CN111714698A - 含有细胞的生物凝胶组合物、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医用材料领域，特别涉及含有细胞的生物凝胶组合物、其制备方法及应用。本发明的方法建立的复合脂肪细胞的生物凝胶组合物，与现有生理盐水携带脂肪细胞移植相比，由于含有多种细胞因子且具有良好的温度敏感性，其携带脂肪细胞移植到体内之后，能够在数分钟内由液态转变为凝胶态，从而使脂肪细胞驻留在注射部位不流失，同时能够保持脂肪细胞的活性。本发明为整形修复外科的基础研究与临床应用提供新的注射移植系统。

Description

含有细胞的生物凝胶组合物、其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，特别涉及含有细胞的生物凝胶组合物、其制备方法及应用。
背景技术
临床上由于先天畸形、外伤、肿瘤切除术以及美容需求等原因导致的软组织缺损的修复是整形修复外科面临的最常见问题。为解决上述问题，胶原注射、真皮移植、人工合成材料以及游离脂肪组织移植等都被广泛应用于临床实践中。目前临床上常用的软组织缺损填充材料众多，包括胶原蛋白、透明质酸、聚丙烯酰胺水凝胶、聚乳酸等属于异体来源生物材料，由于此类材料存在排斥反应的风险，且易感染或移位，限制了其临床应用。
自体脂肪移植是指通过吸脂获取颗粒性脂肪组织，并将其注入局部软组织以改善受区软组织畸形的一种整形方法。由于自体脂肪来源充足，无免疫排斥，含有干细胞，具有组织再生功能，且移植方法相对简单，因此目前已广泛应用于软组织缺损修复、乳房再造、面部年轻化等整形方面的治疗。但是，由于自体脂肪移植存在成活率低且不稳定的问题而影响临床效果，因此，如何保证自体脂肪移植稳定的高成活率是目前该方面研究的热点之一。
脂肪细胞移植存活率低的主要原因之一是移植后由于注射部位血管化不足，脂肪细胞缺血缺氧而死亡。由于脂肪细胞的耐缺血能力较差，失去了原有微血管结构的脂肪组织颗粒移植物，在与受区重新建立血运以前，常因局部血浆营养不足而发生脂肪细胞坏死等系列并发症。
针对这一问题，目前临床常利用多点注射的手段，即通过减少移植物的体积，增加注射位点的数量来提高脂肪细胞移植的存活率，然而该方法要求多层次、多点注射，不仅人为增加了对患者的损伤，而且增加了损伤血管、神经甚至血管栓塞的风险。因此，在自体脂肪细胞移植后，如何建立充分和及时的血供，促进移植物及时的再血管化是影响其成活的关键，也是减少其纤维囊性变的关键。
通过组织工程的策略与手段，利用生物支架材料模拟组织的三维微环境，携带脂肪细胞移植，有望促进移植区域的血管化进而有效提高移植细胞的存活。可注射性支架材料是携带细胞的载体，在可注射性组织工程中起着携带细胞、促进细胞在体内移植区域滞留及调控其生物学功能等作用。近年来本领域研究进展迅速。目前用于可注射性组织工程的支架材料主要有纤维蛋白胶、壳聚糖水凝胶、藻酸盐凝胶、基底膜基质胶(Matrigel)、胶原与人工合成高分子水凝胶材料等。然而，上述材料存在降解时间过短、细胞相容性有限、不能够很好的调控细胞功能等问题。因此，开发具有良好生物相容性的新型可注射性支架材料已成为可注射脂肪组织工程领域的关键点。不仅如此，在产业化方面，目前可注射类产品已进入重大产业革命时期，即从传统的不可吸收材料向可降解的、能够主动诱导组织再生的新型生物材料变革。
脱细胞技术的出现为开发新型可注射性支架材料指出了新的方向。利用脱细胞技术去除组织中各种细胞成分以及遗传物质而获得的天然生物支架材料即为脱细胞基质材料。大网膜是腹膜的一种，是存在于高等动物腹腔中的一层黏膜，是由结缔组织形成的膜状组织。大网膜是连接胃大弯至横结肠的腹膜。大网膜富有极强的弹性以及高度血管化的结构，这些优点使其在组织工程与再生医学领域中具有广泛的应用前景。然而，目前还未见利用网膜脱细胞基质生物凝胶为载体联合脂肪细胞建立生物凝胶注射移植系统，并应用于提高脂肪细胞驻留与存活的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了含有细胞的生物凝胶组合物、其制备方法及应用。该含有细胞的生物凝胶组合物能够维持细胞特别是脂肪细胞移植后的驻留与存活，且该系统具有构建方法简单，效果明显的优势。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了含有细胞的生物凝胶组合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：取网膜经清洗、脱细胞、消化后制得生物凝胶；
步骤2：取细胞接种至所述生物凝胶，制得含有细胞的生物凝胶组合物；
所述脱细胞包括化学脱细胞、生物脱细胞和/或物理脱细胞；所述化学脱细胞的试剂包括十二烷基硫酸钠；所述生物脱细胞的试剂包括DNA酶；所述物理脱细胞包括震荡；
所述消化包括生物消化和/或物理消化；所述生物消化的试剂包括消化酶溶液，所述物理消化包括搅拌。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述脱细胞采用含十二烷基硫酸钠与DNA酶的缓冲液浸泡所述网膜，震荡；所述脱细胞包括第一脱细胞和第二脱细胞；
所述第一脱细胞的缓冲液中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5～3.5％重量比、优选1.5～2.5％重量比、更优选1.8～2.2％重量比、最优选2.0％重量比；DNA 酶的浓度为3500～4500U/L、优选3600～4400U/L、更优选3800～4200U/L、最优选4000U/L，pH为7.2～7.4；
所述第二脱细胞的缓冲液中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.6～1.5％重量比、优选0.7～1.3％重量比、更优选0.8～1.2％重量比、最优选1.0％重量比；DNA 酶的浓度为2500～3500U/L、优选2600～3400U/L、更优选2800～3200U/L、最优选3000U/L，pH为7.2～7.4。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述脱细胞还包括第三脱细胞；所述第三脱细胞的缓冲液中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1～0.6％重量比、优选0.2～0.6％重量比、更优选0.4～0.6％重量比、最优选0.5％重量比；DNA 酶的浓度为1500～2500U/L、优选1600～2400U/L、更优选1800～2200U/L、最优选2000U/L，pH为7.2～7.4。
在本发明的一些具体实施方案中，所述脱细胞的时间为4～12h，所述脱细胞的震荡频率为100～200r/min。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述清洗采用磷酸盐缓冲液；所述消化为：取脱细胞后的网膜基质与消化液混合，搅拌，终止消化；以g/mL 计，脱细胞后的网膜基质与消化液的重量体积比为(10～20)：100；
所述消化液包括胰酶、胶原酶、dispaseII和PBS溶液；
其中，胰酶、胶原酶、dispaseII的质量比为2：2：(1～2)；
胰酶的酶活为6000～8000BAEE units/mg；胶原酶的酶活为125～150 CDU/mg；dispaseII的酶活为10～20units/mg；胰酶、胶原酶与dispaseII在 PBS溶液的浓度分别为0.05～0.25％，pH为7.2～7.4。
在本发明的一些具体实施方案中，所述搅拌的转速为60～100rpm，所述消化为于37℃，5％CO2消化30～45min；所述终止消化采用血清，血清与消化液的体积比为(1～2)：10。
在本发明的一些具体实施方案中，所述脱细胞之前还包括脱脂的步骤；所述脱脂包括化学脱脂和/或物理脱脂；所述化学脱脂采用体积比为1：1：(0.2～1)、优选1：1：(0.4～0.7)、更优选1：1：0.5的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液进行，所述化学脱脂的时间为18～30h；所述物理脱脂采用震荡的方法；所述震荡的频率为150～250r/min。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述制得生物凝胶为调整浓度为10～20mg/mL，于37℃5～10min，即得所述生物凝胶；
步骤2中细胞的接种密度为5×106～5×107个/mL。
具体的，本发明提供的含有细胞的生物凝胶组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)脱脂溶液的配制
将甲醇、氯仿与乙醚以体积比为1：1：0.2-1的比例混匀；
(2)脱细胞液的配制
1)脱细胞液I：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为1.5-3.5％重量比，DNA酶在磷酸盐缓冲液中的浓度为3500-4500U/L,pH为7.2-7.4，过滤除菌；
2)脱细胞液II：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.6-1.5％重量比，DNA 酶在PBS中的浓度为2500-3500U/L,pH为7.2-7.4，过滤除菌；
3)脱细胞液III：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1-0.6％重量比，DNA 酶在PBS中的浓度为1500-2500U/L,pH为7.2-7.4，过滤除菌；
(3)网膜脱细胞基质消化液的制备
将胰酶、胶原酶、dispaseII以质量比2：2：1-2的比例溶于PBS溶液中，其中，胰酶、胶原酶与dispaseII在PBS溶液的浓度均为0.05-0.25％，完全溶解后，调解pH至7.2-7.4，获得网膜脱细胞基质消化液。
(4)大网膜脱细胞处理
1)取新鲜的大网膜组织，于磷酸盐缓冲液中清洗，将清洗后的组织震荡浸泡于所述脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18-30h，震荡频率为 150-250r/min；
2)将去除脂肪的所述大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于所述脱细胞液I中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min；
3)将经脱细胞液I处理后的所述大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于脱细胞液II中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min；
4)将经脱细胞液II处理后的大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于所述脱细胞液III中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min；
5)PBS洗净，获得网膜脱细胞基质。
(5)网膜脱细胞基质生物凝胶的制备
将清洗并剪碎的网膜脱细胞基质加入到含有上述消化液的消化瓶中，每 100毫升消化液加入10-20克网膜脱细胞基质，加盖后放在磁力搅拌器上进行搅动，转速为60-100rpm，于37℃，5％CO2的孵箱中消化30-45min(消化时间根据消化酶浓度不同适当调节)，然后以血清终止消化反应，其中，血清与消化液的体积比为1-2：10。收集消化液，获得液态网膜脱细胞基质生物凝胶。将网膜脱细胞基质浓度调整为10-20mg/mL，在37℃环境下5-10分钟即可形成凝胶状网膜脱细胞基质生物凝胶。其中，所述消化瓶中装有磁力搅拌转子。
(6)含有细胞的生物凝胶组合物的制备
将5×106-5×107的皮肤成纤维细胞用1mL上述液态网膜脱细胞基质生物凝胶重悬，即可获得脂肪细胞密度为5×106-5×107/mL的含有细胞的生物凝胶组合物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述网膜来源于哺乳动物；所述细胞包括皮肤成纤维细胞、脂肪细胞、脂肪间充质干细胞、软骨细胞或心肌细胞中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述网膜包括大网膜或小网膜。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的制备方法制得的含有细胞的生物凝胶组合物。
更重要的是，本发明还提供了所述的含有细胞的生物凝胶组合物在制备医用材料中的应用。
本发明的方法建立的复合脂肪细胞的生物凝胶组合物，与现有生理盐水携带脂肪细胞移植相比，由于含有多种细胞因子且具有良好的温度敏感性，其携带脂肪细胞移植到体内之后，能够在数分钟内由液态转变为凝胶态，从而使脂肪细胞驻留在注射部位不流失，同时能够保持脂肪细胞的活性。本发明为整形修复外科的基础研究与临床应用提供新的注射移植系统。
具体实施方式
本发明公开了复合细胞的生物凝胶组合物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本申请中，缩写词的含义如下：
SDS：十二烷基硫酸钠；
PBS：磷酸盐缓冲液；
DNA酶：脱氧核糖核酸酶；
mRFP：红色荧光蛋白；
min：分钟。
根据本发明的一个方面，提供了复合脂肪细胞的生物凝胶注射移植系统的制备方法，注射移植系统包括网膜脱细胞基质生物凝胶以及复合在生物凝胶中的脂肪细胞。
其包括使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶的缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤。
在某些实施方案中，在进行脱细胞处理的步骤中还进行震荡。
在某些实施方案中，还包括脱脂处理的步骤。在示例性实施方案中，脱脂处理的步骤在脱细胞处理的步骤之前进行。在某些优选的实施方案中，该脱脂处理的步骤使用体积比为1：1：0.2-1的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液进行。在某些更优选的实施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的体积比为1：1：0.4-0.7。在最优选的实施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的体积比为1：1：0.5。
在某些实施方案中，脱细胞处理的步骤是分梯度进行的，所述梯度包括至少第一梯度和第二梯度。
在某些优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为 1.5-3.5％重量比，DNA酶的浓度为3500-4500U/L，pH为7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5-2.5％重量比， DNA酶的浓度为3600-4400U/L。在某些更优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.8-2.2％重量比，DNA酶的浓度为3800-4200U/L。在最优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为2.0％重量比，DNA酶的浓度为4000U/L。
在某些优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为 0.6-1.5％重量比，DNA酶的浓度为2500-3500U/L，pH为7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.7-1.3％重量比， DNA酶的浓度为2600-3400U/L。在某些更优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.8-1.2％重量比，DNA酶的浓度为2800-3200U/L。在最优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.0％重量比，DNA酶的浓度为3000U/L。
在某些优选的实施方案中，所述梯度还包括第三梯度，其中在所述第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1-0.6％重量比，DNA酶的浓度为 1500-2500U/L，pH为7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.2-0.6％重量比，DNA酶的浓度为1600-2400U/L。在某些更优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为 0.4-0.6％重量比，DNA酶的浓度为1800-2200U/L。在最优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.5％重量比，DNA酶的浓度为 2000U/L。
根据本发明的另一方面，提供了复合脂肪细胞的生物凝胶注射移植系统的制备方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行：
(1)脱脂溶液的配制
将甲醇、氯仿与乙醚以体积比为1：1：0.2-1的比例混匀；
(2)脱细胞液的配制
1)脱细胞液I：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为1.5-3.5％重量比，DNA酶在磷酸盐缓冲液中的浓度为3500-4500U/L,pH为7.2-7.4，过滤除菌；
2)脱细胞液II：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.6-1.5％重量比，DNA 酶在PBS中的浓度为2500-3500U/L,pH为7.2-7.4，过滤除菌；
3)脱细胞液III：称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1-0.6％重量比，DNA 酶在PBS中的浓度为1500-2500U/L,pH为7.2-7.4，过滤除菌；
(3)网膜脱细胞基质消化液的制备
将胰酶、胶原酶、dispaseII以质量比2：2：1-2的比例溶于PBS溶液中，其中，胰酶、胶原酶与dispaseII在PBS溶液的浓度均为0.05-0.25％，完全溶解后，调解pH至7.2-7.4，获得网膜脱细胞基质消化液。
(4)大网膜脱细胞处理
1)取新鲜的大网膜组织，于磷酸盐缓冲液中清洗，将清洗后的组织震荡浸泡于所述脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18-30h，震荡频率为 150-250r/min；
2)将去除脂肪的所述大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于所述脱细胞液I中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min；
3)将经脱细胞液I处理后的所述大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于脱细胞液II中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min；
4)将经脱细胞液II处理后的大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于所述脱细胞液III中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min；
5)PBS洗净，获得网膜脱细胞基质。
(5)网膜脱细胞基质生物凝胶的制备
将清洗并剪碎的网膜脱细胞基质加入到含有上述消化液的消化瓶中，每 100毫升消化液加入10-20克网膜脱细胞基质，加盖后放在磁力搅拌器上进行搅动，转速为60-100rpm，于37℃，5％CO2的孵箱中消化30-45min(消化时间根据消化酶浓度不同适当调节)，然后以血清终止消化反应，其中，血清与消化液的体积比为1-2：10。收集消化液，获得液态网膜脱细胞基质生物凝胶。将网膜脱细胞基质浓度调整为10-20mg/mL，在37℃环境下5-10分钟即可形成凝胶状网膜脱细胞基质生物凝胶。其中，所述消化瓶中装有磁力搅拌转子。
(6)复合脂肪细胞的生物凝胶注射移植系统的制备
将5×106-5×107的皮肤成纤维细胞用1mL上述液态网膜脱细胞基质生物凝胶重悬，即可获得脂肪细胞密度为5×106-5×107/mL的复合脂肪细胞的生物凝胶注射移植系统。
在某些实施方案中，新鲜的大网膜组织来源于猪、牛、羊等哺乳类动物。
在本申请中，大网膜组织是可商购的，可以购自例如屠宰场。
根据本发明的另一方面，提供了根据上述方法获得的复合脂肪细胞的生物凝胶注射移植系统。
现将通过以下实施例对本发明做详细描述，然而以下实施例仅仅是作为例证，并不对本发明构成任何限制。
以下实施例中使用的大网膜脱细胞处理及其鉴定所需试剂的配制：
1)PBS：称取8gNaCl，0.2g KCl，3.491gNa2HPO4·12H2O，0.2g KH2PO4，溶解于1L超纯水中，调节pH值为7.2-7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃保存。
2)脱脂溶液：将400mL甲醇、400mL氯仿与200mL乙醚混匀。
3)脱细胞液I：称取20g SDS溶解于PBS中，添加DNA酶并定容于1L，使DNA酶浓度达到4000U/L,调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。
4)脱细胞液II：称取10g SDS溶解于PBS中，添加DNA酶并定容于1L，使DNA酶浓度达到3000U/L,调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。
5)脱细胞液III：称取5g SDS溶解于PBS中，添加DNA酶并定容于1L，使DNA酶浓度达到2000U/L,调节pH至7.2-7.4，过滤除菌后常温保存。
6)网膜脱细胞基质消化液：将胰酶0.05克、胶原酶0.1g、Dispase II 0.1 克，溶解于100mLPBS溶液中，调节pH值为7.2-7.4，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。使用前现配制，用于网膜脱细胞基质的消化。
7)消化瓶：200mL有盖柱形玻璃瓶，内置一个的磁力搅拌器用转子(直径×长：6×20mm)。
本发明提供的复合脂肪细胞的生物凝胶组合物中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1小型猪来源大网膜的脱细胞处理
取新鲜的小型猪腹膜大网膜组织(购自屠宰场)，于PBS中清洗3遍。将清洗后的组织震荡浸泡于2L脱脂溶液中处理24h，震荡频率为200r/min。随后，将去除脂肪的大网膜组织于PBS中清洗3遍，并震荡浸泡于1L脱细胞液I中处理8h，震荡频率为150r/min。随后，将经脱细胞液I处理后的大网膜组织于PBS中清洗3遍，并震荡浸泡于1L脱细胞液II中处理8h，震荡频率 150r/min。随后，将经脱细胞液II处理后的大网膜组织于PBS中清洗3遍，并震荡浸泡于1L脱细胞液III中处理8h，震荡频率为150r/min。最后，将经脱细胞液III处理后的大网膜组织经PBS洗净，4℃保存。
实施例2网膜脱细胞基质生物凝胶的制备
将清洗并剪碎的网膜脱细胞基质10g加入到含有上述消化液的消化瓶中，随后加入100毫升消化液，加盖后放在磁力搅拌器上以100rpm的转速进行搅动，磁力搅拌器和消化瓶一同置于37℃孵箱中，连续消化30-45min，然后加入2mL血清终止消化反应，其中，血清与消化液的体积比为0.1-0.2： 10。收集消化液，获得液态网膜脱细胞基质生物凝胶。将网膜脱细胞基质浓度调整为20mg/mL，在37℃环境下5-10分钟即可形成凝胶状网膜脱细胞基
实施例3脂肪细胞的分离与培养
取200g左右雄性SD大鼠，无菌条件下取出大鼠腹股沟处脂肪组织，PBS 冲洗三遍，以剪刀将脂肪组织充分剪碎(<1mm3)，添加0.1％胶原酶I+0.05％胰酶，37℃搅拌60min，终止消化后，以200目筛网过滤消化液，600-800g 离心5-8min，去上清液，加入培养基制备细胞悬液，将2×106分离的细胞接种到100mm直径的组织培养皿中，添加生长培养基至10mL，隔天更换新鲜培养基一次，细胞长至90％以上汇合后，以0.25％胰酶消化收集细胞，以1： 3的比例将细胞接种到新的组织培养皿中进行传代。
实施例4脂肪细胞的报告基因标记
提前一天以60-70％汇合的密度接种目标细胞与6孔板中并生长过夜，感染当天(day1)，按照所需要的量，将分装的、经滴定过的清洁慢病毒储存液融化，调整靶细胞培养物中培养基的体积(OptiMEM，1mL/孔)，添加 polybrene(8μg/ml)，加入适量的病毒，轻轻旋转培养皿进行混合。37℃， 5％CO2孵箱孵育，感染过夜；次日(day2)，去除病毒，并在10％的漂白溶液(含氯石灰)中处理以完全去除污染，PBS洗涤培养皿2次后，加入正常的培养基；第三天后，检测目的基因的表达情况。病毒感染后的脂肪细胞，荧光显微镜下观察mRFP表达，以流式细胞仪检测mRFP的表达率。
实施例5网膜脱细胞基质生物凝胶携带脂肪细胞体内移植后细胞存活情况
随机选取健康成年SD大鼠20只，体重200±20g(购自维通利华)，分为两组：生物凝胶组与生理盐水组，每组10只。在3％戊巴比妥静脉麻醉下，将0.1mL制备的生物凝胶携带5×106mRFP标记的脂肪细胞注射到SD大鼠的后肢肌肉中，0.1mL生理盐水携带相同数量的脂肪细胞移植组作为对照，移植4周后取材，按常规步骤将其肌肉组织固定、脱水、石蜡包埋、切片。
通过免疫荧光染色分析生物凝胶携带脂肪细胞体内移植后细胞存活情况。对两组的组织切片进行免疫荧光染色。每一组切片分别使用抗-αSMA 抗体免疫荧光染色，采用FITC标记的二抗显色(绿色荧光)。阴性对照组使用PBS代替一抗。具体操作步骤如下：固定后的切片PBS冲洗2次，0.1％Triton X-100透化处理30min，山羊封闭血清室温下封闭20min，去除血清，相应的切片上加入αSMA(1:200)一抗并置于湿盒中，4℃过夜孵育；PBS漂洗5min×3 次，除去未结合的一抗，随后，加入心血管谱系抗体对应的FITC-标记二抗工作液，在室温条件下避光孵育2小时；PBS漂洗5min×3次，90％缓冲甘油封片。荧光显微镜下(Olympus FV1000S，Japan)观察绿色荧光与红色荧光共阳性的细胞并计数。各组数据采用均数±标准差表示，SPSS 11.0统计软件进行分析。细胞存活采用学生t检验，p<0.05为差异显著。
结果可见，注射移植后4周，网膜脱细胞基质生物凝胶携带脂肪细胞移植组的脂肪细胞存活率明显高于生理盐水组组。在生物凝胶携带脂肪细胞移植组中，脂肪细胞/Hoechst的比率(反应组织切片上脂肪细胞占全部细胞的百分比)为38.2±3.9％，而生理盐水组仅为9.6±2.7％，具有显著性差异(p <0.01)。上述结果表明，在力学强度较大的大鼠肌肉组织中，与生理盐水相比，生物凝胶携带脂肪细胞移植可明显提高脂肪细胞移植的成活率。
实施例6网膜脱细胞基质生物凝胶与其他凝胶材料在提高脂肪细胞体内移植后存活率的效果比较
以实施例5所述方法进行同步实验，增加两组实验组，分别为胶原凝胶组及透明质酸钠凝胶组，进行脂肪细胞体内移植，通过免疫荧光染色分析脂肪细胞体内移植后细胞存活情况。各组数据采用均数±标准差表示，SPSS 11.0 统计软件进行分析。细胞存活采用t检验，p<0.05为差异显著。
结果可见，注射移植后4周，胶原凝胶组脂肪细胞/Hoechst的比率(反应组织切片上脂肪细胞占全部细胞的百分比)为20.6±3.0％，透明质酸组为 18.1±2.8％，具体数据见表1。网膜生物凝胶组的脂肪细胞存活率显著高于胶原组与透明质酸钠组(p<0.01)。此外，胶原组和透明质酸钠组的细胞存活率也明显高于盐水组(p<0.01)。综上所述，在力学强度较大的大鼠肌肉组织中，以网膜为原料制备的生物凝胶携带脂肪细胞后的细胞存活率显著高于胶原材料与透明质酸钠凝胶的细胞存活率。
表1.本发明提供的生物凝胶与其他凝胶在提高脂肪细胞体内移植后存活率的效果比较
组别 生物凝胶 胶原凝胶 透明质酸钠凝胶 盐水
细胞存活率 38.2±3.9％<sup>*#$</sup> 20.6±3.0％<sup>*</sup> 18.1±2.8％<sup>*</sup> 9.6±2.7％
注：*表示与盐水组相比差异显著p<0.01；#表示与胶原凝胶相比差异显著p<0.01；$表示与透明质酸钠凝胶相比差异显著p<0.01。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.含有细胞的生物凝胶组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取网膜经清洗、脱细胞、消化后制得生物凝胶；
步骤2：取细胞接种至所述生物凝胶，制得含有细胞的生物凝胶组合物；
所述脱细胞包括化学脱细胞、生物脱细胞和/或物理脱细胞；所述化学脱细胞的试剂包括十二烷基硫酸钠；所述生物脱细胞的试剂包括DNA酶；所述物理脱细胞包括震荡；
所述消化包括生物消化和/或物理消化；所述生物消化的试剂包括消化酶溶液，所述物理消化包括搅拌。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述脱细胞采用含十二烷基硫酸钠与DNA酶的缓冲液浸泡所述网膜，震荡；
所述脱细胞包括第一脱细胞和第二脱细胞；
所述第一脱细胞的缓冲液中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5～3.5％重量比、优选1.5～2.5％重量比、更优选1.8～2.2％重量比、最优选2.0％重量比；DNA酶的浓度为3500～4500U/L、优选3600～4400U/L、更优选3800～4200U/L、最优选4000U/L，pH为7.2～7.4；
所述第二脱细胞的缓冲液中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.6～1.5％重量比、优选0.7～1.3％重量比、更优选0.8～1.2％重量比、最优选1.0％重量比；DNA酶的浓度为2500～3500U/L、优选2600～3400U/L、更优选2800～3200U/L、最优选3000U/L，pH为7.2～7.4。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述脱细胞还包括第三脱细胞；
所述第三脱细胞的缓冲液中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1～0.6％重量比、优选0.2～0.6％重量比、更优选0.4～0.6％重量比、最优选0.5％重量比；DNA酶的浓度为1500～2500U/L、优选1600～2400U/L、更优选1800～2200U/L、最优选2000U/L，pH为7.2～7.4；
所述脱细胞的时间为4～12h，所述脱细胞的震荡频率为100～200r/min。
4.如权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述清洗采用磷酸盐缓冲液；所述消化为：取脱细胞后的网膜基质与消化液混合，搅拌，终止消化；以g/mL计，脱细胞后的网膜基质与消化液的重量体积比为(10～20)：100；
所述消化液包括胰酶、胶原酶、dispaseII和PBS溶液；
其中，胰酶、胶原酶、dispaseII的质量比为2：2：(1～2)；
胰酶的酶活为6000～8000BAEE units/mg；胶原酶的酶活为125～150CDU/mg；dispaseII的酶活为10～20units/mg；
胰酶、胶原酶与dispaseII在PBS溶液的浓度分别为0.05～0.25％，pH为7.2～7.4。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌的转速为60～100rpm，所述消化为于37℃，5％CO2消化30～45min；所述终止消化采用血清，血清与消化液的体积比为(1～2)：10。
6.如权利要求1至5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞之前还包括脱脂的步骤；所述脱脂包括化学脱脂和/或物理脱脂；所述化学脱脂采用体积比为1：1：(0.2～1)、优选1：1：(0.4～0.7)、更优选1：1：0.5的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液进行，所述化学脱脂的时间为18～30h；所述物理脱脂采用震荡的方法；所述震荡的频率为150～250r/min。
7.如权利要求1至6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述制得生物凝胶为调整浓度为10～20mg/mL，于37℃5～10min，即得所述生物凝胶；
步骤2中细胞的接种密度为5×106～5×107个/mL。
8.如权利要求1至7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述网膜来源于哺乳动物；所述细胞包括皮肤成纤维细胞、脂肪细胞、脂肪间充质干细胞、软骨细胞或心肌细胞中的一种或多种。
9.如权利要求1至8任一项所述的制备方法制得的含有细胞的生物凝胶组合物。
10.如权利要求9所述的含有细胞的生物凝胶组合物在制备医用材料中的应用。
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