 발생으로 생기는 장액종(seroma)이 줄어 수술 부작용을 최소화할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 유방재건 수술에 최적화된 형태 및 크기의 무세포화 피부대체재의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 계면활성제 및 효소의 사용을 배제한 표피층 분리 및 무세포화 공정을 통해 무세포화 피부대체재를 얻고, 유방재건 수술에서 무세포화 피부대체재를 재단과 절단 없이 유방재건용 보형물을 감쌀 수 디자인과 형태로 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 원 형상의 베이스부; 및
상기 베이스부의 둘레에서 외측으로 돌출되되, 베이스부의 둘레방향을 따라 서로 다른 위치에 마련된 3 개 이상의 돌출부를 포함하며,
상기 베이스부 및 돌출부 중 적어도 하나에는 상기 베이스부의 중심점을 기준으로 복수개의 슬릿(slit)이 베이스부의 둘레방향을 따라 방사상으로 형성되고,
상기 슬릿은 시점과 종점을 가지며,
상기 베이스부의 중심점에서 슬릿의 중점까지 연장된 가상의 제1 선과 슬릿의 시점과 종점을 연결한 가상의 제2 선 사이의 각도는 60 내지 120°인 무세포화 피부대체재를 제공한다.
또한, 본 발명은 무세포화 진피를 영하 30 내지 0℃로 유지되는 냉각판 위에 위치시키는 단계;
상기 냉각판 상에 무세포화 진피 두께의 20 내지 150%가 되도록 물을 첨가하고 상기 무세포화 진피를 동결시키는 단계;
상기 동결 상태의 무세포화 진피를 절단 기기로 절단하는 단계를 포함하는 무세포화 피부대체재의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부 조직에서 표피층 및 세포를 제거하여 무세포화 진피를 제조하는 단계;
상기 무세포화 진피를 영하 30 내지 0℃로 유지되는 냉각판 위에 위치시키는 단계;
상기 냉각판 상에 무세포화 진피 두께의 20 내지 150%가 되도록 물을 첨가하고 상기 무세포화 진피를 동결시키는 단계;
디자인 프로그램을 통해 유방재건용 보형물을 감쌀 수 있는 무세포화 피부대체재의 형태 및 크기를 설정하는 단계; 및
절단 기기를 사용하여 상기 디자인 프로그램을 통해 설정된 형태 및 크기로 상기 동결 상태의 무세포화 진피를 절단하는 단계를 포함하며,
디자인 프로그램을 통해 설정된 무세포화 진피의 형태는 원 형상의 베이스부; 및
상기 베이스부의 둘레에서 외측으로 돌출되되, 베이스부의 둘레방향을 따라 서로 다른 위치에 마련된 3 개 이상의 돌출부를 포함하며,
상기 베이스부 및 돌출부 중 적어도 하나에는 상기 베이스부의 중심점을 기준으로 복수개의 슬릿(slit)이 베이스부의 둘레방향을 따라 방사상으로 형성되고,
상기 슬릿은 시점과 종점을 가지며,
상기 베이스부의 중심점에서 슬릿의 중점까지 연장된 가상의 제1 선과 슬릿의 시점과 종점을 연결한 가상의 제2 선 사이의 각도는 60 내지 120°인 무세포화 피부대체재의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서는 단백질 분해효소 및 계면활성제 사용을 배제한 표피층 제거 및 무세포화 공정을 통해 무세포화 피부대체재를 제조할 수 있다.
무세포화 피부대체재는 유방재건 보형물을 감쌀 수 있는 적절한 크기와 형태로 디자인 프로그램을 통해 재단 된 뒤 CNC 기기로 절단되어 사용되므로, 유방재건 수술 시간을 줄일 수 있으며 봉합 후에 데드 스페이스가 생기지 않아 장액종(seroma)의 발생이 줄어들 수 있다. 이를 통해 수술 부작용을 낮출 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 무세포화 피부대체재는 체내 이식 후 지지체(scaffold)로 작용하여 이식자의 세포들이 이동하여 생장할 수 있는 생리적 공간으로 작용할 수 있다. 또한, 무세포화 피부대체재는 신혈관형성(angiogenesis)으로 시간이 흐름에 따라 이식자의 조직이 되므로, 손상된 조직의 수복 및 성형 용도의 피부 대체재로 활용이 가능하다.
도 1은 본 발명의 일례에 따른 무세포화 피부대체재의 형태를 나타낸다.
도 2는 탈세포 용액 처리 후 피부 조직에서 표피 및 세포가 제거된 것을 확인하기 위해, 표피와 세포 핵을 각각 면역조직화학염색 및 DAPI 염색한 후 광학현미경 및 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 3은 탈세포 용액을 처리한 후 콜라겐 섬유의 변형이나 손상을 확인하기 위해 SEM으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 탈세포 용액 처리 후 피부 조직에서 DNA를 추출하여 정량한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명을 통해 개발한 디자인과 형태를 갖는 무세포화 피부대체재를 유방재건용 보형물에 감싸 유방재건을 한 기술 일러스트를 나타낸다.
도 6은 유방재건용 보형물을 감싸고 봉합할 수 있는 무세포화 피부대체재의 형태를 표현한 CAD 도면을 나타낸다.
도 7은 무세포화 피부대체재를 영하 20℃로 유지할 수 있게 제작된 냉각판을 나타내는 사진이다.
도 8은 냉각판 위에 올려진 무세포화 피부대체재가 CNC 기기의 작업 도중에 움직이지 않도록 고정하기 위해, 냉각판에 물을 무세포화 진피 두께에 도달할 만큼 부은 다음 무세포화 피부대체재와 같이 동결한 결과를 나타내는 사진이다.
도 9는 유방재건용 보형물을 적절하게 덮을 수 있도록, CAD 도면에 따라 무세포화 피부대체재를 절단하는 공정을 나타내는 사진이다.
도 10은 CAD 도면에 따라 CNC 기기로 절단한 무세포화 피부대체재의 사진을 나타낸다. 절단된 무세포화 피부대체재는 유방재건용 보형물을 감싸고 봉합될 수 있다.
도 11은 본 발명에 따라 재단되고 절단된 무세포화 피부대체재를 유방재건용 보형물에 감싼 앞면을 나타내는 사진이다.
도 12는 본 발명에 따라 재단되고 절단된 무세포화 피부대체재를 유방재건용 보형물에 감싼 뒷면을 나타내는 사진이다.
도 13는 동결 공정이 수행된 무세포화 피부대체재 및 동결 공정이 미수행된 무세포화 피부대체재를 CNC 기기로 절삭하는 사진을 나타낸다.
본 발명은 원 형상의 베이스부; 및
상기 베이스부의 둘레에서 외측으로 돌출되되, 베이스부의 둘레방향을 따라 서로 다른 위치에 마련된 3 개 이상의 돌출부를 포함하며,
상기 베이스부 및 돌출부 중 적어도 하나에는 상기 베이스부의 중심점을 기준으로 복수개의 슬릿(slit)이 베이스부의 둘레방향을 따라 방사상으로 형성되고,
상기 슬릿은 시점과 종점을 가지며,
상기 베이스부의 중심점에서 슬릿의 중점까지 연장된 가상의 제1 선과 슬릿의 시점과 종점을 연결한 가상의 제2 선 사이의 각도는 60 내지 120°인 무세포화 피부대체재에 관한 것이다.
이하, 본 발명에 따른 무세포화 피부대체재를 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 무세포화 피부대체재는 시트 형태로서, 유방재건용 보형물을 감싸는 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에서 무세포화 피부대체재는 사람 내지 동물 피부로부터 무세포화 기술을 통해 얻어지는 진피층 기질로서, 무세포화 진피(ADM)라 표현할 수 있다.
일 구체예에서, 무세포화 피부대체재로 시판되는 무세포화 진피 제품을 사용할 수 있으며, 또는 피부 조직에서 표피층 및 세포를 제거하여 사용할 수도 있다.
일 구체예에서, 무세포화 피부대체재는 피부 조직에서 표피층 및 세포를 제거하는 단계를 통해 제조된 것일 수 있다.
상기 표피층 및 세포를 제거하는 단계는 당업계의 일반적인 표피층 및 세포 제거 단계를 통해 제조될 수 있다. 본 발명에서는 탈세포 용액, 구체적으로, NaOH를 사용하여 상기 표피층 및 세포를 제거할 수 있다.
상기 피부 조직에서 표피층 및 세포를 제거하는 단계는 후술할 무세포화 피부대체재의 제조 방법에서 보다 구체적으로 설명하도록 한다.
본 발명에 따른 무세포화 피부대체재는 원 형상의 베이스부; 및
상기 베이스부의 둘레에서 외측으로 돌출되되, 베이스부의 둘레방향을 따라 서로 다른 위치에 마련된 3 개 이상의 돌출부를 포함한다.
상기 베이스부 및 돌출부는 본 발명에 따른 무세포화 피부대체재의 형태를 보다 용이하게 설명하기 위하여 구분할 것인 뿐, 상기 베이스부 및 돌출부는 하나의 시트로 구성된다.
본 발명에서 도 1은 본 발명의 일례에 따른 무세포화 피부대체재의 형태를 나타낸다. 본 발명에서는 상기 도면을 참고하여 무세포화 피부대체재의 형태를 설명하도록 한다.
본 발명에서 베이스부는 도 1에서 A 영역으로, 상기 베이스부는 원 형태를 가진다. 상기 원 형태는 진원에 한정되지 않으며, 타원형 등을 포함하는 각이 없는 모든 형태를 의미할 수 있다.
일 구체예에서 베이스부의 반지름(x)은 3 내지 10 cm일 수 있다. 상기 반지름 범위에서 사람의 유방재건 용도로 사용되어 유방재건용 보형물을 안정적으로 감쌀 수 있다.
본 발명에서 돌출부는 도 1에서 B 영역으로, 상기 상기 베이스부의 둘레에서 외측으로 돌출되되, 베이스부의 둘레방향을 따라 서로 다른 위치에 마련된 3 개 이상의 돌출부를 포함한다. 유방재건 수술 시 유방재건 보형물을 무세포화 피부대체재로 감싸는데, 감싸는 과정에서 대체재 부분끼리 겹치는 과도한 여유 부분이 존재하게 되며, 많은 무세포화 피부대체재가 환자에게 쓰이지 못하고 버려지게 된다. 본 발명에서는 무세포화 피부대체재에 돌출부를 형성함으로써, 상기 무세포화 피부대체재의 사용량을 최소화할 수 있으며, 수술 과정에서 무세포화 진피를 보형물에 맞게 재단하고 절단하는 시간을 줄일 수 있다. 이를 통해 수술 시간 및 비용을 줄일 수 있다.
일 구체예에서, 돌출부는 3 개 이상 형성될 수 있으며, 상기 돌출부 각각은 모두 동일한 형태를 가질 수 있다.
일 구체예에서, 돌출부는 4 내지 12 개 또는 6 내지 10 개 형성될 수 있으며, 짝수개로 형성될 수 있다. 짝수개의 돌출부를 가질 경우 무세포화 피부대체재는 대칭 구조를 가질 수 있다.
일 구체예에서, 하나의 돌출부는 베이스부의 둘레의 임의의 두 점에서 시작된 선이 상기 베이스부의 외측에서 연결되어 면을 형성할 수 있다. 이때, 하나의 돌출부는 상기 임의의 두 점을 제외하고는 다른 돌출부와 교차하지 않을 수 있다.
일 구체예에서, 돌출부는 베이스부의 둘레로부터 돌출 방향으로 연장될수록 면적이 작아지는 구조를 가질 수 있다. 구체적으로, 돌출부는 돌출 방향을 향해 형성된 뾰족한 말단(끝)을 가질 수 있다. 이러한 돌출부의 말단을 꼭짓점라 표현할 수 있다. 상기 꼭짓점은 베이스부의 중심과 직선으로 연결될 수 있다.
일 구체예에서, 3 이상의 돌출부의 꼭짓점은 서로 동일한 각도를 가질 수 있다.
일 구체예에서, 돌출부는 베이스부의 둘레의 임의의 두 점에서 시작된 두 직선이 만나는 삼각형 형상을 가질 수 있다.
일 구체예에서, 베이스부의 중심점에서 돌출부의 말단 사이의 길이(y)는 3 내지 15 cm일 수 있다. 또한, 베이스부의 반지름(x)과 베이스부의 중심점에서 돌출부의 말단 사이의 길이(y)의 비율, 즉, x:y는 1:1 내지 1:2 또는 1:1 내지 1:1.5일 수 있다. 상기 범위를 가지는 것이 유방재건용 보형물의 윗면을 감쌀 수 있으며, 뒷면에서 돌출부의 말단 부분의 봉합에 유리하다. 이때, 유방재건용 보형물에서 유두가 위치할 쪽을 윗면이라 하고, 환자의 갈비뼈 쪽에 위치하는 쪽을 뒷면이라 표현할 수 있다.
일 구체예에서, 베이스부 및 돌출부의 두께는 0.5 내지 5 mm 일 수 있다. 상기 범위 내에서 유방재건용 보형물을 안정적으로 감쌀 수 있고, 피부대체재의 돌출부끼리의 봉합이 가능하며, 기계적 물성을 유지할 수 있다.
또한, 본 발명의 무세포화 피부대체재에서, 상기 베이스부 및 돌출부 중 적어도 하나에는 상기 베이스부의 중심점을 기준으로 복수개의 슬릿(slit)이 베이스부의 둘레방향을 따라 방사상으로 형성될 수 있다.
본 발명에서 슬릿은 두 장의 날을 나란히 마주 보게 하여 만든 좁은 틈으로서, 절개선 또는 관통을 의미한다. 상기 슬릿을 통해 무세포화 피부대체재의 면적이 20 내지 100% 늘어날 수 있다. 구체적으로, 무세포화 피부대체재로 유방재건용 보형물을 감쌀 때, 슬릿을 통해 보형물과의 들뜸 현상이 나타나지 않아 데드 스페이스(Dead space)를 발생시키지 않는다. 이에 의해, 체액의 저류 현상을 예방하고, 염증 반응 및 감염을 억제할 수 있다. 즉, 슬릿을 통해 구형의 보형물을 가장 적절하게 감쌀 수 있다. 또한, 슬릿은 유연성을 제공하여 신장 효과를 얻으며, 유연성으로 인해 이식 후에도 통증 및 불편감을 줄여 줄 수 있다. 특히, 슬릿의 미세한 공간들은 이식과정에서 섬유모세포 등의 증식, 신생혈관의 발생 등에 유리한 환경을 제공하므로, 수술 후 빠른 회복과, 부작용 발생 감소, 이물감 저하 및 자연스러운 이식을 가능케 한다.
일 구체예에서, 슬릿의 형성 위치는 사용 목적에 따라 최적으로 디자인될 수 있으며, 구체적으로, 유방재건용 보형물을 빈 공간 없이 안정적으로 덮을 수 있도록 슬릿의 형성 위치를 디자인할 수 있다.
일 구체예에서, 슬릿은 무세포화 피부대체재 내에서 100 내지 400 개 형성될 수 있다.
일 구체예에서, 슬릿은 시점과 종점을 가지며, 상기 베이스부의 중심점에서 슬릿의 중점까지 연장된 가상의 제1 선과 슬릿의 시점과 종점을 연결한 가상의 제2 선 사이의 각도는 60 내지 120° 또는 80 내지 100°일 수 있다.
일 구체예에서, 하나의 돌출부를 형성하는 베이스부의 둘레의 임의의 두 점과 베이스부의 중심점은 가상의 삼각형을 형성하며, 상기 가상의 삼각형 내에서 상기 베이스부의 중심점에서 슬릿의 중점까지 연장된 가상의 제1 선과 슬릿의 시점과 종점을 연결한 가상의 제2 선은 수직일 수 있다. 예를 들어, 베이스부에는 돌출부의 개수만큼 가상의 삼각형이 설정될 수 있으며, 상기 가상의 삼각형 내에는 동일한 형태 및 크기의 슬릿이 형성될 수 있다.
일 구체예에서, 슬릿의 형태는 특별히 제한되지 않으며 직선형, 곡선 및 V 형태(빗살 무늬)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 형태를 가질 수 있다.
일 구체예에서, 슬릿의 길이는 특별히 제한되지 않으며, 1 내지 20 mm일 수 있다. 또한, 슬릿 사이의 거리는 1 내지 5 mm일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 무세포화 피부대체재를 별 모양을 가진다고 표현할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 무세포화 피부대체재의 형태를 다른 방식으로 표현하면, 무세포화 피부대체재는 원 형상의 베이스부; 및
상기 베이스부의 둘레에서 외측으로 돌출되되, 베이스부의 둘레방향을 따라 다른 위치에 마련된 3 개 이상의 돌출부를 포함하며,
상기 베이스부의 중심을 중심점으로 하되, 서로 다른 반경을 갖는 둘 이상의 가상의 원형선이 설정되고, 상기 가상의 원형선의 적어도 일부에 접하도록 슬릿(slit)이 형성되어 있다고 표현할 수 있다.
일 구체예에서, 가상의 원형선은 베이스부의 중심을 중심점으로 하는 원형격자(circular grating) 구조를 가질 수 있다. "격자(grating) 구조"는 주기적 또는 준주기적 구조를 가지는 무늬를 의미하며, 원형격자(circular grating) 구조는 중심점을 기준으로 둘 이상의 원형 선으로 구성된 무늬를 의미할 수 있다. 이때, 둘 이상의 가상의 원형선은 상호 일정간격 이격되게 형성될 수 있다.
일 구체예에서, 슬릿은 가상의 원형성 하나 당 복수개 형성될 수 있으며, 상기 슬릿의 형태 및 크기는 전술한 바와 같을 수 있다.
일 구체예에서, 가상의 원형선의 둘레에 접하는 슬릿의 중심 사이의 거리는 3 내지 30 mm일 수 있고, 이웃하는 가상의 원형선 사이의 거리는 1 내지 5 mm일 수 있다. 상기 슬릿의 길이 및 슬릿 사이의 거리에서 신장 효과가 우수하고, 데드 스페이스 발생 가능성이 적으며, 돌출부의 봉합 시 피부대체재가 찢어지지 않을 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 무세포화 피부대체재의 형태를 다른 방식으로 표현하면, 상기 무세포화 피부대체재는 다각형의 형상을 가지고, 상기 다각형 형상의 둘레에는 평각보다 큰 제1 내각과 평각보다 작은 제2 내각이 교대로 형성되어 있다고 표현할 수 있다. 이때, 평각보다 작은 제2 내각은 돌출부의 꼭짓점을 의미한다. 상기 다각형 형상의 중심에서 제2 내각을 형성하는 꼭지점까지의 길이(x)는 3 내지 10 cm일 수 있고, 다각형 형상의 중심에서 제1 내각을 형성하는 꼭지점까지의 길이(y)는 3 내지 15 cm일 수 있다.
본 발명에 따른 무세포화 피부대체재는 유방재건용 보형물을 감싸는 용도로 사용할 수 있다. 이를 통해, 유착 및 구형구축 등의 부작용을 방지할 수 있다.
일 구체예에서, 유방재건용 보형물은 당업계에서 사용되는 일반적인 보형물을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 무세포화 피부대체재로 유방재건용 보형물을 감싸고, 돌출부를 수술실로 고정(봉합)한 뒤 유방재건 부위에 삽입할 수 있다. 이때 봉합은 무세포화 피부대체재의 돌출부, 구제적으로 돌출부의 말단 부분들을 수술실로 고정시키는 방식을 사용할 수 있다.
구체적으로, 보형물의 윗면을 무세포화 피부대체재의 베이스부로 덮고 뒷면에 돌출부의 말단들이 모이도록 한 뒤, 상기 말단을 수술실로 고정시킬 수 있다.
상기 수술실로 당업계에서 사용되는 실을 제한없이 사용할 수 있으며, 구체적으로 흡수성 수술실인 폴리글리코네이트 봉합사를 사용할 수 있다.
즉, 본 발명은 유방재건용 보형물; 및 상기 유방재건용 보형물을 감싸는 본 발명에 따른 무세포화 피부대체재를 포함하며, 상기 보형물의 뒷면에 무세포화 피부대체재의 돌출부의 말단들이 모여있으며 상기 말단들이 수술실로 고정되어 있는 유방재건용 이식재를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 (A) 무세포화 진피를 영하 30 내지 0℃로 유지되는 냉각판 위에 위치시키는 단계;
(B) 상기 냉각판 상에 무세포화 진피 두께의 20 내지 150%가 되도록 물을 첨가하고 상기 무세포화 진피를 동결시키는 단계;
(C) 상기 동결 상태의 무세포화 진피를 절단 기기로 절단하는 단계를 포함하는 무세포화 피부대체재의 제조 방법에 관한 것이다.
무세포화 진피, 즉, 무세포화 피부대체재는 사람 내지 동물 피부로부터 무세포화 기술을 통해 얻어지는 진피층 기질이다. 이러한, 무세포화 진피로 시판되는 무세포 진피 제품을 사용할 수 있으며, 또는 피부 조직에서 표피층 및 세포를 제거하여 사용할 수도 있다.
즉, 본 발명에서는 피부 조직에서 표피층 및 세포를 제거하여 무세포화 진피를 제조하는 단계(이하, 표피층 및 세포 제거 단계)를 추가로 수행할 수 있다.
본 발명에서 피부 조직은 동종 또는 이종의 피부 조직일 수 있다. 상기 동종은 인간을 의미하며, 이종은 인간 이외의 동물, 즉, 돼지, 소, 말 등의 포유류를 의미할 수 있다.
본 발명에서는 동종 또는 이종 유래의 피부 조직을 사용하여 본 발명의 제조 방법에 따라 무세포화 피부대체재를 제조할 수 있다.
본 발명에서는 피부 조직에서 표피층 및 세포를 제거하기 전에 피부 조직을 전처리하는 단계(이하, 전처리 단계)를 추가로 수행할 수 있다.
상기 전처리 단계는 피부 조직을 세척하는 단계; 스크래퍼(scrapper)를 사용하여 진피에 붙어있는 근막 조직, 지방 조직 및 기타 이물질을 제거하는 단계; 및 가위와 핀셋을 사용하여 남아 있는 불필요한 조직을 제거하는 단계; 중 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 전처리 단계에서는 피부 조직에서 진피 부분이 보일 때까지 근막 조직, 지방 조직 및 기타 이물질 등을 제거할 수 있다.
본 발명에서 표피층 및 세포 제거 단계는 탈세포 용액을 사용하여 표피층을 분리 및 탈세포화할 수 있다. 탈세포화(decellularization)는 피부 조직으로부터 세포외기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 헥산 등을 제거하는 것을 의미한다.
일 구체예에서, 탈세포 용액으로 염기성 용액을 사용할 수 있으며, 구체적으로, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 탈세포 용액으로 수산화나트륨(NaOH)을 사용할 수 있다. 종래에는 계면활성제와 효소를 사용하여 탈세포화를 수행하였다. 그러나, 효소를 사용하는 경우 진피층 자체에 손상을 줄 수 있고, 효소가 잔류하여 체내에 이식되는 경우 환자의 본래 조직에 손상을 줄 수 있으며 심각한 경우엔 면역반응을 일으키는 문제가 있었다. 또한, 계면활성제를 사용하는 경우 상기 계면활성제의 잔류를 최소화시키기 위해 세척 작업이 필요하며, 계면활성제의 잔류는 체내에서 세포 및 조직 독성을 나타내는 원인이 될 수 있었다. 따라서, 본 발명에서는 탈세포화시 탈세포 용액을 사용하여 전술한 문제점을 해결할 수 있으며, 또한, 세포 독성이 없다는 장점을 가진다.
일 구체예에서, 탈세포 용액의 농도는 0.01 내지 1 M 또는 0.05 내지 0.5 M일 수 있다. 상기 농도 범위에서 세포의 제거가 용이하다.
또한, 일 구체예에서, 탈세포화 단계는 30분 내지 12 시간 또는 1 내지 6 시간 동안 수행될 수 있다. 상기 시간 범위에서 세포의 제거가 용이하다.
본 발명에서 단계 (A)는 무세포화 진피를 영하 30 내지 0℃로 유지되는 냉각판 위에 위치시키는 단계이다.
일 구체예에서, 냉각판의 부근에 냉각 유체를 흐르게 하거나, 또는 냉각판의 면에 접촉하도록 냉각 유체를 흐르게 함으로써 냉각판의 온도를 영하 30 내지 0℃ 또는 영하 25 내지 영하 5℃로 유지시킬 수 있다.
일 구체예에서, 무세포화 진피를 냉각판에 올리고 조직이 들뜨지 않게 평평하게 유지시킬 수 있다.
본 발명에서 단계 (B)는 냉각판 상에 무세포화 진피 두께의 20 내지 150%가 되도록 물을 첨가하고 상기 무세포화 진피를 동결시키는 단계이다.
무세포화 진피는 생체 물질로서 단단하지 않고 부드러운 성질을 갖고 있기 때문에 절단 기기의 칼날에 의해 정확하게 절단되기 어렵다. 이 때문에, 무세포화 진피를 동결건조한 후에 CNC 기기로 절단하는 방법을 사용할 수 있으나, 상기 방법은 영하 60℃ 이하에서 동결해야하므로, 동결건조 과정에서 무세포화 진피 고유의 콜라겐 구조가 파괴되어 조직이 엉성해 지고 생체 내에서 쉽게 분해될 가능성이 있다. 또한, 탈수현상에서 나타날 수 있는 조직의 뻣뻣해지는 문제가 발생할 수 있다. 상기 문제를 해결하기 위해, 본 발명에서는 무세포화 진피를 영하 30 내지 0℃가 유지될 수 있는 냉각판 위에 올리고 물을 첨가하는 방법으로 수화형태의 무세포화 진피를 동결한다. 이를 통해, 무세포화 진피가 단단한 성질을 갖게 한 다음 절단 기기로 절단할 수 있다.
특히, 본 발명에서는 물을 사용하여 무세포화 진피를 동결하므로, 음압 등의 별도의 수단을 사용하지 않고도 무세포화 진피를 냉각판 상에 평평하게 유지시킬 수 있으며, 또한, 영하 30 내지 0℃에서도 절삭이 가능하다는 장점을 가진다.
일 구체예에서, 물은 무세포화 진피 두께의 20 내지 150% 또는 50 내지 100%가 되도록 첨가할 수 있다. 상기 함량 범위에서 무세포화 진피를 동결함으로써, 무세포화 진피가 단단하게 되고 무세포화 진피 주변의 물이 얼어 절단 기기의 칼날이 무세포화 진피를 절단하는 동안에도 상기 무세포화 진피가 움직이지 않아 무세포화 진피를 의도한 형태와 크기로 절단할 수 있다.
일 구체예에서, 무세포화 진피의 동결은 1 내지 6 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명에서 단계 (C)는 동결 상태의 무세포화 진피를 절단 기기로 절단하는 단계이다.
일 구체예에서, 절단 기기는 0.1 내지 5 mm 지름의 원형 칼날을 가지는 CNC 기기일 수 있다.
본 발명에서 무세포화 진피는 디자인 프로그램을 통해 설정된 형태 및 크기로 절단될 수 있다. 이러한 디자인 프로그램은 CAD 프로그램일 수 있다.
일 구체예에서, 무세포화 진피가 유방재건용 보형물을 감싸는 용도로 사용될 경우, 무세포화 진피가 유방재건용 보형물에 들뜨거나 이탈되지 않고 정확하게 덮힐 수 있는 형태와 크기를 가지도록 상기 무세포화 진피를 디자인하고, 상기 디자인이 CNC 기기에서 구동될 수 있도록 CAD 프로그램으로 전환시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 피부 조직에서 표피층 및 세포를 제거하여 무세포화 진피를 제조하는 단계;
(b) 상기 무세포화 진피를 영하 30 내지 0℃로 유지되는 냉각판 위에 위치시키는 단계;
(c) 상기 냉각판 상에 무세포화 진피 두께의 20 내지 150%가 되도록 물을 첨가하고 상기 무세포화 진피를 동결시키는 단계;
(d) 디자인 프로그램을 통해 유방재건용 보형물을 감쌀 수 있는 무세포화 피부대체재의 형태 및 크기를 설정하는 단계;
(e) 절단 기기를 사용하여 상기 디자인 프로그램을 통해 설정된 형태 및 크기로 상기 동결 상태의 무세포화 진피를 절단하는 단계를 포함하는 유방재건용 무세포화 피부대체재의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 실시예에서는 본 발명에 따라 제작된 무세포화 피부대체재를 유방재건용 보형물에 감싸고 수술실로 고정하였다. 그리고 이를 통해 본 발명에 따른 무세포화 피부대체재를 유방재건용 보형물을 감싸는 용도로 간단하게 사용할 있음을 확인하였다.
본 발명에서 단계 (a), (b) 및 (c)는 전술한 표피층 및 세포 제거 단계, (A) 및 (B)와 같다.
본 발명에서 단계 (d)는 디자인 프로그램을 통해 유방재건용 보형물을 감쌀 수 있는 유방재건용 무세포화 피부대체재의 형태 및 크기를 설정하는 단계이다. 이러한 디자인 프로그램은 CAD 프로그램일 수 있다.
본 발명에 따른 무세포화 진피는 유방재건용 보형물을 감싸는 용도로 사용되며, 무세포화 진피가 유방재건용 보형물에 들뜨거나 이탈되지 않고 정확하게 덮일 수 있는 형태와 크기를 가지도록 상기 무세포화 진피를 디자인하고, 상기 디자인이 CNC 기기에서 구동될 수 있도록 CAD 프로그램으로 전환시킬 수 있다.
일 구체예에서, 유방재건용 보형물의 부피가 300 내지 600 cc인 점을 고려하여 본 발명의 무세포화 진피의 크기를 지름이 5 내지 30 cm로 다양하게 제작할 수 있도록 디자인 프로그램을 진행할 수 있다. 구체적으로, 무세포화 진피의 표면에 1 내지 20 mm의 일정 간격의 슬릿을 넣어 데드 스페이스 발생 가능성을 없애고 면적이 20 내지 100% 늘어날 수 있도록 디자인할 수 있다.
일 구체예에서, 유방재건용 무세포화 피부대체재의 형태는 원 형상의 베이스부; 및
상기 베이스부의 둘레에서 외측으로 돌출되되, 베이스부의 둘레방향을 따라 서로 다른 위치에 마련된 3 개 이상의 돌출부를 포함할 수 있다. 여기서, 베이스부 및 돌출부 중 적어도 하나에는 상기 베이스부의 중심점을 기준으로 복수개의 슬릿(slit)이 베이스부의 둘레방향을 따라 방사상으로 형성되고, 상기 슬릿은 시점과 종점을 가지며, 상기 베이스부의 중심점에서 슬릿의 중점까지 연장된 가상의 제1 선과 슬릿의 시점과 종점을 연결한 가상의 제2 선 사이의 각도는 60 내지 120°일 수 있다.
본 발명에서 단계 (e)는 절단 기기를 사용하여 상기 CAD 프로그램을 통해 설정된 형태 및 크기로 동결 상태의 무세포화 진피를 절단하는 단계이다.
일 구체예에서, 영하 30 내지 0℃가 유지될 수 있는 냉각판 상에서 무세포화 진피를 1 내지 6 시간 동안 얼리고, 상기 무세포화 진피를 CNC 원형 칼날을 사용하여 디자인 프로그램에 설정된 형태와 크기로 절단할 수 있다. 절단의 방향은 가장 외곽에서부터 시계 또는 반시계 방향으로 절단하기 시작해서 중앙으로 절단할 수 있다. 또는, 중앙에서 외곽으로 절단하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서는 제조된 무세포화 피부대체재를 유방재건용 보형물에 덮고 감싼 뒤 수술실로 고정하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
일 구체예에서, 무세포화 피부대체재로 유방재건용 보형물을 감싸고, 돌출부를 수술실로 고정(봉합)한 뒤 유방재건 부위에 삽입할 수 있다. 이때 봉합은 무세포화 진피의 돌출부, 구제적으로 말단 부분을 수술실로 고정시키는 방식을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 300 내지 600 cc 크기의 유방재건용 보형물을 충분히 감쌀 수 있는 무세포화 피부대체재를 보형물 중앙에 올려 놓고 진피의 슬릿이 벌어질 정도로 늘리며 보형물 후면에 피부대체재의 돌출부의 말단(별 모양의 모서리들)가 모이도록 당긴다. 당겨진 무세포화 피부대체재의 말단들을 수술실로 서로 연결하여 환자의 유방 안에 삽입하는 과정 중에서 상기 보형물에서 무세포화 진피가 이탈할 가능성을 방지하고 삽입 후에 형태를 유지하는데 도움이 되도록 할 수 있다.
하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명의 범주는 하기 실시예에 한정되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 기재된 사항에 의해 도출되는 기술적 사항을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형, 수정 또는 응용이 가능하다는 것을 당업자는 이해할 수 있을 것이다.
실시예
실시예 1. 무세포화 피부대체재(무세포화 진피) 제조
(1) 피부 전처리 과정
피부 조직(조직은행으로부터 비영리 목적의 환자 치료를 위해 기증받은 시신으로부터 채취)을 준비하였다.
세척이 완료된 피부 조직을 멸균대에 올려 놓고 멸균된 스크래퍼(scrapper)를 이용하여 진피에 붙어있는 근막 조직, 지방 조직 및 기타 이물질 등을 진피 부분이 보일 때까지 제거하였다. 멸균된 스크래퍼를 이용하여 진피에 남아있는 지방을 최대한 제거하고 멸균된 가위와 핀셋을 이용하여 남아있는 불필요한 조직을 제거하였다. 멸균 증류수로 수회 세척하였다.
(2) 표피층 및 세포 제거 과정
표피층 및 세포 제거를 위한 탈세포 용액으로 0.05 내지 0.5M NaOH 용액을 사용하였다.
NaOH 용액에 지방이 제거된 피부 조직을 넣고 상온에서 1 내지 6시간 동안 교반하였다. 교반이 완료된 피부 조직을 꺼내어 스크래퍼로 표피 및 잔해(debris) 등을 제거하였다. 표피 및 세포가 제거된 피부 조직은 증류수로 10회 세척하고, 증류수를 넣고 상온에서 150 rpm 범위에서 1~6시간 교반 세척하였다(무세포화 피부대체재 제조).
실험예 1. 표피층과 세포 제거 후의 세포의 유무 및 조직 손상 확인
실시예 1의 (2) 표피층 및 세포 제거 과정을 통해 제조된 무세포화 진피 내의 세포의 유무를 확인하였고, 또한, DNA를 정량하였다.
먼저, 무세포화 진피 내의 세포의 유무를 확인하기 위해, 표피와 세포 핵을 각각 면역조직화학염색 및 DAPI 염색하였다.
구체적으로, 면역조직화학염색을 진행하기 위해, 무세포화 진피를 파라핀 블록으로 제작하여 슬라이드를 제작하였다. 제작된 슬라이드에서 파라핀을 제거한 후, antigen retrivel을 진행하여 순차적으로 1차 및 2차 항원을 붙인 후 광학 현미경을 이용하여 확인하였다.
또한, 세포의 유무를 확인하기 위해 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)를 이용하여 세포의 핵을 염색하였다.
도 2는 탈세포 용액 처리 후 피부 조직에서 표피 및 세포가 제거된 것을 확인하기 위해, 표피와 세포 핵을 각각 면역조직화학염색 및 DAPI 염색한 후 광학현미경 및 형광현미경에서 관찰한 결과를 나타낸다.
피부 원재료(Raw skin)에서 표피는 갈색으로 염색되며, 세포의 핵은 파란색으로 염색된다. 상기 도 2에 나타난 바와 같이, 피부 원재료(Raw skin)에는 파란색의 DAPI가 많이 발현되는 것을 확인할 수 있다. 그와 반대로, 탈세포화 용액을 처리한 피부 조직(NaOH)에서는 세포가 제거됨에 따라 파란색으로 발현되는 부분이 거의 나타나지 않은 것을 확인할 수 있다. 즉, 피부 원재료(Raw skin)에서 보이는 표피와 세포가 탈세포 용액 처리 이후 제거되었음을 확인할 수 있다.
한편, 실시예 1의 (2) 표피층 및 세포 제거 과정을 통해 제조된 무세포화 진피를 SEM으로 촬영하여 탈세포 용액을 처리한 후, 콜라겐 섬유의 변형이나 손상을 확인하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 피부 원재료(Raw skin)와 마찬가지로 탈세포 용액을 처리한 피부 조직(NaOH)에서도 조직의 변형이나 손상은 관찰되지 않은 것을 확인할 수 있다.
또한, DNA 정량하기 위해, 무세포화 진피를 잘게 잘랐다. 상기 잘게 자른 진피를 단백질 분해효소(protease K)로 처리하고 overnight 동안 56℃에서 가열하여 완전히 녹인 다음, 동량의 페놀(phenol)-클로로포름(chloroform)을 처리하였다. 4℃에서 원심분리한 후, 상층액을 수득하여 상층액의 1/10 부피의 소듐 아세테이트(sodium acetate)와 100% 에탄올(ethanol)을 섞어 -20℃에서 30분 보관하였다. 이후, 원심분리를 이용하여 DNA 펠렛(pellet)을 제작하고 상층액을 버리고 70% 에탄올을 넣고 다시 원심분리하여 DNA pellet을 세척하여 순도 높은 DNA를 수득하였다. 에탄올을 모두 자연 건조한 후, 증류수에 녹이고 Nanodrop을 사용하여 DNA를 정량하였다.
도 4는 무세포화 진피에서 DNA를 추출하여 정량한 결과를 나타낸다.
도 4에 나타난 바와 같이, 피부 원재료(Raw skin)에 비해 탈세포 용액을 처리하여 제조한 무세포화 진피(NaOH 처리 후 ADM)에서 DNA의 양이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있다. 즉, 탈세포 용액 처리 후 피부에서 세포가 제거된 것을 확인할 수 있다.
실시예 2. 유방재건용 보형물을 덮고 고정할 수 있는 무세포화 피부대체재의 제조
(1) CAD 도면 제작 과정
일러스트 과정을 통해, 유방재건용 보형물을 덮을 수 있는 디자인을 고안하였다. 우선, 디자인 제작 시 수술 현장에서 조작시간을 최소로 줄일 수 있고 최소의 무세포화 피부대체재를 사용하여 효율성을 최대로 높이고자 했다. 이를 위해, 유방재건용 보형물을 덮을 수 있는 크기로 단위로 정하고, CNC 기기로 슬릿과 모서리를 절단하여 무세포화 피부대체재의 면적이 20 내지 100% 늘어날 수 있게 무세포화 피부대체재를 디자인하였다.
도 5는 유방재건용 보형물을 감싸는 디자인과 형태를 갖는 무세포화 피부대체재를 기술 일러스트를 나타낸다.
도 5와 같은 디자인을 가질 경우, 수술 현장에서 조작시간을 최소로 줄일 수 있고 최소의 무세포화 피부대체재의 사용이 가능하므로 효율성을 최대로 높일 수 있다.
또한, 본 실시예에서는 도 5를 바탕으로 유방재건용 보형물을 덮고 봉합할 수 있는 유방재건용 무세포화 피부대체재의 형태를 표현한 CAD 도면을 제작하였다(도 6).
국내외 유방재건용 보형물의 부피가 300 내지 600 cc인 점을 고려하여 CNC 기기에서 출력된 무세포화 피부대체재가 직경이 5 내지 25 cm 범위를 가지도록 제작할 수 있도록 하였다. 또한, 슬릿을 통해 면적이 늘어날 수 있기 때문에 보형물의 크기에 전혀 영향을 받지 않도록 하였다.
(2) CNC 기기를 이용한 무세포화 피부대체재의 절단 과정
실시예 1에서 제조된 무세포화 피부대체재는 유연성과 인장력이 높은 생체 물질로서, 단단하지 않고 부드럽고 질긴 성질을 갖고 있다. 이 때문에 CNC 기기의 칼날이 무세포화 피부대체재를 예상한 재단 범위로 절단하기 어렵다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 도 7와 같이, 영하 5 내지 영하 25℃가 유지될 수 있는 냉각판(P200525-HS-100)을 사용하였다.
상기 냉각판 위에 실시예 1에서 제조된 무세포화 피부대체재를 올리고 무세포화 피부대체재의 두께의 100%만큼 물을 채워 얼렸다.
도 8은 동결된 무세포화 피부대체재를 나타내며, 무세포화 피부대체재가 동결된 상태에서 CNC 기기의 칼날이 무세포화 피부대체재를 절단할 수 있을 뿐만 아니라, 얼려진 물이 무세포화 피부대체재를 고정하여 무세포화 피부대체재가 흔들리지 않아 재단된 모양으로 절단할 수 있다.
그 다음, CNC 기기(㈜협성다이나믹스, M4D-K)를 사용하여 (1)에서 제작한 CAD 도면 대로, 무세포화 피부대체재를 절단하였다(도 9).
도 10은 CAD 도면에 따라 절단된 무세포화 피부대체재를 나타낸다.
상기 무세포화 피부대체재는 유방재건용으로 사용될 수 있다.
(3) 유방재건용 보형물에 덮고 고정하는 과정
유방재건용 보형물은 환자의 본래 유방 크기에 맞추기 위해 300 내지 600cc 크기를 가지고 있다. 이와 같이, 다양한 크기의 유방재건용 보형물을 감싸기 위해, 무세포화 피부대체재는 직경이 5 내지 25cm 범위로 제작하였다. 또한, 무세포화 피부대체재의 표면에 1 내지 20 mm의 일정 간격의 빗살 무늬 슬릿을 넣어 쉽게 확대될 수 있도록 하였고 데드 스페이스가 발생하지 않아 장액종의 부작용을 줄이고자 하였다.
구체적으로, 유방재건용 보형물에 (2)에서 제작된 무세포화 피부대체재를 덮었다. 유방재건용 보형물에서 유두가 위치할 쪽을 윗면이라 하고, 환자의 갈비뼈 쪽에 위치하는 쪽을 뒷면이라 칭하면, 윗면에 피부대체재를 덮고 뒷면으로 뒤집어 무세포화 피부대체재의 돌출부의 말단들이 모이도록 하였다.
도 11은 유방재건용 보형물 윗면을 무세포화 피부대체재가 감싸고 있는 모습이며, 도 12는 유방재건용 보형물 뒷면에 무세포화 피부대체재의 돌출부의 말단들이 흡수성 수술실인 폴리글리코네이트 봉합사 Maxon (Covidien사) 수술실로 고정되어 덮고 있는 모습이다.
실험예 2. 동결 공정에 따른 무세포화 피부대체재의 절삭 평가
실시예 2의 (2)에서 동결 공정의 수행여부에 따른 CNC 절삭 성능을 평가하였다.
동결 공정이 수행된 무세포화 피부대체재는 실시예 2의 (2)와 같이 냉각판 위에 무세포화 피부대체재를 위치시키고, 물을 붓고 1 내지 6 시간 동안 동결 공정을 수행한 무세포화 피부대체재를 나타내며, 동결 공정이 미수행된 무세포화 피부대체재는 상기와 같은 동결 공정이 미수행된 무세포화 피부대체재를 나타낸다.
도 13은 동결 공정이 수행된 무세포화 피부대체재 및 동결 공정이 미수행된 무세포화 피부대체재를 CNC 기기로 절삭한 이미지를 나타낸다.
상기 도 13에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 동결 공정을 수행하지 않는 경우, 조직이 고정되지 않아 주변 조직이 끌려오고 조직이 밀리면서 절삭되지 않는다(도 13a). 반면, 동결 공정을 수행한 경우 물이 동결되면서 조직이 고정되고 그로 인해 원하는 모양으로의 절삭이 가능한 것을 확인할 수 있다(도 13b).
본 발명에서는 단백질 분해효소 및 계면활성제 사용을 배제한 표피층 제거 및 무세포화 공정을 통해 무세포화 피부대체재를 제조할 수 있다.
무세포화 피부대체재는 유방재건 보형물을 감쌀 수 있는 적절한 크기와 형태로 디자인 프로그램을 통해 재단 된 뒤 CNC 기기로 절단되어 사용되므로, 유방재건 수술 시간을 줄일 수 있으며 봉합 후에 데드 스페이스가 생기지 않아 장액종(seroma)의 발생이 줄어들 수 있다. 이를 통해 수술 부작용을 낮출 수 있다.

Claims (22)

  1. 원 형상의 베이스부; 및
    상기 베이스부의 둘레에서 외측으로 돌출되되, 베이스부의 둘레방향을 따라 서로 다른 위치에 마련된 3 개 이상의 돌출부를 포함하며,
    상기 베이스부 및 돌출부 중 적어도 하나에는 상기 베이스부의 중심점을 기준으로 복수개의 슬릿(slit)이 베이스부의 둘레방향을 따라 방사상으로 형성되고,
    상기 슬릿은 시점과 종점을 가지며,
    상기 베이스부의 중심점에서 슬릿의 중점까지 연장된 가상의 제1 선과 슬릿의 시점과 종점을 연결한 가상의 제2 선 사이의 각도는 60 내지 120°인
    무세포화 피부대체재.
  2. 제 1 항에 있어서,
    무세포화 피부대체재는 피부 조직에서 표피층 및 세포를 제거하는 단계를 통해 제조된 것인 무세포화 피부대체재.
  3. 제 1 항에 있어서,
    베이스부의 반지름은 3 내지 10 cm인 무세포화 피부대체재.
  4. 제 1 항에 있어서,
    돌출부의 수는 4 내지 12 개인 무세포화 피부대체재.
  5. 제 1 항에 있어서,
    하나의 돌출부는 베이스부의 둘레의 임의의 두 점에서 시작된 선이 상기 베이스부의 외측에서 연결되어 면을 형성하고,
    상기 하나의 돌출부는 상기 임의의 두 점을 제외하고는 다른 돌출부와 교차하지 않는 것인 무세포화 피부대체재.
  6. 제 5 항에 있어서,
    돌출부는 돌출 방향으로 연장될수록 면적이 작아지는 것인 무세포화 피부대체재.
  7. 제 5 항에 있어서,
    돌출부는 베이스부의 둘레의 임의의 두 점에서 시작된 두 직선이 만나는 삼각형 형상을 가지는 것인 무세포화 피부대체재.
  8. 제 5 항에 있어서,
    베이스부의 중심점에서 돌출부의 말단 사이의 길이는 3 내지 15 cm인 무세포화 피부대체재.
  9. 제 5 항에 있어서,
    하나의 돌출부를 형성하는 베이스부의 둘레의 임의의 두 점과 베이스부의 중심점은 가상의 삼각형을 형성하며,
    상기 가상의 삼각형 내에서 상기 베이스부의 중심점에서 슬릿의 중점까지 연장된 가상의 제1 선과 슬릿의 시점과 종점을 연결한 가상의 제2 선은 수직인 것인 무세포화 피부대체재.
  10. 제 1 항에 있어서,
    슬릿은 100 내지 400 개 형성되는 것인 무세포화 피부대체재.
  11. 제 1 항에 있어서,
    슬릿은 직선, 곡선 및 V 형으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 형상을 가지는 것인 무세포화 피부대체재.
  12. 제 1 항에 있어서,
    슬릿의 길이는 1 내지 20 mm인 무세포화 피부대체재.
  13. 제 1 항에 있어서,
    무세포화 피부대체재는 원 형상의 베이스부; 및
    상기 베이스부의 둘레에서 외측으로 돌출되되, 베이스부의 둘레방향을 따라 다른 위치에 마련된 3 개 이상의 돌출부를 포함하며,
    상기 베이스부의 중심을 중심점으로 하되, 서로 다른 반경을 갖는 둘 이상의 가상의 원형선이 설정되고, 상기 가상의 원형선의 적어도 일부에 접하도록 슬릿(slit)이 형성되어 있는 무세포화 피부대체재.
  14. 제 1 항에 있어서,
    무세포화 피부대체재는 유방재건 용도로 사용되고,
    상기 무세포화 피부대체재로 유방재건용 보형물을 감싼 뒤, 돌출부를 수술실로 고정하여 사용하는 것인 무세포화 피부대체재.
  15. 무세포화 진피를 영하 30 내지 0℃로 유지되는 냉각판 위에 위치시키는 단계;
    상기 냉각판에 무세포화 진피 두께의 20 내지 150%가 되도록 물을 첨가하고 상기 무세포화 진피를 동결시키는 단계; 및
    상기 동결 상태의 무세포화 진피를 절단 기기로 절단하는 단계를 포함하는
    무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    피부 조직에서 표피층 및 세포를 제거하여 무세포화 진피를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    피부 조직에서 표피층 및 세포의 제거는 탈세포 용액을 사용하여 수행하며,
    탈세포 용액은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 칼슘카보네이트, 수산화마그네슘, 수산화칼슘 및 암모니아로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  18. 제 15 항에 있어서,
    무세포화 진피의 동결은 1 내지 6 시간 동안 수행되는 것인 유방재건용 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  19. 제 15 항에 있어서,
    동결 상태의 무세포화 진피를 절단 기기로 절단하는 단계는, 디자인 프로그램을 통해 설정된 형태 및 크기로 상기 무세포화 진피를 절단하는 것인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  20. 제 15 항에 있어서,
    절단 기기는 0.1 내지 5 mm 지름의 원형 칼날을 가지는 CNC 기기인 무세포화 피부대체재의 제조 방법.
  21. 피부 조직에서 표피층 및 세포를 제거하여 무세포화 진피를 제조하는 단계;
    상기 무세포화 진피를 영하 30 내지 0℃로 유지되는 냉각판 위에 위치시키는 단계;
    상기 냉각판 상에 무세포화 진피 두께의 20 내지 150%가 되도록 물을 첨가하고 상기 무세포화 진피를 동결시키는 단계;
    디자인 프로그램을 통해 유방재건용 보형물을 감쌀 수 있는 무세포화 진피의 형태 및 크기를 설정하는 단계; 및
    절단 기기를 사용하여 상기 디자인 프로그램을 통해 설정된 형태 및 크기로 상기 동결 상태의 무세포화 진피를 절단하는 단계를 포함하며,
    디자인 프로그램을 통해 설정된 무세포화 피부대체재의 형태는 원 형상의 베이스부; 및
    상기 베이스부의 둘레에서 외측으로 돌출되되, 베이스부의 둘레방향을 따라 서로 다른 위치에 마련된 3 개 이상의 돌출부를 포함하며,
    상기 베이스부 및 돌출부 중 적어도 하나에는 상기 베이스부의 중심점을 기준으로 복수개의 슬릿(slit)이 베이스부의 둘레방향을 따라 방사상으로 형성되고,
    상기 슬릿은 베이스부의 둘레방향을 따라 시점과 종점을 갖으며,
    상기 베이스부의 중심점에서 슬릿의 중점까지 연장된 가상의 제1 선과 슬릿의 시점과 종점을 연결한 가상의 제2 선 사이의 각도는 60 내지 120°인
    유방재건용 무세포화 피부대체재의 제조방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    유방재건용 무세포화 피부대체재를 유방재건용 보형물에 덮고 감싸는 단계를 추가로 포함하는 것인 유방재건용 피부대체재의 제조방법.
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