KR102452335B1 - 미세 지방이식용 조성물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

미세 지방 이식용 조성물의 제조방법이 개시된다. 본 발명의 지방이식용 조성물은 환자의 조직에서 분리 가공됨에 따라 주입 시 면역반응이 나타나지 않으며, 높은 분산성을 가지고 침전되지 않아 주사를 통한 주입이 가능하다. 초음파 처리를 통해 섬유질층 분리가 효과적이다. 또한, 초음파를 통해 지방조직 내에 존재하는 지방세포를 비롯한 다양한 세포가 자극되어 조직 재생과 관련된 유전자 발현이 증진될 수 있으며 결과적으로 지방이식용 조성물 주입에 따른 높은 재생 효과를 나타낸다.

Description

미세 지방이식용 조성물의 제조방법{Method for preparing a composition for micro fat grafting}

아래 실시예들은 미세 지방이식용 조성물의 제조방법 기술에 관한 것이다.

얼굴 주름, 눈가 주름, 안면 윤곽 등의 성형을 위하여 피검자 자신의 피하지방을 사용한 이식이 성형외과 등에서 통상적으로 행해지고 있다.

이러한 이식에 사용되는 지방 조직에는 지방유래 줄기세포(adipose-derived stem cells, ASCs)가 존재한다. 지방 조직은 많은 양의 조직 채취가 용이하여 줄기세포를 수확하는데 유리하며, ASC는 배양시 안정적인 성장과 증식을 보여주고 분화를 유도하였을 때 골수줄기세포와 같이 다양한 세포로의 분화가 가능하다. 현재 ASC는 지방 조직의 성숙 지방세포, 적혈구 등을 제거한 나머지 기질세포(stromal vascular fraction, SVF, 지방줄기세포)를 분리 배양하여 얻는다. 그러나 이 SVF에는 지방전구세포, 지방모세포 등의 지방세포의 각 분화 단계에 따른 여러 가지 성분들이 포함되어 있다. 이를 위해, 세포막 표면에 존재하는 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 분리하는 방법이 개발되었지만 고비용으로 인하여 제한적이고 대중적으로 사용하기 어려운 단점이 있다. 또한, 인간과 동물의 장기 및 조직에서 생존율과 순도가 높은 세포를 분리하기 위한 방법으로 세포의 크기와 밀도에 기초한 방법들이 활용되고 있는데 제조과정이 복잡하고 시간이 많이 소요되는 단점이 있다.

종래와 같이 피하지방을 채취하여 이식을 수행하는 경우, 피하지방의 채취과정에서 약 50% 이상의 지방세포가 손상될 뿐 아니라, 다양한 크기의 세포 덩어리가 잔존함으로써 이식 부위에 원하는 함량을 정밀하게 이식하는 것이 곤란하고, 피부가 얇고 피하지방이 적은 이식 부위(예를 들어, 눈아래부위 등)에서는 덩어리들이 만져지는 등의 문제가 발생한다. 또한, 피하지방의 덩어리만을 이식한 경우에는 지방 조직 덩어리의 내부에 존재하는 지방세포들이 주변의 환경으로부터 필요한 양분을 받거나 또는 노폐물을 배출하는데 어려움을 겪게 되어 쉽게 괴사하는 문제가 발생한다. 또한, 종래의 지방이식용 조성물을 제조하는 과정은 매우 복잡하고 시간이 많이 소요된다.

얼굴 성형, 상처로 인한 흔적의 제거 등에 사용되는 지방줄기세포와 지방세포는, 채취된 지방 조직을 콜라게네이즈를 이용하여 지방을 분리하고 남은 세포 덩어리에 존재하며, 이를 피하지방 결손 부위의 개선을 목적으로 성형외과 등에서 사용되고 있다. 이러한 지방줄기세포와 지방세포는 지방 조직의 채취과정에서 약 50% 이상의 지방세포가 손상될 뿐 아니라, 효소처리 과정에서도 물리적인 스트레스를 받아 지방세포가 손상되는 등의 문제가 발생하여, 이식 후 피하지방에서의 생착율이 떨어지는 문제점이 있다. 이러한 세포의 활성 감소 및 생착율의 저하 등의 문제는 분리한 성체 지방유래 줄기세포의 세포괴사(necrosis)를 야기할 수 있다.

종래에는 지방 조직으로부터 지방줄기세포를 수득하는 방법에 관하여 등록특허 10-1719743호 등이 공개되어 있으나, 환자의 혈액을 사용하여 분산 안정성이 떨어진다. 특히, 얼굴 부위에 이식을 위해서는 자연스러운 형상이 만들어질 수 있도록 조직 내 재생되는 효과가 중요하나, 종래 제형은 삽입 부위에서 조직 재생 효과가 낮아 자연스러운 형상이 만들어지기 어려운 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 종래의 방법과는 달리 미세이식에 적합한 수준으로 조직 재생 능력이 뛰어나며 높은 분산 안정성을 갖춘 지방이식용 조성물을 고안하여 본 발명을 완성하였다.

실시예들은 얼굴에 자연스러운 지방 이식을 위한 지방이식용 조성물을 제공하고자 한다. 나아가, 주사 주입이 가능하며 분산 안정성이 높은 지방 이식용 조성물을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 지방 이식용 조성물의 제조방법은 아래의 단계를 포함한다:

분리된 지방 조직으로부터 체액 및 혈액을 제거하는 제1단계;

상기 지방조직에 콜라제네이즈를 첨가한 후, 초음파를 가하면서 교반을 통해 섬유질층을 분리하여 SVF (stromal vascular fraction)를 수득하는 제2단계; 및

상기 SVF을 원심분리하여 기름을 제거하여 지방세포 및 지방줄기세포 혼합물을 수득하는 제3단계.

일 예에 따르면, 제2단계에서 상기 지방조직은 Tris 완충액 하에서 콜라제네이즈와 혼합되는 것이고, 상기 초음파는 0.3 내지 0.7 W/cm²의 강도 및 5 내지 10kHz의 주파수로 가해지는 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 Tris 완충액은 Tris를 0.03 내지 0.07M 포함할 수 있다. 상기 콜라제네이즈는 상기 지방조직에 0.1 내지 0.3 중량%일 수 있다. 상기 교반은 20 내지 40분간 행해지고, 상기 초음파는 처음 10 내지 20분간 가해지는 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 상기 지방세포 및 지방줄기세포 혼합물에 히알루론산, 키토산, 및 생리식염수를 혼합하는 제4단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

일 예에 따르면, 제4단계에서 상기 지방세포 및 지방줄기세포 혼합물, 히알루론산, 키토산, 및 생리식염수의 부피비는 10: 3 내지 5: 0.5 내지 2: 4 내지 6일 수 있다. 상기 히알루론산은 Mw 200,000 내지 400,000의 1 내지 3 중량% 일 수 있다. 상기 키토산은 Mw 30,000 내지 70,000의 1 내지 3 중량%일 수 있다. 상기 생리식염수는 글리신 0.02 내지 0.04 M, L-프롤린 0.01 내지 0.03 M, L-아르기닌 0.01 내지 0.03M, L-류신 0.01 내지 0.03M 포함하는 것일 수 있다.

일실시예에 따른 장치는 하드웨어와 결합되어 상술한 방법들 중 어느 하나의 항의 방법을 실행시키기 위하여 매체에 저장된 컴퓨터 프로그램에 의해 제어될 수 있다.

실시예에 따라 제조된 지방이식용 조성물은 환자의 조직에서 분리 가공됨에 따라 주입 시 면역반응이 나타나지 않으며, 높은 분산성을 가지고 침전되지 않아 주사를 통한 주입이 가능하다. 나아가, 제2단계에서 초음파 자극을 통해 섬유질층 분리가 효과적일 수 있다. 또한, 초음파를 통해 지방조직 내에 존재하는 지방세포를 비롯한 다양한 세포가 자극되어 조직 재생과 관련된 유전자 발현이 증진될 수 있으며 결과적으로 지방이식용 조성물 주입에 따라 높은 재생 효과를 나타낸다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

실시예들에 대한 특정한 구조적 또는 기능적 설명들은 단지 예시를 위한 목적으로 개시된 것으로서, 다양한 형태로 변경되어 실시될 수 있다. 따라서, 실시예들은 특정한 개시형태로 한정되는 것이 아니며, 본 명세서의 범위는 기술적 사상에 포함되는 변경, 균등물, 또는 대체물을 포함한다.

제1 또는 제2 등의 용어를 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 이런 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 해석되어야 한다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소는 제1 구성요소로도 명명될 수 있다.

어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명의 실시예들에서, 별도로 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명의 실시예에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명의 실시예를 설명하기 위한 도면에 개시된 형상, 크기, 비율, 각도, 개수 등은 예시적인 것이므로 본 발명이 도시된 사항에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 본 명세서 상에서 언급된 '포함한다', '갖는다', '이루어진다' 등이 사용되는 경우 '~만'이 사용되지 않는 이상 다른 부분이 추가될 수 있다. 구성 요소를 단수로 표현한 경우에 특별히 명시적인 기재 사항이 없는 한 복수를 포함하는 경우를 포함한다.

구성 요소를 해석함에 있어서, 별도의 명시적 기재가 없더라도 오차 범위를 포함하는 것으로 해석한다.

도면에서 나타난 각 구성의 크기 및 두께는 설명의 편의를 위해 도시된 것이며, 본 발명이 도시된 구성의 크기 및 두께에 반드시 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 여러 실시예들의 각각 특징들이 부분적으로 또는 전체적으로 서로 결합 또는 조합 가능하며, 당업자가 충분히 이해할 수 있듯이 기술적으로 다양한 연동 및 구동이 가능하며, 각 실시예들이 서로에 대하여 독립적으로 실시 가능할 수도 있고 연관 관계로 함께 실시 가능할 수도 있다.

본원에 따른 지방이식용 조성물의 제조방법은 다음의 단계를 포함한다:

분리된 지방 조직으로부터 체액 및 혈액을 제거하는 제1단계;

상기 지방조직에 콜라제네이즈를 첨가한 후, 초음파를 가하면서 교반을 통해 섬유질층을 분리하여 SVF (stromal vascular fraction)를 수득하는 제2단계; 및

상기 SVF을 원심분리하여 기름을 제거하여 지방세포 및 지방줄기세포 혼합물을 수득하는 제3단계.

본원에서 지방이식용 조성물은 지방이 신체 내에 이식될 수 있는 부위라면 어디든 사용될 수 있으나, 특히 눈 주름, 얼굴 주름, 이마 등 안면 윤곽을 형성하기 위한 부위에 특별히 바람직하다. 안면 부위는 자연스러운 지방층 형성이 요구되는데, 본 발명의 지방 이식용 조성물은 지방(기름층)이 제거되고 지방세포 및 지방줄기세포를 높은 함량으로 함유함에 따라, 지방층의 체내 재생을 유도하여 목적하는 효과를 달성할 수 있다.

본 발명에서 지방이식용 조성물이란 지방세포 및 지방줄기세포를 주 성분으로 포함하며, 히알루론산이나 키토산 등의 안정화제, 및 생리식염수를 주요한 구성으로 한다. 특히, 지방줄기세포와 지방세포를 동시에 포함할 경우, 이식과 동시에 지방세포로 인한 이식부위 부피의 증가를 달성할 수 있어 성형효과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 지방줄기세포들이 지방세포로 분화, 성장할 수 있어 이식부위의 부피성장을 도모할 수 있다.

제1단계에서 분리된 지방 조직은 지방이식용 조성물이 투입될 해당 환자로부터 지방 흡인을 통해 제거되는 것일 수 있다. 상기 지방 조직은 생리 완충액을 이용한 반복세척을 통해 체액 및 혈액이 제거될 수 있다.

제2단계에 사용되는 지방조직은 콜라네이즈 첨가에 의해 섬유질층이 분리될 수 있다. 상기 콜라게네이즈는 콜라겐의 가수분해를 촉진하는 효소로서, 섬유질의 콜라겐을 분해하여 지방줄기세포를 분리시키는 역할을 한다. 상기 콜라게네이즈는 시판중인 콜라게네이즈를 이용할 수 있으며, 그 예로써 NB4 효소가 사용될 수 있다.

상기 콜라제네이즈에 의한 섬유질층 분리는 초음파 처리와 함께 진행될 수 있다. 이에 따라, 초음파는 지방세포를 비롯한 다양한 세포를 자극하고 이로 인해 조직 재생과 관련된 성장인자나 사이토카인 등의 분비가 촉진될 수 있다. 이는 결과적으로 본 발명의 지방이식용 조성물이 환자의 몸에 이식되어 지방조직 재생이 용이하도록 할 수 있다.

제2단계에서 상기 지방조직은 Tris 완충액 하에서 콜라제네이즈와 혼합되는 것일 수 있다. Tris 완충액은 Tris [즉, tris(hydroxymethyl)aminomethane]를 포함하는 완충액으로서, 보다 구체적으로 Tris를 0.03 내지 0.07M (구체적으로, 0.04 내지 0.06M) 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, Tris를 0.05M 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 완충액은 NaCl를 0.138 M 및 KCl을 0.0027 M포함할 수 있다. 상기 Tris 완충액은 pH를 7.8 내지 8.2를 가질 수 있으며, 이에 따라 콜라제네이즈의 활성을 극대화할 수 있다.

제2단계에서 상기 콜라제네이즈는 상기 지방조직을 기준으로 0.1 내지 0.3 중량%로 포함될 수 있다. 제2단계에서 교반은 20분간 내지 60분간, 구체적으로 20 내지 40분간 행해질 수 있다. 이 중에 초음파는 처음 10 내지 20분간 가해지는 것일 수 있다.

제2단계를 통해 섬유질층이 분리되면 원심분리를 통해 SVF(stromal vascular fraction: 기질혈관분획)를 수득할 수 있다. SVF는 섬유모세포, 면역세포, 미세혈관 내피세포, 근육세포, 및 지방전구 세포 등의 다양한세포가 존재하며, 지방과 함께 지방세포와 지방줄기세포도 존재한다.

제3단계를 통해 지방을 걸러내고 지방세포 및 지방줄기세포의 혼합물을 수득한다. 상기 혼합물은 지방세포 및 지방줄기세포가 주로 구성되나 다른 세포들도 미량 포함될 수는 있다.

제4단계는 상기 지방세포 및 지방줄기세포 혼합물에 히알루론산, 키토산, 및 생리식염수를 혼합하는 단계로 추가로 포함될 수 있다.

히알루론산 및 키토산은 생분해성 안정화제로 사용된다. 상기 이식-세포를 안정하게 분산시키기 위한 안정화제로서 생체 유래물질이어서 체내 이식 시 부작용이 없으며 생분해성을 가져야 한다. 본 발명에서 생분해성이라 함은 체내에서 서서히 분해되어 흡수되는 특성을 의미하며 특별히 분해되는 속도에는 의미를 두지 않는다. 상기 히알루론산 및 키토산은 지방세포 및 지방줄기세포의 혼합물이 안정되게 분산될 수 있는 점도를 부여할 수 있도록 농도 및 중량평균분자량을 선택할 수 있다.

제4단계에서 상기 지방세포 및 지방줄기세포 혼합물, 히알루론산, 키토산, 및 생리식염수의 부피비는 10: 3 내지 5: 0.5 내지 2: 4 내지 6일 수 있다. 상기 히알루론산은 Mw 200,000 내지 400,000의 1 내지 3 중량%일 수 있으며, 구체적으로Mw 250,000 내지 350,000의 1.5 내지 2.5 중량%일 수 있다. 상기 키토산은 Mw 30,000 내지 70,000의 1 내지 3 중량%일 수 있으며, 구체적으로 Mw 40,000 내지 60,000의 1.5 내지 2.5 중량%일 수 있다.

상기 생리식염수는 체액의 삼투압과 유사한 삼투압을 갖도록 하는데 사용된다.

상기 생리식염수는 아미노산을 포함할 수 있으며, 구체적으로 글리신 0.02 내지 0.04 M, L-프롤린 0.01 내지 0.03 M, L-아르기닌 0.01 내지 0.03M, L-류신 0.01 내지 0.03M 포함할 수 있다. 상기 아미노산 첨가에 따라 분산성을 높일 뿐만 아니라 세포 노화 방지 및 체내 주입에 따른 조직 적합성을 높일 수 있다.

본 발명의 지방이식용 조성물은 주사제로 사용될 수 있다. 이를 위해 통상적으로 사용되는 주사 바늘을 투과하는데 문제가 없다.

이하, 구체적인 실시예와 비교예를 통하여 본 발명의 구성 및 그에 따른 효과를 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 지방 이식용 조성물의 제조

(1) 지방 조직의 채취

피하지방 제거 시술을 받은 환자로부터 동의를 얻고, 해당 환자로부터 지방흡인(liposuction)방법을 통하여 제거되어 버려지는 지방조직을 수거하였다. 수거한 지방조직은 약 100 g정도씩 프로세싱 백에 옮겨 생리완충액을 가하여 체액과 혈액 부분을 제거하는 과정을 생리완충액으로 3회 반복하고, 체액과 혈액이 제거된 지방조직을 수거하였다. 상기 과정을 통해 얻어진 지방조직은 지방세포들이 균질화 되어 있지 않고 알알이 뭉쳐 있어, 주입용 주사바늘의 통과가 곤란하다.

(2) 지방 세포 및 지방 줄기세포의 분리

상기 체액과 혈액이 제거된 지방조직 10g에 0.2 중량%의 콜라제네이즈를 가하여 Tris-완충액(0.05 M Tris buffered saline (NaCl - 0.138 M; KCl - 0.0027 M); pH 8.0 at 25℃) 20mL에 담갔다. 상기 혼합물에 0.5W/cm²의 강도 및 8 kHz의 주파수의 초음파를 가하면서, 37℃의 온도에서 15분간 교반하였다. 이후 초음파 작동을 멈춘 후 15분 추가로 교반하였다. 상기 과정에 의해 섬유질층이 분리된다. 상기 혼합물을 원심분리하여 상층액으로서 SVF를 분리하였으며, SVF를 다시 원심분리하여 기름을 제거하였다.

(3) 지방 이식용 조성물의 제조

상기 지방세포 및 지방 줄기세포 혼합물10mL에 Mw 300,000 의 2 중량% 의료용 생체주입용 히알루론산 4 mL, Mw 50,000의 2 중량% 키토산 1mL, 및 아미노산 혼합 생리식염수(글리신 0.03 M, L-프롤린 0.02 M, L-아르기닌 0.02M, L-류신 0.02M) 5mL 를 혼합하여 지방이식용 조성물을 수득하였다.

비교예 1.

상기 실시예 1과 동일하게 지방세포 및 지방 줄기세포 혼합물을 제조하였다. 지방세포 및 지방 줄기세포 혼합물 10mL에 환자의 혈액으로부터 분리한 혈장용액 5mL, SVF로부터 분리된 기름 5mL를 혼합하여 지방이식용 조성물을 수득하였다.

비교예 2.

상기 실시예 1과 동일하게 지방세포 및 지방 줄기세포 혼합물을 제조하였다. 지방세포 및 지방 줄기세포 혼합물 10mL에 생리식염수 5mL, Mw 300,000 의 2 중량% 의료용 생체주입용 히알루론산 5 mL를 혼합하여 지방이식용 조성물을 수득하였다.

실험예 1. 분산 안정성 평가

실시예 1, 비교예 1, 및 비교예 2의 지방이식용 조성물의 분산 안정성을 평가하기 위해 상기 조성물들을 실온에서 보관하며 층 분리가 일어나는 시간을 측정하였다. 비교예 1의 경우 1시간 이내에 층이 분리되며 아래층에 지방세포/지방줄기세포가 침전되었으며, 비교예 2의 경우 24시간 경과 후에 아래층에 지방세포/지방줄기세포가 침전되는 것으로 나타났다. 실시예 1의 경우 24시간 경과 후에도 지방세포/지방줄기세포가 침전되지 않아 분산 안정성이 가장 뛰어나게 나타났다.

실험예 2. 이식 효과

상기 실시예 1의 지방이식용 조성물을 10명의 피검자에게 눈 밑 주름 및 이마에 이식하고, 면역거부 반응이 있는지, 지방 조직이 뭉쳐지는지, 지방 층의 재생이 나타나는지 여부를 확인하였다.

본 발명의 지방 이식용 조성물을 이식한 결과, 면역 거부 반응이 전혀 나타나지 않았으며, 지방 조직이 뭉쳐지는 현상이 전혀 나타나지 않았다. 나아가, 초기 투여된 지방 조직으로부터 지방층의 재생이 나타나 자연스러운 형상이 나타남을 확인할 수 있었다.

Claims (3)

1. 분리된 지방 조직으로부터 체액 및 혈액을 제거하는 제1단계;
   상기 지방조직에 콜라제네이즈를 첨가한 후, 초음파를 가하면서 교반을 통해 섬유질층을 분리하여 SVF (stromal vascular fraction)를 수득하는 제2단계; 및
   상기 SVF을 원심분리하여 기름을 제거하여 지방세포 및 지방줄기세포 혼합물을 수득하는 제3단계를 포함하는,
   지방이식용 조성물의 제조방법으로서,
   제2단계에서 상기 콜라제네이즈는 상기 지방조직을 기준으로 0.1 내지 0.3 중량%로 포함되며, 상기 지방조직은 Tris를 0.03 내지 0.07M 포함하는 Tris 완충액 하에서 콜라제네이즈와 혼합되는 것이고, 상기 초음파는 0.3 내지 0.7 W/cm2의 강도 및 5 내지 10 kHz의 주파수로 가해지는 것이며, 상기 교반은 20 내지 40분간 행해지되, 상기 초음파는 처음 10 내지 20분간 가해지는 것이고,
   상기 지방세포 및 지방줄기세포 혼합물에 히알루론산, 키토산, 및 생리식염수를 혼합하는 제4단계를 추가로 포함하며, 상기 지방세포 및 지방줄기세포 혼합물, 히알루론산, 키토산, 및 생리식염수의 부피비는 10: 3 내지 5: 0.5 내지 2: 4 내지 6이고,
   상기 히알루론산은 Mw 200,000 내지 400,000의 1 내지 3 중량%이며,
   상기 키토산은 Mw 30,000 내지 70,000의 1 내지 3 중량%이며,
   상기 생리식염수는 글리신 0.02 내지 0.04 M, L-프롤린 0.01 내지 0.03 M, L-아르기닌 0.01 내지 0.03M, L-류신 0.01 내지 0.03M 포함하는 것인, 지방이식용 조성물의 제조방법.
   
   
   
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