WO2020111678A1 - 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법 및 이에 따라 제조된 조직 재생용 세포외기질 생체소재 - Google Patents

초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법 및 이에 따라 제조된 조직 재생용 세포외기질 생체소재 Download PDF

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WO2020111678A1
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WO
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extracellular matrix
supercritical fluid
adipose tissue
solvent
reactor
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PCT/KR2019/016189
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신용우
김규병
노성래
설윤희
신지훈
김형순
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주식회사 도프
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue

Definitions

  • the present invention relates to an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid for adipose tissue and an extracellular matrix biomaterial for tissue regeneration prepared accordingly.
  • Adipose tissue is one of the loose connective tissues, mostly composed of fat cells.
  • adipocytes include SVF (Stromal vascular fraction) cells, including progenitor cells, fibroblasts, vascular endothelial cells, and various immune cells.
  • Adipose tissue has been recognized as a major endocrine organ for many years because it produces hormones such as leptin, estrogen and cytokine TNF alpha. Adipose tissue is largely divided into white adipose tissue (WAT) and brown adipose tissue (BAT). The formation of adipose tissue appears to be partially controlled by adipose tissue organs.
  • WAT white adipose tissue
  • BAT brown adipose tissue
  • Adipose tissue develops in the subcutaneous tissue, mesentery, and posterior peritoneum, and its main role is to store energy in lipid form, but it also prevents heat dissipation, mechanically protects the organs, and receives abundant vascular distribution to actively metabolize.
  • adipose tissue contains an extracellular matrix.
  • the extracellular matrix is a tissue mainly responsible for the structural support of animals, and is composed of a matrix between cells and a basement membrane, and a matrix between cells is a matrix that fills a space between several cells, and gels and protein fibers composed of polysaccharides are cells. Filled in between, it helps to buffer the extracellular matrix.
  • the extracellular matrix is an important substance that forms the structure of the human body and regulates vital functions, and is secreted from cells, and contains various components such as collagen, laminin, elastin, glycosaminoglycan, and fibronectin.
  • the present invention effectively removes contaminants from the adipose tissue including human-derived fat through a pre-treatment process, and extracellular using supercritical fluid capable of extracting extracellular matrix by decellularization and degreasing process using supercritical fluid. It is to provide a substrate extraction method and an extracellular matrix biomaterial for tissue regeneration prepared accordingly.
  • the present invention (a) injecting the extracted adipose tissue into the reactor;
  • adipose tissue may be animal or human-derived adipose tissue.
  • the pressurization may pressurize the solvent to 200 to 600 bar.
  • the supercritical fluid may be introduced into the reactor at a flow rate of 18 to 70 mL/min, and reacted at 30 to 35°C for 2 to 12 hours.
  • the present invention provides a plurality of the present invention.
  • step (3) After arranging a carbon dioxide cylinder, arranging a co-solvent chamber on one side of the carbon dioxide cylinder, and producing a supercritical fluid by pressing carbon dioxide discharged from the carbon dioxide cylinder, the co-solvent discharged from the co-solvent chamber After mixing the supercritical fluid to prepare a solvent, the solvent is preheated through a pre-heater and put into a reactor in which the pre-treated adipose tissue of step (2) is disposed to remove and degrease cells in the adipose tissue. step; And
  • the washing is performed using deionized water and then left for 15 to 20 minutes to remove blood from the adipose tissue, and the washing may be performed 3 to 5 times.
  • the pulverization can be processed for 6 to 12 minutes by washing the adipose tissue with ultrasound of 400 to 500 W.
  • the ultrasonic treatment step may be processed in the range of 2 to 5 °C using a chiller.
  • the centrifugation is performed at 4,000 to 10,000 rpm for 15 to 20 minutes, and the centrifugation is performed at 2 to 5°C to remove moisture and lipids.
  • the supercritical fluid may be prepared by pressing the solvent to 200 to 600 bar.
  • the supercritical fluid may be introduced into the reactor at a flow rate of 18 to 70 mL/min, and reacted at 30 to 35°C for 2 to 12 hours.
  • step (3) the supercritical fluid is introduced into the reactor to react with adipose tissue, and any one selected from the group consisting of ethanol, ether, and propane can be added as a co-solvent.
  • the co-solvent may have a concentration of 10 to 25% (v/v).
  • the present invention injects the extracted adipose tissue into the reactor, pressurizes a solvent to produce a supercritical fluid, and the supercritical fluid is introduced into the reactor to remove cells from the adipose tissue,
  • An extracellular matrix biomaterial for tissue regeneration formed by degreasing and extracting an extracellular matrix is provided.
  • the recovered extracellular matrix contains a large amount of useful proteins such as growth factor such as IGF-1, collagen, and fibronectin, and can be used variously as a biomaterial for regeneration.
  • useful proteins such as growth factor such as IGF-1, collagen, and fibronectin
  • FIG. 1 is a process flow diagram of an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a process flow chart of an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a process diagram showing the configuration of a supercritical extraction device in an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a photograph after washing of adipose tissue derived from a human body in an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a photograph of centrifuging the washed adipose tissue derived from a human body in an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS Page analysis on the extracellular matrix obtained by supercritical extraction in the method for extracting extracellular matrix using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the amount of DNA remaining in the extracellular matrix according to the supercritical extraction time in the extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a PCR amplification photograph showing the amount of DNA remaining in the extracellular matrix according to the supercritical extraction time in the extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a photograph of the final product in the extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 10 is a Western-blot photograph of laminin in the obtained sample in the extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11 is a Western-blot photograph of collagen I of the obtained sample in the extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a Western-blot photograph of fibronectin in a sample obtained in an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 13a is a result of the growth factor IGF analysis of the extracellular matrix obtained in the extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 13b is a result of the extracellular matrix growth factor bFGF analysis in the extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • 13c is a result of VEGF analysis of the growth factor of the extracellular matrix obtained in the extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • 13D is a result of NGF analysis of growth factors of the extracellular matrix obtained in an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a photograph showing a wound healing process of a rat treated with an extracellular matrix biomaterial for tissue regeneration including an extracellular matrix according to another embodiment of the present invention.
  • the collected sample was placed in a supercritical extraction device equipped with an extraction reactor to perform supercritical extraction.
  • FIG. 3 is a process diagram showing the configuration of a supercritical extraction device in an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • a chiller 2 and a liquid pump 3 are disposed along a line for moving a carbon dioxide cylinder 10 and a solvent on one side.
  • a co-solvent chamber 10 is disposed and along the co-solvent pump 11, the co-solvent joins the carbon dioxide transfer line.
  • the solvent to which the co-solvent is added is introduced into the extraction chamber 6 provided in the oven 5 after being preheated through the pre-heater 4, and penetrates into the fatty tissue loaded inside the extraction chamber 6 to obtain supercritical fluid.
  • the extraction process used is in progress.
  • the extraction liquid discharged from one side of the extraction chamber 6 is adjusted in pressure through a back pressure regulator 7 and then collected in a trap chamber 8.
  • a flow meter 9 is provided on one side of the trap chamber 8 to determine the flow rate of the supercritical fluid.
  • the solvent is carbon dioxide
  • the co-solvent is ethanol
  • the extraction reaction was performed from 2 hours to 12 hours, and after the extraction was completed, the vent of the trap chamber 8 was opened to remove the evaporated liquid, and a sample in which lipids were removed using supercritical fluid was obtained.
  • FIG. 1 is a process flow diagram of an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention (a) injecting the extracted adipose tissue into the reactor; (b) preparing a supercritical fluid by pressing a solvent; And (c) introducing the supercritical fluid into the reactor to remove cells from the adipose tissue and degreasing to extract the extracellular matrix.
  • adipose tissue is extracted and injected into the prepared reactor (S10).
  • the adipose tissue may be animal or human adipose tissue.
  • the adipose tissue is animal-derived fat, it may be obtained by washing the pig skin and immersing it in ethyl alcohol, heating it in saline, and pulverizing it using a known method.
  • the adipose tissue is a human-derived adipose tissue, it may be obtained through liposuction.
  • the adipose tissue contains extracellular matrix in addition to the cells, and the extracellular matrix contains genetic material such as DNA, growth factors, useful proteins such as collagen and fibronectin.
  • a supercritical fluid is prepared by pressing a solvent (S20).
  • the solvent is in the group consisting of carbon dioxide, ammonia, nitrogen, nitrogen monoxide (NO), nitrogen dioxide (NO 2 ), nitrous oxide (N 2 O), sulfur dioxide, hydrogen, water vapor, methane, ethylene, propane, propylene, and mixed gas. It may be any one selected, or may be any one selected from alcohols containing ethanol and methanol, aromatic compounds containing benzene and toluene, but is preferably carbon dioxide.
  • the carbon dioxide easily reaches a critical point (31.1° C., 73.8 bar) in a supercritical state and has diffusion characteristics similar to gas.
  • the density of supercritical carbon dioxide related to the solvent power can be controlled by changing only the temperature or pressure conditions.
  • carbon dioxide increases solubility in non-polar materials, and thus can dissolve non-polar materials.
  • the supercritical fluid can save a considerable amount of energy because it is possible to separate the carbon dioxide solvent from the polymer product with only a simple pressure drop, and is easily separated at room temperature, so it is different from the process using an organic solvent and does not leave any toxicity in the extract.
  • the pressurization may pressurize the solvent to 200 to 600 bar.
  • the pressurization changes the carbon dioxide into a supercritical fluid, and under the pressure, the density of the supercritical fluid is low, and thus there is a problem of decellularization and degreasing effect on the extracted adipose tissue. Energy is wasted unnecessarily, reducing the efficiency of the overall process.
  • the supercritical fluid prepared by being pressed above 200 bar can penetrate the cell wall and effectively dissolve and remove intracellular lipids, thereby defatting adipose tissue and removing cells in interfering tissue.
  • the supercritical fluid is introduced into the reactor to remove cells from the adipose tissue, and degreased to extract extracellular matrix (S30).
  • the supercritical fluid may be introduced into the reactor at a flow rate of 18 to 70 mL/min, and reacted at 30 to 35°C for 4 to 12 hours.
  • the extraction time may be reduced by increasing the flow rate of the supercritical fluid within the flow rate range.
  • supercritical fluid may be introduced into the reactor and reacted with adipose tissue to remove cells and lipids from adipose tissue and obtain an extracellular matrix.
  • FIG. 2 is a process flow chart of an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to another embodiment of the present invention.
  • step (3) After arranging a carbon dioxide cylinder, arranging a co-solvent chamber on one side of the carbon dioxide cylinder, and producing a supercritical fluid by pressing carbon dioxide discharged from the carbon dioxide cylinder, the co-solvent discharged from the co-solvent chamber After mixing the supercritical fluid to prepare a solvent, the solvent is preheated through a pre-heater and put into a reactor in which the pre-treated adipose tissue of step (2) is disposed to remove and degrease cells in the adipose tissue. step; And
  • adipose tissue is washed and pulverized to prepare (S100).
  • the adipose tissue may be adipose tissue derived from the human body.
  • the human-derived fat tissue may be obtained through liposuction, which is a cosmetic procedure.
  • the fat tissue obtained through the liposuction has a large amount of blood flowing through the procedure, and the blood remaining in the fat tissue is likely to remain in the supercritical extraction process, and infection and immunity when the obtained extracellular matrix is transplanted There is a danger of causing a reaction.
  • the washing After washing with deionized water, the washing is allowed to stand for 15 to 20 minutes to remove blood from the adipose tissue, and the washing may be performed 3 to 5 times.
  • the washing may be performed 3 to 5 times, and if it does not reach the number of washings, there is no blood removal effect.
  • the crushing may be performed by treating the washed adipose tissue with ultrasonic waves of 400 to 500 W for 6 to 12 minutes.
  • the ultrasound can promote decellularization by separating cells from adipose tissue, and can greatly increase the lipid extraction effect in the centrifugation process described later.
  • the ultrasonic treatment does not reach the above range, decellularization and lipid extraction effects cannot be obtained, and if it exceeds the ultrasonic treatment range, there is a possibility of causing modification of necessary substances such as useful proteins in addition to cell separation.
  • the ultrasonic treatment step may be performed in the range of 2 to 5 °C using a chiller.
  • the protein may be deformed when heated to 38° C. or higher, and thus, it is highly preferable because the protein or the like can be prevented from being deformed when the temperature is adjusted within the above range.
  • the ultrasonic treatment is performed by dispersing and dispersing the washed adipose tissue in a flask at a speed of 50 rpm or more, and then transporting it at a constant flow rate using a pump to pass through the ultrasonic treatment device to uniformly ultrasonicate the entire adipose tissue. It can be made to be permeable.
  • the pulverization may also pulverize the washed adipose tissue at 6,000 to 18,000 rpm using a homogenizer.
  • the adipose tissue is agglomerated in a solid form, it is preferable to pulverize using a homogenizer.
  • the homogenizer does not reach the 6,000 rpm, the fat tissue may not be sufficiently pulverized, and thus the supercritical extraction effect may be reduced. When it exceeds 18,000 rpm, the crushing effect of the adipose tissue is not large and the entire process There is a fear of reducing efficiency.
  • the adipose tissue prepared by washing and grinding may be centrifuged to remove moisture and lipids (S200).
  • the centrifugation is performed at 4,000 to 10,000 rpm for 15 to 20 minutes.
  • the adipose tissue cannot be separated into a layer of moisture and lipids, and the moisture and lipid remaining in the adipose tissue may cause a problem of reducing the extraction speed of the supercritical extraction step described later.
  • the centrifugation is carried out at 2 to 5 °C to remove moisture and lipids.
  • proteins may deteriorate at 38°C or higher, it is preferable to prevent protein modification when centrifuged in the temperature range.
  • Contaminants, moisture and lipids of adipose tissue can be removed through the S100 and S200.
  • the extraction time is increased in the extraction step using a supercritical fluid, thereby reducing extraction efficiency and contaminants.
  • the extracellular matrix obtained by remaining as a biomaterial There is a problem in using the extracellular matrix obtained by remaining as a biomaterial.
  • adipose tissue is a human-derived adipose tissue
  • the pre-treatment may further include a step of thermal drying and lyophilization after centrifuging the adipose tissue, and in the case of passing through the drying process, a low-boiling material remaining in the adipose tissue after centrifugation may be removed, so the supercritical fluid may be removed. It is possible to reduce the extraction time of the extraction step using.
  • the pre-treated adipose tissue is placed in a reactor, a supercritical fluid is prepared by pressing a solvent, and the supercritical fluid is introduced into the reactor to remove cells in the adipose tissue and degreasing (S300).
  • the supercritical fluid may be prepared by pressing the solvent to 200 to 600 bar.
  • the pressurization changes the carbon dioxide into a supercritical fluid, and under the pressure, the density of the supercritical fluid is low, and thus there is a problem of decellularization and degreasing effect on the extracted adipose tissue. Energy is wasted unnecessarily, reducing the efficiency of the overall process.
  • the supercritical fluid prepared by being pressurized to 200 bar or more can penetrate the cell wall and effectively dissolve and remove lipids in the cell, thereby degreasing adipose tissue and removing cells from the adipose tissue.
  • the extracellular matrix can be utilized as a variety of biomaterials.
  • the supercritical fluid is introduced into the reactor to remove cells from the adipose tissue, and degreased to extract extracellular matrix.
  • the supercritical fluid may be introduced into the reactor at a flow rate of 18 to 70 mL/min, and reacted at 30 to 35°C for 2 to 12 hours.
  • the extraction time can be reduced by increasing the flow rate of the supercritical fluid in the flow rate range.
  • supercritical fluid may be introduced into the reactor and reacted with adipose tissue to remove cells and lipids from adipose tissue and obtain an extracellular matrix.
  • the supercritical fluid is introduced into the reactor to react with adipose tissue, but any one selected from the group consisting of ethanol, ether, and propane can be added as a co-solvent.
  • the extraction time can be shortened.
  • the ethanol Since the ethanol has a polarity, it may help to remove lipids, disinfect contaminants, and show a sterilization effect, and the ether and propane may reduce lipid removal time.
  • the co-solvent may have a concentration of 10 to 25% (v/v).
  • the solubility of lipids in the supercritical fluid may increase, and the protein content of the obtained extracellular matrix may increase.
  • the solvent is discharged to one side of the reactor, and the extracellular matrix remaining in the reactor is recovered (S400).
  • the supercritical fluid discharged by dissolving lipids can be solved for the contamination problem of the extracellular matrix obtained by discharging all of the supercritical fluid that is not left in the adipose tissue. This is an unexpected effect when using an organic solvent.
  • the present invention provides an extracellular matrix biomaterial for tissue regeneration including the extracted extracellular matrix.
  • the extracellular matrix biomaterial may be a tissue repair material, a dressing band, etc., and the active ingredient is not limited as long as it is prepared by containing an extracellular matrix.
  • deionized water was used using a separating funnel so that the blood contained in the adipose tissue was thoroughly washed with the naked eye after the adipose tissue obtained during the liposuction procedure was transported by preventing contamination. After sufficiently injecting, the mixture was left for 20 minutes and washed. A total of 5 washes were performed.
  • the output of the ultrasonic wave was adjusted to 400 W to crush the adipose tissue for 6 minutes, and the adipose tissue was maintained at 3°C using a chiller during ultrasonic treatment.
  • the sonicated adipose tissue was transferred to a centrifuge and centrifuged at 4,000 rpm for 20 minutes, and the moisture in the lower layer and lipid in the upper layer were separated and removed.
  • the collected sample was placed in a supercritical extraction device equipped with an extraction reactor to perform supercritical extraction.
  • FIG. 3 is a process diagram showing the configuration of a supercritical extraction device in an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • a chiller 2 and a liquid pump 3 are disposed along a line for moving a carbon dioxide cylinder 10 and a solvent on one side.
  • a co-solvent chamber 10 is disposed and along the co-solvent pump 11, the co-solvent joins the carbon dioxide transfer line.
  • the solvent to which the co-solvent is added is introduced into the extraction chamber 6 provided in the oven 5 after being preheated through the pre-heater 4, and penetrates into the fatty tissue loaded inside the extraction chamber 6 to obtain supercritical fluid.
  • the extraction process used is in progress.
  • the extraction liquid discharged from one side of the extraction chamber 6 is adjusted in pressure through a back pressure regulator 7 and then collected in a trap chamber 8.
  • a flow meter 9 is provided on one side of the trap chamber 8 to determine the flow rate of the supercritical fluid.
  • the solvent is carbon dioxide
  • the co-solvent is ethanol
  • carbon dioxide was prepared as a supercritical fluid, and then introduced into the extraction chamber at a flow rate of 20 mL/min to extract adipose tissue. .
  • the extraction reaction was performed from 2 hours to 12 hours, and after the extraction was completed, the vent of the trap chamber 8 was opened to remove the evaporated liquid, and a sample in which lipids were removed using supercritical fluid was obtained.
  • Example 2 After crushing the extracellular matrix obtained in Example 1 and mixing it in a viscous solution mixed with collagen, polyurethane was coated with a polymer support and dried to prepare an extracellular matrix biomaterial for tissue regeneration.
  • FIG. 4 is a photograph after washing of adipose tissue derived from a human body in an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a photograph of centrifuging the washed adipose tissue derived from a human body in an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • adipose tissue was centrifuged to form a layer, and thus moisture and lipids could be removed by centrifugation.
  • the sample obtained through the pre-treatment process was put into the supercritical extraction device according to Example 2, and the sample obtained after supercritical extraction was analyzed.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of SDS Page analysis on the extracellular matrix obtained by supercritical extraction in the method for extracting extracellular matrix using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • the sample contained more than 250 kDa in the sample after supercritical extraction compared to the control group.
  • the protein content was confirmed by treatment with a guanidine solution and a collagenase solution.
  • Table 1 shows the results of confirming the protein content by processing the sample while varying the extraction time with a guanidine solution mixed with 4 M guanidine-HCl, 10 mM EDTA, 50 mM sodium acetate, 65 mM DTT, and protease inhibitor cocktail. It was confirmed that all showed similar protein content between 4 and 12 hours.
  • Table 2 shows the results of confirming the protein content by processing the sample while varying the extraction time with a 0.01% collagenase solution. There was no difference in protein content between 4 and 12 hours, but it was confirmed that the protein content increased when it exceeded 12 hours.
  • FIG. 7 is a graph showing the amount of DNA remaining in the extracellular matrix according to the supercritical extraction time in the extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • the extracted extracellular matrix When the extracted extracellular matrix is used for other transplants, it is preferable to adjust the content to 50 ng/mg or less because residual DNA may act as an antigen and cause an immune response.
  • 7 and Table 3 show the DNA content according to the extraction reaction time.
  • the DNA content was confirmed to be about 70 ng/mg, but when the supercritical extraction was performed for 12 hours, the residual DNA of about 35 ng/mg was retained. By checking the amount, it was confirmed that the DNA residual amount was maintained below the reference value.
  • FIG. 8 is a PCR amplification photograph showing the amount of DNA remaining in the extracellular matrix according to the supercritical extraction time in the extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a photograph of the final product in the extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • Table 4 shows the elastin content according to the supercritical extraction time of the obtained extracellular matrix.
  • the content of the useful protein elastin increased from 4 to 12 hours, and when the extraction time exceeds 12 hours, most of the lipid It was removed and the protein per unit mass was concentrated to confirm that the content increased rapidly.
  • Table 5 shows the content of collagen according to the supercritical extraction time of the obtained extracellular matrix. As the extraction time was increased from 4 to 12 hours, the content of collagen also increased. When extracting for more than 12 hours, the collagen content increased rapidly, confirming that the protein was concentrated.
  • FIG. 10 is a method of extracting an extracellular matrix using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention, a western-blot photograph of laminin of the obtained sample, and FIG. 11 is a supercritical according to an embodiment of the present invention
  • the obtained sample is a Western-blot photograph of collagen I
  • FIG. 12 is obtained in an extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • the ethanol co-solvent can increase the sterilization effect as the concentration increases, thereby maintaining the protein content while preventing contamination.
  • 13A to 13D are results of analyzing the growth factors of the extracellular matrix obtained in the extracellular matrix extraction method using a supercritical fluid according to an embodiment of the present invention.
  • the wound repair effect was confirmed with the dressing band coated with the extracellular matrix on the polymer support.
  • Sprague-Dawley (SD) rats 6 weeks of age, are epilated on the back of each test group using an animal electric clipper, and then disinfect the skin epidermis using iodine tincture on the skin and from the lumbar spine to the outside.
  • a 20 mm circular defect window was created using a surgical scalpel on both skins, such as 2 cm apart, to cause a wound.
  • FIG. 14 is a photograph showing a wound healing process of a rat treated with an extracellular matrix biomaterial for tissue regeneration including an extracellular matrix according to another embodiment of the present invention. Referring to Table 6 and FIG. 14, it was confirmed that the wound healing recovery rate is increased in the experimental group treated with the biomaterial of Example 2 compared to the control group not treated with the biomaterial, and in particular, after 5 days, the outer skin repair proceeds. It was confirmed that it shows an excellent wound repair effect even compared to a commercially available nitric oxide-based dressing band.
  • the method for extracting an extracellular matrix using the supercritical fluid according to the present invention and the extracellular matrix biomaterial for tissue regeneration prepared accordingly prevents contamination through washing of adipose tissue derived from an animal or a human body, and performs ultrasonic treatment and After the centrifugation process, the extraction time of the lipid extraction step through the supercritical fluid can be greatly reduced to increase the efficiency of the extracellular matrix extraction method.
  • the extracellular matrix obtained with a predetermined or more extraction time is limited in DNA content, and can suppress the immune response during transplantation, contains a large amount of useful proteins, and contains growth factors as it is. It was confirmed that the extracellular matrix, a target substance, can be obtained very effectively by removing only unnecessary moisture and lipids from the adipose tissue through a pretreatment process and a supercritical extraction process.

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Abstract

본 발명은 (a) 추출한 지방조직을 반응기에 주입하는 단계; (b) 용매를 가압하여 초임계유체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 초임계유체를 상기 반응기에 투입하여 상기 지방조직에서 세포를 제거하고, 탈지하여 세포외기질을 추출하는 단계;를 포함하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법을 제공한다.

Description

초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법 및 이에 따라 제조된 조직 재생용 세포외기질 생체소재
본 발명은 지방조직을 대상으로 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법 및 이에 따라 제조된 조직 재생용 세포외기질 생체소재에 관한 것이다.
지방조직은 대부분이 지방 세포로 이루어진 느슨한 결합 조직의 하나이다. 지방 세포뿐 아니라, 지방조직은 전지방세포, 섬유아세포, 혈관 내포 조직 세포 및 다양한 면역 세포를 포함한 SVF(Stromal vascular fraction) 세포를 포함한다.
지방조직은 수년에 걸쳐 주된 내분비 기관으로 인지되어 왔는데 이는 렙틴, 에스트로겐, 사이토카인 TNF 알파와 같은 호르몬을 만들어내기 때문이다. 지방조직은 크게 백색지방조직(WAT)과 갈색지방조직(BAT)으로 나뉜다. 지방조직의 형성은 지방조직 장기에 의해 부분적으로 통제를 받는 것으로 보인다.
지방조직은 피하조직, 장간막, 복막후부 등에 발달하고 주 역할은 에너지를 지질 형태로 저장하는 것이지만, 열의 방산을 막거나, 기관을 기계적으로 보호하고 풍부한 혈관분포를 받아 활발한 대사활동을 하기도 한다.
한편 지방조직은 세포외기질(extracellular matrix)을 포함하고 있다.
세포외기질은 주로 동물의 구조적 지지 등을 담당하는 조직이며, 세포 사이의 기질과 기저막으로 구성되며, 세포 사이의 기질은 여러 세포들 사이의 공간을 채우는 기질이고 다당류로 이루어진 겔과 단백질 섬유가 세포 사이에 채워져 있어 세포외기질의 완충작용을 돕는다.
또한 세포외기질은 인체의 구조를 형성하고 생명기능을 조절하는 중요한 물질로서 세포로부터 분비되며 콜라겐, 라미닌, 엘라스틴, 글리코사미노글리칸, 피브로넥틴과 같은 다양한 성분을 포함하고 있다.
세포외기질을 이용한 조직수복제, 드레싱 밴드 등 다양한 생체소재들이 소개되고 있으나, 현재 상용화된 제품은 세포외기질의 일부 구성 성분만을 이용하고 있으며, 매우 유용한 성장인자(growth factor)와 단백질은 제대로 이용하지 못하는 실정이다.
인체 지방조직을 비롯한 동물 유래 지방조직에서 유용 단백질을 함유한 세포외기질을 추출하는 방법이 연구되고 있으나, 세포분리의 어려움과 타가 이식의 경우 오염이나 면역반응 등의 문제로 인하여 추출된 인간 지방조직은 활용성이 제한된다.
최근 미용성형을 위한 지방흡입술이 다수 시행되고 있으므로, 다량의 인체 유래 지방조직을 획득할 수 있는 여건이 마련되었으나, 이러한 지방흡입물에서 줄기세포 및 세포외기질의 유용 물질을 추출하는 경우에는 혈액, 지질 등 불필요한 성분이 함유되어 있어 추출된 인체 지방조직은 거의 폐기되고 있는 실정이다.
따라서 폐기되는 지방조직으로부터 유용 성분인 세포외기질을 보다 효과적으로 추출하여 타가 이식까지 가능하도록 하는 방법의 개발이 매우 시급하다.
따라서, 본 발명은 인체 유래 지방을 포함한 지방조직으로부터 전처리과정을 통하여 오염물질을 효과적으로 제거하고, 초임계유체를 이용한 탈세포 및 탈지 공정으로 세포외기질을 추출할 수 있는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법 및 이에 따라 제조된 조직 재생용 세포외기질 생체소재를 제공하는데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 (a) 추출한 지방조직을 반응기에 주입하는 단계;
(b) 용매를 가압하여 초임계유체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 초임계유체를 상기 반응기에 투입하여 상기 지방조직에서 세포를 제거하고, 탈지하여 세포외기질을 추출하는 단계;를 포함하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법을 제공한다.
또한 상기 지방조직은 동물 또는 인체 유래 지방조직일 수 있다.
또한 상기 가압은 상기 용매를 200 내지 600 bar로 가압할 수 있다.
또한 상기 (c) 단계에서 상기 초임계유체를 18 내지 70 mL/min의 유량으로 상기 반응기에 투입하고, 30 내지 35 ℃에서 2 내지 12 시간 반응시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 본 발명은
(1) 지방조직을 세척하고 분쇄하여 준비하는 단계;
(2) 준비된 상기 지방조직을 원심분리 하여 수분과 지질을 제거하여 전처리 하는 단계;
(3) 이산화탄소 실린더를 배치하고, 상기 이산화탄소 실린더 일측에 공용매챔버를 배치하며, 상기 이산화탄소 실린더에서 배출된 이산화탄소를 가압하여 초임계유체를 제조한 이후에, 상기 공용매챔버에서 배출되는 공용매와 상기 초임계유체를 혼합하여 용매를 제조한 후, 상기 용매를 프리히터를 통하여 예열된 상태로 상기 (2) 단계의 전처리된 지방조직이 배치된 반응기에 투입하여 지방조직 내 세포를 제거하고 탈지하는 단계; 및
(4) 상기 반응기 일측으로 용매를 배출하고, 반응기 내에 잔류한 세포외기질을 회수하는 단계;를 포함하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법을 제공한다.
또한 상기 (1) 단계에서 상기 세척은 탈이온수를 이용하여 세척한 이후 15 내지 20 분 동안 정치하여 상기 지방조직 중 혈액을 제거하며, 상기 세척은 3 내지 5 회 수행될 수 있다.
또한 상기 (1) 단계에서 상기 분쇄는 세척된 지방조직을 400 내지 500 W의 초음파로 6 내지 12 분 동안 처리할 수 있다.
또한 상기 초음파 처리 단계는 칠러를 사용하여 2 내지 5 ℃의 범위에서 처리될 수 있다.
또한 상기 (2) 단계에서 상기 원심분리는 4,000 내지 10,000 rpm으로 15 내지 20 분 동안 수행되며, 상기 원심분리는 2 내지 5 ℃에서 수행되어 수분과 지질을 제거할 수 있다.
또한 상기 (2) 단계에서 상기 초임계유체는 상기 용매를 200 내지 600 bar로 가압하여 제조될 수 있다.
또한 상기 (5) 단계에서 상기 초임계유체를 18 내지 70 mL/min의 유량으로 상기 반응기에 투입하고, 30 내지 35 ℃에서 2 내지 12 시간 반응시킬 수 있다.
또한 상기 (3) 단계에서 상기 초임계유체를 상기 반응기에 투입하여 지방조직과 반응시키되, 에탄올, 에테르, 및 프로판으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나를 선택하여 공용매로 첨가할 수 있다.
또한 상기 공용매는 농도가 10 내지 25 %(v/v)일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 추출한 지방조직을 반응기에 주입하고, 용매를 가압하여 초임계유체를 제조하며, 상기 초임계유체를 상기 반응기에 투입하여 상기 지방조직에서 세포를 제거하고, 탈지하여 세포외기질을 추출하여 형성된 조직 재생용 세포외기질 생체소재를 제공한다.
본 발명에 따르면, 동물 지방조직을 비롯한 인체 지방조직으로부터 초임계유체를 이용한 추출 과정을 통하여 탈세포(decellularization) 및 탈지(delipidation)를 매우 효과적으로 수행하여 생체 적합성이 증가된 세포외기질을 추출할 수 있다.
또한 추출된 지방조직을 전처리하여 혈액 등의 오염물질을 제거하고 수분과 지질을 미리 제거하여 초임계추출 공정의 효율을 크게 증가시킬 수 있다.
또한 회수된 세포외기질은 IGF-1와 같은 성장인자(growth factor), 콜라겐, 피브로넥틴 등의 유용 단백질을 다량으로 함유하여 재생용 생체소재로 다양하게 활용할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법의 공정순서도이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법의 공정순서도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 초임계추출장치의 구성을 나타낸 공정도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 인체 유래 지방조직의 세척 후의 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 세척된 인체 유래 지방조직을 원심분리한 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 초임계추출로 수득한 세포외기질에 대한 SDS Page 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 초임계추출 시간에 따른 세포외기질의 DNA 잔존량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 초임계추출 시간에 따른 세포외기질의 DNA 잔존량을 나타낸 PCR 증폭 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 최종 산물의 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 수득한 시료의 라미닌에 대한 웨스턴-블랏 사진이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 수득한 시료의 콜라겐I에 대한 웨스턴-블랏 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 수득한 시료의 피브로넥틴에 대한 웨스턴-블랏 사진이다.
도 13a는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 수득한 세포외기질의 성장인자 IGF 분석결과이다.
도 13b는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 수득한 세포외기질의 성장인자 bFGF 분석결과이다.
도 13c는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 수득한 세포외기질의 성장인자 VEGF 분석결과이다.
도 13d는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 수득한 세포외기질의 성장인자 NGF 분석결과이다.
도 14는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포외기질을 포함하는 조직 재생용 세포외기질 생체소재로 처리한 렛의 창상치유 과정을 나타낸 사진이다.
채취된 시료를 추출반응기가 구비된 초임계추출장치에 배치하여 초임계추출 수행하였다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 초임계추출장치의 구성을 나타낸 공정도이다.
도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계추출장치는 일측에 이산화탄소 실린더(10)와 용매를 이동시키는 라인을 따라 칠러(2)와 액체펌프(3)가 배치된다.
상기 용매 실린더(10)의 일측에는 공용매챔버(10)가 배치되고 공용매펌프(11)를 따라 공용매는 이산화탄소 이동 라인에 합류된다.
공용매가 첨가된 용매는 프리히터(4)를 거쳐 예열된 이후에 오븐(5) 내에 구비된 추출챔버(6)에 도입되어 추출챔버(6) 내부에 장입된 지방조직으로 침투하여 초임계유체를 이용한 추출과정이 진행된다.
상기 추출챔버(6) 일측에서 배출된 추출액은 역압 조절기(7)를 통하여 압력이 조절되고, 이후 트랩챔버(8)에 포집된다.
상기 트랩챔버(8)의 일측에는 플로우미터(9)가 구비되어 초임계유체의 유량을 결정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 용매는 이산화탄소이며, 공용매는 에탄올이다.
오븐(5)의 온도를 32 ℃로 조절하고 액체펌프(3)를 300 bar로 가압하여 이산화탄소를 초임계유체로 제조한 이후에 추출챔버(6)에 20 mL/min의 유량으로 도입하여 지방조직을 추출하였다.
추출반응을 2 시간에서 12 시간까지 수행하고, 추출이 완료된 이후에 트랩챔버(8)의 벤트를 개방하여 추출액을 증발시켜 제거하고, 초임계유체를 이용하여 지질이 제거된 시료를 수득하였다.
이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부된 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다.
그러나 본 발명은 이하에 개시되는 실시예들에 의해 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지 기술 등이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그에 관한 자세한 설명은 생략하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법의 공정순서도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명은 (a) 추출한 지방조직을 반응기에 주입하는 단계; (b) 용매를 가압하여 초임계유체를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 초임계유체를 상기 반응기에 투입하여 상기 지방조직에서 세포를 제거하고, 탈지하여 세포외기질을 추출하는 단계;를 포함한다.
우선 지방조직을 추출하여 준비한 반응기에 주입한다(S10).
상기 지방조직은 동물 또는 인체 유래 지방조직일 수 있다.
상기 지방조직이 동물 유래 지방인 경우에는 공지의 방법을 이용하여, 돼지 피부를 세척하고 에틸알콜에 침지한 이후에 식염수에서 가열하고, 분쇄하여 수득한 것일 수 있다.
상기 지방조직이 인체 유래 지방조직인 경우에는 지방흡입술을 통해 얻어진 것일 수 있다.
상기 지방조직은 세포 외에 세포외기질을 포함하고 있으며, 상기 세포외기질은 DNA와 같은 유전물질, 성장인자(growth factor), 콜라겐(collagen) 및 피브로넥틴(fibronectin)과 같은 유용 단백질을 함유한다.
용매를 가압하여 초임계유체를 제조한다(S20).
상기 용매는 이산화탄소, 암모니아, 질소, 일산화질소(NO), 이산화질소(NO2), 아산화질소(N2O), 이산화황, 수소, 수증기, 메탄, 에틸렌, 프로판, 프로필렌 및 이들이 혼합가스로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나이거나, 에탄올 및 메탄올을 포함하는 알코올류, 벤젠 및 톨루엔을 포함하는 방향족 화합물에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이산화탄소인 것이 바람직하다.
상기 이산화탄소는 초임계 상태인 임계점(31.1 ℃, 73.8 bar)에 쉽게 도달되어 기체와 유사한 확산 특성을 갖는다.
액체와 유사한 밀도를 가지기 때문에 다양한 화합물에서 그 용해도가 높다.
용해력(solvent power)과 관계되는 초임계 이산화탄소의 밀도는 온도 또는 압력 조건만을 변화시켜 조절할 수 있다.
높은 밀도에서 이산화탄소를 무극성 물질에 대한 용해도가 증가하며, 이에 따라 무극성 물질을 용해할 수 있다.
이로 인해 초임계 이산화탄소가 화학반응에서 용매로서 선호되고, 특히 다양한 유형의 단량체를 용해시킬 수 있기 때문에 중합반응에서 선호된다.
상기 초임계유체는 단순한 압력 저하만으로 고분자 생성물로부터 이산화탄소 용매의 분리공정이 가능하기 때문에 상당한 양의 에너지를 절약할 수 있으며, 상온에서 쉽게 분리되므로 유기 용매를 사용한 공정과 차별되어 추출물에 독성이 남지 않는 장점을 갖는다.
상기 가압은 상기 용매를 200 내지 600 bar로 가압할 수 있다.
상기 가압은 이산화탄소를 초임계유체로 변화시키며, 상기 압력 미만에서는 초임계유체의 밀도가 낮아서 추출된 지방조직에 대한 탈세포 및 탈지 효과가 감소되는 문제가 있으며, 상기 압력을 초과하는 경우 가압에 따른 에너지가 불필요하게 소모되어 전체 공정의 효율을 감소시킬 수 있다.
상기 200 bar 이상으로 가압되어 제조된 초임계유체는 세포벽을 침투하여 세포 내 지질을 효과적으로 용해시켜 제거할 수 있어서 지방조직을 탈지할 수 있으며, 지장조직 내 세포를 제거할 수 있다.
상기 지방조직에서 세포가 제거되는 경우에는 수득되는 세포외기질의 면역 반응을 억제할 수 있기 때문에 타가 이식에 매우 유리하다.
상기 초임계유체를 상기 반응기에 투입하여 상기 지방조직에서 세포를 제거하고, 탈지하여 세포외기질을 추출한다(S30).
상기 S30에서 상기 초임계유체를 18 내지 70 mL/min의 유량으로 상기 반응기에 투입하고, 30 내지 35 ℃에서 4 내지 12 시간 반응시킬 수 있다.
상기 유량 범위 내에서 초임계유체의 유량을 증가시켜 추출시간을 감소시킬 수 있다.
상기 반응시간 범위에서 초임계유체를 반응기에 투입하고 지방조직과 반응시켜 지방조직에서 세포 및 지질을 제거하고 세포외기질을 수득할 수 있다.
상기 추출시간에 미치지 못하는 경우 세포외기질이 함유하는 성장인자 및 유용 단백질의 함량이 감소되는 문제가 발생할 수 있으며, 상기 추출시간을 초과하는 경우 이미 지질이 제거되어 불필요하게 공정 시간이 증가되는 문제가 있다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법의 공정순서도이다.
도 2를 참조하면, 본 발명의 다른 실시예에 의하면, 본 발명은
(1) 지방조직을 세척하고 분쇄하여 준비하는 단계;
(2) 준비된 상기 지방조직을 원심분리 하여 수분과 지질을 제거하여 전처리 하는 단계;
(3) 이산화탄소 실린더를 배치하고, 상기 이산화탄소 실린더 일측에 공용매챔버를 배치하며, 상기 이산화탄소 실린더에서 배출된 이산화탄소를 가압하여 초임계유체를 제조한 이후에, 상기 공용매챔버에서 배출되는 공용매와 상기 초임계유체를 혼합하여 용매를 제조한 후, 상기 용매를 프리히터를 통하여 예열된 상태로 상기 (2) 단계의 전처리된 지방조직이 배치된 반응기에 투입하여 지방조직 내 세포를 제거하고 탈지하는 단계; 및
(4) 상기 반응기 일측으로 용매를 배출하고, 반응기 내에 잔류한 세포외기질을 회수하는 단계;를 포함하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법을 제공한다.
우선 지방조직을 세척하고 분쇄하여 준비한다(S100).
상기 지방 조직은 인체 유래 지방조직일 수 있다.
상기 인체 유래 지방조직은 미용 시술인 지방흡입술을 통해 얻어진 것일 수 있다.
상기 지방흡입술을 통해 얻어지는 지방조직은 시술 과정에 따른 혈액이 다량 유입되며, 지방조직에 잔류되는 혈액은 초임계 추출과정에서도 잔류될 가능성이 있으며, 수득한 세포외기질을 타가 이식하는 경우 감염 및 면역 반응을 초래할 우려가 있다.
상기 세척은 탈이온수를 이용하여 세척한 이후, 15 내지 20 분 동안 정치하여 상기 지방조직 중 혈액을 제거하며, 상기 세척은 3 내지 5회 수행될 수 있다.
세척은 탈이온수를 첨가하고 교반한 이후에 상기 시간 범위에서 그대로 방치하여 혈액이 지방조직으로부터 분리될 수 있도록 한다.
상기 세척은 3 내지 5회 수행될 수 있으며, 상기 세척 횟수에 미치지 못하는 경우에는 혈액 제거 효과가 없다.
상기 세척을 통하여 혈액을 제거하며 세포외기질의 오염 및 면역 반응을 방지할 수 있다.
상기 분쇄는 세척된 지방조직을 400 내지 500 W의 초음파로 6 내지 12 분 동안 처리하여 수행할 수 있다.
상기 초음파는 지방조직에서 세포를 분리하여 탈세포를 촉진할 수 있으며, 후술하는 원심분리 과정에서 지질 추출효과를 매우 증가시킬 수 있다.
상기 초음파 처리가 상기 범위에 미치지 못하는 경우 탈세포 및 지질 추출효과를 얻을 수 없으며, 상기 초음파 처리 범위를 초과하는 경우에는 세포 분리 이외에 유용 단백질과 같은 필요 물질의 변형을 초래할 우려가 있다.
상기 초음파 처리 단계는 칠러를 사용하여 2 내지 5 ℃의 범위에서 수행될 수 있다.
단백질은 38 ℃ 이상으로 가열하면 변형될 우려가 있으므로, 상기 범위로 온도를 조절하는 경우 단백질 등이 변형을 방지할 수 있으므로 매우 바람직하다.
본 발명의 실시예에서 상기 초음파 처리는 세척된 지방조직을 플라스크에서 50 rpm 이상으로 교반하여 분산시킨 후 펌프를 사용하여 일정한 유속으로 이송하여 초음파 처리 장치를 통과하도록 하여 전체 지방조직에 균일하게 초음파가 투과될 수 있도록 할 수 있다.
한편 상기 분쇄는 상기 세척된 지방조직을 호모게나이저를 이용하여 6,000 내지 18,000 rpm에서 분쇄하는 것도 가능하다.
상기 지방조직이 고형으로 응집되어 있는 경우 호모게나이저를 사용하여 분쇄하는 것이 바람직하다.
상기 호모게나이저가 상기 6,000 rpm에 미치지 못하는 경우에는 지방조직이 충분하게 분쇄되지 못하여 초임계추출 효과가 감소될 우려가 있으며, 18,000 rpm을 초과하는 경우에는 지방조직의 분쇄효과가 크기 않고 전체 공정의 효율을 감소시킬 우려가 있다.
세척 및 분쇄되어 준비된 지방조직을 원심분리하여 수분과 지질을 제거할 수 있다(S200).
상기 원심분리는 4,000 내지 10,000 rpm으로 15 내지 20 분 동안 수행된다.
상기 회전속도에 미치지 못하는 경우에 지방조직을 수분, 지질 층상으로 분리할 수 없으며, 지방 조직에 잔류하는 수분 및 지질은 후술하는 초임계추출 단계의 추출속도를 감소시키는 문제가 발생할 수 있다.
상기 회전속도를 초과하는 경우에는 원심분리과정에서 지방조직에 가해지는 온도가 너무 상승하거나, 더 이상 층 분리의 효과가 증가하지 않아서 불필요한 에너지가 소모되는 문제가 발생할 수 있다.
상기 원심분리는 2 내지 5 ℃에서 수행되어 수분과 지질을 제거할 수 있다.
단백질은 38 ℃ 이상에서 변질될 우려가 있으므로 상기 온도 범위에서 원심분리하는 경우 단백질의 변형을 방지할 수 있어서 바람직하다.
상기 원심분리하는 경우 수분은 하부층으로 이동하고 지질을 포함하는 유분은 상부층으로 이동하여 수분과 지질은 분리할 수 있다.
상기 원심분리를 통하여 지방조직에서 수분과 지방을 제거하여 초임계추출 공정의 추출속도를 증가시키고, 오염물질을 제거하여 고순도의 세포외기질을 수득할 수 있다.
상기 S100 및 S200을 통하여 지방조직의 오염물질, 수분 및 지질을 제거할 수 있으며, 상기 단계를 거치지 않는 경우에는 초임계유체를 이용한 추출단계에서 추출시간이 증가되어 추출효율이 감소되고, 오염물질이 잔류하여 수득한 세포외기질을 생체소재로 이용하는데 문제가 발생한다.
특히 지방조직이 인체 유래 지방조직인 경우에는 상기 S100 및 S200을 통하여 전처리 하는 것이 매우 바람직하다.
상기 전처리는 지방조직을 원심분리 한 이후에 열건조, 동결건조 하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 건조과정을 거치는 경우에 원심분리 후 지방조직에 잔류하는 저비점 물질이 제거될 수 있어서 초임계유체를 이용한 추출단계의 추출시간을 감소시킬 수 있다.
전처리된 지방조직을 반응기에 배치하고, 용매를 가압하여 초임계유체를 제조하며, 상기 초임계유체를 상기 반응기에 투입하여 지방조직 내 세포를 제거하고, 탈지한다(S300).
상기 S300에서 상기 초임계유체는 상기 용매를 200 내지 600 bar로 가압하여 제조될 수 있다.
상기 가압은 이산화탄소를 초임계유체로 변화시키며, 상기 압력 미만에서는 초임계유체의 밀도가 낮아서 추출된 지방조직에 대한 탈세포 및 탈지 효과가 감소되는 문제가 있으며, 상기 압력을 초과하는 경우 가압에 따른 에너지가 불필요하게 소모되어 전체 공정의 효율을 감소시킬 수 있다.
상기 200 bar 이상으로 가압되어 제조된 초임계유체는 세포벽을 침투하여 세포 내 지질을 효과적으로 용해시켜 제거할 수 있어서 지방조직을 탈지할 수 있으며, 지방조직에서 세포를 제거할 수 있다.
상기 지방조직에서 세포가 제거되는 경우에는 수득되는 세포외기질의 면역 반응을 억제할 수 있기 때문에 타가 이식에 매우 유리하다.
상기 지방조직에서 지질을 제거하고 단백질과 같은 유용 물질을 잔류시켜 세포외기질을 다양한 생체소재로 활용할 수 있다.
상기 초임계유체를 상기 반응기에 투입하여 상기 지방조직에서 세포를 제거하고, 탈지하여 세포외기질을 추출한다.
상기 초임계유체를 18 내지 70 mL/min의 유량으로 상기 반응기에 투입하고, 30 내지 35 ℃에서 2 내지 12 시간 반응시킬 수 있다.
상기 유량 범위에서 초임계유체의 유량을 증가시켜 추출시간을 감소시킬 수 있다.
상기 반응시간 범위에서 초임계유체를 반응기에 투입하고 지방조직과 반응시켜 지방조직에서 세포 및 지질을 제거하고 세포외기질을 수득할 수 있다.
상기 반응시간에 미치지 못하는 경우 세포외기질이 함유하는 성장인자 및 유용 단백질의 함량이 감소되는 문제가 발생할 수 있으며, 상기 반응시간을 초과하는 경우 이미 지질이 제거되어 불필요하게 추출 시간이 증가되는 문제가 있다.
상기 S400에서 상기 초임계유체를 상기 반응기에 투입하여 지방조직과 반응시키되, 에탄올, 에테르, 및 프로판으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나를 선택하여 공용매로 첨가할 수 있다.
상기 공용매를 첨가하는 경우 추출시간을 단축시킬 수 있다.
상기 에탄올은 극성을 가지므로 지질 제거에 도움을 주고, 오염물질을 소독하여 멸균 효과를 나타낼 수 있고, 상기 에테르 및 프로판은 지질 제거 시간을 감소시킬 수 있다.
상기 공용매는 농도가 10 내지 25 %(v/v)일 수 있다.
상기 농도 범위에서 공용매를 첨가하는 경우 초임계유체의 지질에 대한 용해력이 증가할 수 있으며, 수득한 세포외기질이 함유하는 단백질 함량이 증가할 수 있다.
상기 반응기 일측으로 용매를 배출하고, 반응기 내에 잔류한 세포외기질을 회수한다(S400).
상기 반응기의 일측으로 용매를 배출하면 지질을 용해시켜 배출한 초임계유체는 지방조직에 잔류하지 않고 모두 배출되어 수득한 세포외기질의 오염문제를 해결할 수 있다. 이는 유기용매를 사용할 때는 기대할 수 없는 효과이다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 추출된 세포외기질을 포함하는 조직 재생용 세포외기질 생체소재를 제공한다.
상기 세포외기질 생체소재는 조직수복재, 드레싱 밴드 등일 수 있으며, 유효성분이 세포외기질을 함유하여 제조되는 것이면 제한되지는 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 세포외기질 추출
(1) 전처리
지방조직으로부터 세포외기질을 추출하기 위하여 지방흡입시술과정에서 수득한 지방조직을 오염 방지 처리하여 이송한 이후에 지방조직에 포함된 혈액을 육안으로 완전하게 씻겨 낼 정도로 분액 깔대기를 이용하여 탈이온수를 충분히 주입하여 혼합 후 20분 방치하여 세척하였다. 총 5회 세척을 실시하였다.
세척한 지방조직 1000 mL를 플라스크에 담고 교반기를 이용하여 50 rpm으로 분산시킨 후 펌프(120 rpm 펌핑)를 사용하여 일정한 유속으로 초음파 처리 장치를 통과하도록 하여, 전체 지방조직에 균일하게 초음파가 투과될 수 있도록 하였다.
상기 초음파의 출력은 400 W로 조절하여 6 분 동안 지방조직을 분쇄하였으며, 초음파 처리 동안 칠러(chiller)를 사용하여 지방조직을 3 ℃로 유지하였다.
초음파 처리한 지방조직을 원심분리기로 옮겨 4,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하고 하부층의 수분과 상부층의 지질을 분리하여 제거하였다.
(2) 초임계추출
채취된 시료를 추출반응기가 구비된 초임계추출장치에 배치하여 초임계추출 수행하였다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 초임계추출장치의 구성을 나타낸 공정도이다.
도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계추출장치는 일측에 이산화탄소 실린더(10)와 용매를 이동시키는 라인을 따라 칠러(2)와 액체펌프(3)가 배치된다.
상기 용매 실린더(10)의 일측에는 공용매챔버(10)가 배치되고 공용매펌프(11)를 따라 공용매는 이산화탄소 이동 라인에 합류된다.
공용매가 첨가된 용매는 프리히터(4)를 거쳐 예열된 이후에 오븐(5) 내에 구비된 추출챔버(6)에 도입되어 추출챔버(6) 내부에 장입된 지방조직으로 침투하여 초임계유체를 이용한 추출과정이 진행된다.
상기 추출챔버(6) 일측에서 배출된 추출액은 역압 조절기(7)를 통하여 압력이 조절되고, 이후 트랩챔버(8)에 포집된다.
상기 트랩챔버(8)의 일측에는 플로우미터(9)가 구비되어 초임계유체의 유량을 결정할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 용매는 이산화탄소이며, 공용매는 에탄올이다.
오븐(5)의 온도를 32 ℃로 조절하고 액체펌프(3)를 300 bar로 가압하여 이산화탄소를 초임계유체로 제조한 이후에 추출챔버에 20 mL/min의 유량으로 도입하여 지방조직을 추출하였다.
추출반응을 2 시간에서 12 시간까지 수행하고, 추출이 완료된 이후에 트랩챔버(8)의 벤트를 개방하여 추출액을 증발시켜 제거하고, 초임계유체를 이용하여 지질이 제거된 시료를 수득하였다.
실시예 2: 생체소재 제조
실시예 1에서 수득한 세포외기질을 분쇄하고 콜라겐이 혼합된 점착성 용액에 혼합한 이후에 폴리우레탄을 고분자 지지체로 도포하고 건조하여 조직 재생용 세포외기질 생체소재를 제조하였다.
실험예 1: 전처리에 따른 변화
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 인체 유래 지방조직의 세척 후의 사진이다.
도 4를 참조하면, 탈이온수의 세척으로 혈액을 대부분 제거하여 지방조직의 오염 가능성을 감소시킨 것을 확인하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 세척된 인체 유래 지방조직을 원심분리한 사진이다.
도 5를 참조하면, 지방조직을 원심분리하여 층이 생성되어 수분과 지질을 원심분리하여 제거할 수 있는 것을 확인하였다.
전처리 과정에서 세척과 분쇄, 및 원심분리를 통하여 수분을 제거하고 지질을 제거할 수 있는 것을 확인하였다.
실험예 2: 초임계추출에 따른 세포외기질
전처리 과정을 통하여 수득한 시료를 실시예 2에 따른 초임계추출장치에 투입하여 초임계추출 후 수득한 시료를 분석하였다.
(1) SDS-Page 분석
초임계추출로 수득한 세포외기질에서 추출 전후의 단백질의 존재 여부를 확인하였다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 초임계추출로 수득한 세포외기질에 대한 SDS Page 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 6을 참조하면, 대조군과 비교하여 초임계추출 후 시료에서 250 kDa 이상의 단백질을 함유하고 있는 것을 확인하였다.
따라서 초임계추출을 통하여 지방조직에서 단백질을 잔류시킬 수 있는 것을 확인하였다.
(2) 총단백질량 확인
추출시간에 따른 세포외기질의 총단백질량을 확인하기 위하여 구아니딘 솔루션(guanidine solution) 및 콜라게나제 솔루션(collagenase solution)으로 처리하여 단백질 함량을 확인하였다.
추출시간 μg/mg
4 시간 661.965
8 시간 656.5738
12 시간 694.687
12 시간 + α 시간 703.2119
표 1은 4 M guanidine-HCl, 10 mM EDTA, 50 mM sodium acetate, 65 mM DTT, protease inhibitor cocktail을 혼합한 구아니딘 솔루션을 가지고 추출시간을 달리하면서 시료를 처리하여 단백질 함량을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 4내지 12 시간 사이에서 모두 유사한 단백질 함량을 나타내는 것을 확인하였다.
추출시간 μg/mg
4 시간 32.2876
8 시간 29.0196
12 시간 43.5294
12 시간 + α 시간 74.3791
표 2는 0.01 %의 콜라게나제 솔루션을 가지고 추출시간을 달리하면서 시료를 처리하여 단백질 함량을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 4 내지 12 시간 사이에서 단백질 함량에 대한 차이가 없으나 12 시간을 초과하는 경우 단백질 함량이 증가되는 것을 확인하였다.
추출시간이 12 시간을 초과하는 경우 시료인 세포외기질에서 지질이 대부분 제거되어 단위 질량 당 단백질의 함량이 크게 증가하는 것을 확인하였다.
(3) DNA량 측정
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 초임계추출 시간에 따른 세포외기질의 DNA 잔존량을 나타낸 그래프이다.
추출시간 DNA 함량(ng/mg)
2 시간 70.72211
6 시간 31.07875
12 시간 35.60731294
추출된 세포외기질을 타가 이식에 사용하는 경우 잔존하는 DNA가 항원으로 작용하여 면역반응을 일으킬 우려가 있으므로, 50 ng/mg 이하 함량으로 조절하는 것이 바람직하다. 상기 도 7 및 상기 표 3은 추출반응 시간에 따른 DNA 함량을 나타낸 것이다.
상기 도 7 및 표 3을 참조하면, 2시간 동안 초임계추출을 진행하는 경우 DNA 함량이 약70 ng/mg으로 확인되었으나, 12 시간 동안 초임계추출을 진행하는 경우 약 35 ng/mg의 DNA 잔존량을 확인하여 DNA 잔존량을 기준값 이하로 유지되는 것을 확인하였다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 초임계추출 시간에 따른 세포외기질의 DNA 잔존량을 나타낸 PCR 증폭 사진이다.
도 8을 참조하면, 2시간 내지12 시간의 추출시간에서 명확한 밴드를 확인할 수 없었으며, 이는 상기 추출시간의 범위에서 DNA 함량이 크게 증가하지 않는 것을 나타낸다.
초임계추출 공정을 통하여 단백질을 농축하여 회수하는 경우에도 잔존하는 DNA값은 크게 증가하지 않으며, 면역반응을 억제할 수 있는 기준값 이하로 세포외기질을 수득할 수 있는 것을 확인하였다.
(4) 유용 단백질 함량
전처리 및 초임계추출 이후에 세포외기질이 함유하는 유용 단백질의 잔존 여부를 확인하였다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 최종 산물의 사진이다.
도 9를 참조하면, 초임계추출에 따라 수분 및 지질이 제거되어 지방조직의 부피가 감소하고 고형화되는 것을 확인하였다.
추출시간 μg/mg
4 시간 1.6846
8 시간 2.8030
12 시간 8.5931
12 시간 + α 시간 39.1225
상기 표 4는 수득한 세포외기질의 초임계추출 시간에 따른 엘라스틴(elastine) 함량을 나타낸 것이다 유용 단백질인 엘라스틴의 함량은 4에서 12 시간까지 증가하였으며, 추출시간이 12 시간을 초과하는 경우 지질이 대부분 제거되어 단위질량 당 단백질이 농축되어 함량이 급격하게 증가하는 것을 확인하였다.
추출시간 μg/mg
4 시간 13.1782
12 시간 27.2586
12 시간 + α 시간 122.7759
상기 표 5는 수득한 세포외기질의 초임계추출 시간에 따른 콜라겐의 함량을 나타낸 것이다. 4에서 12 시간으로 추출시간을 증가시킴에 따라 콜라겐의 함량도 함께 증가하였으며, 12 시간을 초과하여 추출하는 경우 콜라겐의 함량이 급격하게 증가하여 단백질이 농축되는 것을 확인하였다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 수득한 시료의 라미닌에 대한 웨스턴-블랏 사진이고, 도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 수득한 시료의 콜라겐I에 대한 웨스턴-블랏 사진이며, 도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 수득한 시료의 피브로넥틴에 대한 웨스턴-블랏 사진이다.
도 10 내지 도 12를 참조하면, 전처리 및 초임계추출하지 않은 대조군과 비교하여도 초음파 처리 후에도 유용 단백질이 포함되어 있으며, 공용매의 농도를 25 %까지 증가시키는 경우에도 단백질이 잔류하는 것을 확인하였다.
에탄올 공용매는 농도가 증가할수록 멸균 효과가 증가하여 오염을 방지하면서 단백질 함량을 유지할 수 있는 것을 확인하였다.
(5) 성장인자 함량 확인
도 13a 내지 도 13d는 본 발명의 일 실시예에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법에 있어서, 수득한 세포외기질의 성장인자 분석결과이다.
도 13a 내지 도 13d를 참조하면, 전처리와 4 시간 동안 초임계추출을 통하여 수득한 세포외기질에서 bFGF, IGF, NGF및 VEGF의 성장인자를 확인하였으며, 각각 bFGF는 114.595 pg/mL, IGF는 80.389 pg/mL, NGF는 7.174 pg/mL 및 VEGF는 9.63 pg/mL의 함량을 확인하였다.
따라서 세척 및 분쇄를 통한 전처리 과정 및 초임계추출을 통한 지질 제거 후에도 성장인자가 남아 있는 것을 확인하였다.
실험예 3: 세포외기질 함유 드레싱 밴드에 의한 상처 수복
세포외기질이 고분자 지지체에 도포된 드레싱 밴드를 가지고 상처 수복 효과를 확인하였다.
생후 6주령의 수컷 Sprague-Dawley (SD) rat을 동물용 전기제모기(electric clipper)를 이용하여 각 시험군의 등 부위를 제모한 후 피부에 요오드팅크를 사용하여 피부 표피를 소독하고 요추에서 외측으로 2 cm 떨어진 등 양쪽 피부에 외과용 11번 메스를 사용하여 20 mm 의 원형 결손창을 만들어 상처를 유발하였다.
기간(day) 창상
1 변화없음
5 외피 수복
14 피부 수복
도 14는 본 발명의 다른 실시예에 따른 세포외기질을 포함하는 조직 재생용 세포외기질 생체소재로 처리한 렛의 창상치유 과정을 나타낸 사진이다. 상기 표 6 및 도 14를 참조하면, 생체소재로 처리하지 않는 대조군에 비해 실시예 2의 생체소재로 처리한 실험군에서 상처 치유 회복 속도가 증가되는 것을 확인하였으며, 특히 5일 이후에는 외피 수복이 진행되는 것을 확인하여 상용 산화질소계 드레싱밴드에 비하여도 우수한 창상 수복 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법 및 이에 따라 제조된 조직 재생용 세포외기질 생체소재는 동물 또는 인체 유래 지방조직을 대상으로 세척을 통하여 오염을 방지하고, 초음파 처리 및 원심분리 과정을 거쳐 초임계유체를 통한 지질 추출 단계의 추출시간을 매우 감소시켜 세포외기질 추출방법의 효율을 증가시킬 수 있다.
또한 초임계유체를 통하여 추출하되, 일정 이상의 추출시간으로 수득된 세포외기질은 DNA함량이 제한되고 타가 이식 시 면역반응을 억제할 수 있으며, 유용 단백질을 다량으로 포함하고, 성장인자를 그대로 포함하여 전처리 과정 및 초임계추출과정을 통하여 지방조직에서 불필요한 수분 및 지질만을 제거하여 목표물질인 세포외기질을 매우 효과적으로 수득할 수 있는 것을 확인하였다.
또한 인체 유래 지방조직에 대한 탈세포 및 탈지 효과를 나타낼 수 있는 초임계유체 용매의 최적 압력조건을 확인하여 초임계유체 추출방법의 효율을 크게 향상시켰다.
지금까지 본 발명에 따른 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법 및 이에 따라 제조된 조직 재생용 세포외기질 생체소재에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
부호의 설명
1 : 이산화탄소 실린더 2 : 칠러
3 : 액체펌프 4 : 프리히터
5 : 오븐 6 : 추출챔버
7 : 역압 조절기 8 : 트랩챔버
9 : 플로우미터 10 : 공용매챔버
11 : 공용매펌프

Claims (14)

  1. (a) 추출한 지방조직을 반응기에 주입하는 단계;
    (b) 용매를 가압하여 초임계유체를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 초임계유체를 상기 반응기에 투입하여 상기 지방조직에서 세포를 제거하고, 탈지하여 세포외기질을 추출하는 단계;를 포함하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 지방조직은
    동물 또는 인체 유래 지방 조직인 것을 특징으로 하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 가압은
    상기 용매를 200 내지 600 bar로 가압하는 것을 특징으로 하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서
    상기 초임계유체를 18 내지 70 mL/min의 유량으로 상기 반응기에 투입하고, 30 내지 35 ℃에서 2 내지 12시간 반응시키는 것을 특징으로 하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법.
  5. (1) 지방조직을 세척하고 분쇄하여 준비하는 단계;
    (2) 준비된 상기 지방조직을 원심분리 하여 수분과 지질을 제거하여 전처리 하는 단계;
    (3) 이산화탄소 실린더를 배치하고, 상기 이산화탄소 실린더 일측에 공용매챔버를 배치하며, 상기 이산화탄소 실린더에서 배출된 이산화탄소를 가압하여 초임계유체를 제조한 이후에, 상기 공용매챔버에서 배출되는 공용매와 상기 초임계유체를 혼합하여 용매를 제조한 후, 상기 용매를 프리히터를 통하여 예열된 상태로 상기 (2) 단계의 전처리된 지방조직이 배치된 반응기에 투입하여 지방조직 내 세포를 제거하고 탈지하는 단계; 및
    (4) 상기 반응기 일측으로 용매를 배출하고, 반응기 내에 잔류한 세포외기질을 회수하는 단계;를 포함하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 (1) 단계에서
    상기 세척은 탈이온수를 이용하여 세척한 이후 15 내지 20분 동안 정치하여 상기 지방조직 중 혈액을 제거하며,
    상기 세척은 3 내지 5회 수행하는 것을 특징으로 하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 (1) 단계에서
    상기 분쇄는 세척된 지방조직을 400 내지 500 W의 초음파로 6 내지 12 분 동안 처리하는 단계를 더 포함하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 초음파 처리 단계는
    냉각기를 사용하여 2 내지 5 ℃의 범위로 조절되는 것을 특징으로 하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 (2) 단계에서
    상기 원심분리는 4,000 내지 10,000 rpm으로 15 내지 20분 동안 수행되며, 상기 원심분리는 2 내지 5 ℃에서 수행되어 수분과 지질을 제거하는 것을 특징으로 하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 (3) 단계에서
    상기 초임계유체는 상기 용매를 200 내지 600 bar로 가압하여 제조되는 것을 특징으로 하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 (3) 단계에서
    상기 초임계유체를 18 내지 70 mL/min의 유량으로 상기 반응기에 투입하고, 30 내지 35 ℃에서 2 내지 12시간 반응시키는 것을 특징으로 하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법.
  12. 제5항에 있어서,
    상기 (3) 단계에서
    상기 초임계유체를 상기 반응기에 투입하여 지방조직과 반응시키되, 에탄올, 에테르 및 프로판으로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나를 선택하여 공용매로 첨가하는 것을 특징으로 하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 공용매는
    농도가 10 내지 25 %(v/v)인 것을 특징으로 하는 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법.
  14. 추출한 지방조직을 반응기에 주입하고, 용매를 가압하여 초임계유체를 제조하며, 상기 초임계유체를 상기 반응기에 투입하여 상기 지방조직에서 세포를 제거하고, 탈지하여 세포외기질을 추출하여 형성된 조직 재생용 세포외기질 생체소재.
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