CN103459593A - 视网膜色素上皮细胞片层的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供：细胞片层的生产方法，包括以下步骤：（1）将视网膜色素上皮细胞接种到胶原凝胶上并在所述胶原凝胶上培养所述视网膜色素上皮细胞以进而形成由所述视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层，和（2）用胶原酶降解胶原凝胶来分离由所述视网膜色素上皮细胞等构成的细胞片层。

Description

视网膜色素上皮细胞片层的生产方法
技术领域
本发明涉及细胞片层的生产方法，包括在胶原凝胶上接种视网膜色素上皮细胞。本发明还涉及用于移植的细胞片层，包含由视网膜色素上皮细胞形成的细胞层和基膜。
背景技术
目前，年龄相关性黄斑变性（AMD）在发达国家中是法定失明的主要成因性疾病之一，并且主要见于年龄在50岁以上的老年人中。年龄相关性黄斑变性由黄斑中的年龄相关性变化导致，并且主要分为渗出型和萎缩型。渗出性年龄相关性黄斑变性是与老年人黄斑中脉络膜的新血管性血管发育相关，随后在视网膜色素上皮或视网膜下出血并渗出性损伤，并最终形成瘢痕组织的疾病。萎缩性年龄相关性黄斑变性是伴随黄斑区的萎缩和脉络膜小疣积累的疾病。导致渗出性和萎缩性年龄相关性黄斑变性的前体损伤有时具体称作早期年龄相关性黄斑变性，并且该损伤也被认为是年龄相关性黄斑变性的一种病理学。
当年龄相关性黄斑变性是轻度的渗出型时，对于其治疗，可以选择外科疗法诸如光动力学疗法、激光光凝固法、新血管性血管的剥除等，或者选择通过药物疗法诸如施用参与血管发生的血管内皮生长因子（VEGF）的抑制剂等来旨在退化并去除新血管性血管的治疗方法。然而，上述方法无法对已发展为高度萎缩或缺少视网膜色素上皮（RPE）的渗出型或萎缩型产生治疗有效性。在这种情况下，有效的治疗方法是向视网膜下的缺陷部位移植视网膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮。
已经尝试了通过移植视网膜色素上皮细胞的多种治疗方法。已报道以细胞悬液形式从人胎中获得的视网膜色素上皮细胞的移植显示出移植细胞差的植入。在移植分离的还包含Bruch膜和脉络膜的视网膜色素上皮细胞片层如来自尸体眼部的片层的情况下，发生术后排斥并且无法获得足够的治疗效果（非专利文件1）。此外，已经指出利用尸体眼部的方法包括了伦理问题。在另一方面，已经报道患有年龄相关性黄斑变性的患者视力改善的情况，其中使用了包括收集患者自身的正常视网膜色素上皮细胞和脉络膜并将它们移植到黄斑下的缺陷部位的方法。然而，该方法对患者产生了极高的负担以及极高的手术风险。尽管已经进行了尝试来采用收集自患有年龄相关性黄斑变性患者的患者自身的虹膜色素上皮细胞用于代替视网膜色素上皮细胞进行移植，但是最后视力的上限仍是低的并且还没有获得足够的效果，而且，利用患者自身细胞的负担和风险高（非专利文件2）。因此，使用收集自尸体眼部的细胞或患者自身细胞的常规治疗方法在伦理学、安全性、效果等方面上不具有实用性，并且已经需要真正可用于移植治疗的视网膜色素上皮细胞。
作为视网膜色素上皮细胞片层的生产方法之一，可以提及包括用胞外基质等包被细胞培养基材，并且在其上培养视网膜色素上皮细胞来形成片层的方法。例如，可以通过在纤连蛋白包被的材料上培养视网膜色素上皮细胞来形成细胞片层，但是没有报道基膜的形成，并且从其中形成片层的容器中取出片层的方法根本未描述（非专利文件3）。考虑到这些问题，多个实验室已经开发了通过用人工膜代替基膜预先形成视网膜色素上皮细胞片层的方法。然而，担心人工膜会成为对移植中植入以及身体的功能维持的病症。尽管也已经开发了具有更低生物应答的人工膜，但由于它问题性地诱导炎症及与之相关的排斥（其由与细胞自身产生的基膜在组成、特性、刚性等上的差异所导致），因此它不适合于移植。而且，按惯例，具有极性的视网膜色素上皮细胞片层培养方法已经是已知的。然而，它仅用于实验模型用途，其中来源于活体生物的视网膜色素上皮细胞和无限增殖化系在容器中形成片层并直接使用，并且它仍然无法从容器中实际回收如活体生物中的提供有基膜的视网膜色素上皮细胞片层（非专利文件4）。存在通过片状剥落不使用胞外基质等直接在培养皿上培养的视网膜色素上皮细胞来获得视网膜色素上皮细胞片层的方法。通过片状剥落分离细胞的此类方法无法使片层、基膜等的形状和大小保持稳定，导致由片状剥落引起的对视网膜色素上皮细胞许多损伤，并且在大部分情况下，由于片状剥落导致片层形状的瓦解和分散的细胞，因此无法产生可用于移植等的细胞片层（非专利文件5）。此外，尽管已经报道了用胶原包被细胞培养基材并且在胶原上培养细胞，但是没有使用人视网膜色素上皮细胞。而且，为了提高凝胶强度，需要分别加入交联剂，其使得该方法无法方便快捷（专利文件1）。由于该情况目前没有变化，生产视网膜色素上皮细胞片层（其对视网膜疾病诸如年龄相关性黄斑变性等是治疗上有效的，并且可方便且稳定地制备）仍然是一个问题。
[文件列表]
[专利文件]
专利文件1：JP-A-2005-261292
[非专利文件]
非专利文件1：Ophthalmic Surg.1991 Feb; 22(2):102-8.
非专利文件2：Tohoku J Exp Med.1999 Dec; 189(4):295-305.
非专利文件3：Nat. Protoc., 4(5), 2009, 662-673.
非专利文件4：Invest.Ophthalmol.Vis. Sci., 47, 2006, 3612-3624.
非专利文件5：Invest.Ophthalmol.Vis. Sci., 36(2), 1995, 381-390。
发明概述
本发明待解决问题
本发明的问题是开发不使用人工膜而方便且稳定地生产视网膜色素上皮细胞片层的新方法，并且为患有与缺乏视网膜色素上皮相关的疾病诸如年龄相关性黄斑变性等的患者提供视网膜色素上皮细胞片层用于移植，其显示出高植入率并且功能优异。
解决问题的方法
本发明人通过在细胞培养基材上形成胶原凝胶层并且在其上接种并培养视网膜色素上皮细胞来生产细胞片层。通过该方法获得的细胞片层在胶原凝胶和视网膜色素上皮细胞片层之间保有基膜，具有与体内的视网膜色素上皮细胞相似的细胞因子分泌能力和细胞间粘附性，并且通过用胶原酶分解胶原凝胶使所述视网膜色素上皮细胞片层从细胞培养基材上易于分离而同时保有基膜。此外，组成细胞片层的细胞保持视网膜色素上皮细胞特异性标记的表达。本发明人已经进行深入研究，并且从这些发现中完成本发明。因此，本发明提供
[1]细胞片层的生产方法，其包括以下步骤
（1）在胶原凝胶上接种并培养视网膜色素上皮细胞以形成由视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层，和
（2）用胶原酶降解胶原凝胶来分离由视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层；
[2]上述[1]的细胞片层的生产方法，其中所述视网膜色素上皮细胞是通过诱导干细胞或祖细胞分化获得的细胞；
[3]上述[2]的细胞片层的生产方法，其中所述干细胞是ES细胞或iPS细胞；
[4]上述[1]的细胞片层的生产方法，其中胶原凝胶中胶原的浓度为0.1% - 0.5%；
[5]上述[1]至[4]中任一项的细胞片层的生产方法，还包括以下步骤（3）
（3）确定基膜是否存在于分离的细胞片层和胶原凝胶之间的接触面上；
[6]通过上述[1]至[5]中任一项的方法生产的细胞片层；
[7]用于移植的细胞片层，包含由通过先体内后体外（ex vivo）诱导干细胞或祖细胞分化获得的视网膜色素上皮细胞形成的细胞片层和由所述细胞分泌的基膜；和
[8]用于筛选的细胞片层，包含由通过先体内后体外诱导干细胞或祖细胞分化获得的视网膜色素上皮细胞形成的细胞片层和由所述细胞分泌的基膜。
发明效果
根据本发明，可以容易且稳定地制备具有在表面上出现基膜的结构的视网膜色素上皮细胞片层。由于本发明的细胞片层具有优异的植入率和功能性，并且对于移植非常有用，因此可以生产由基膜和视网膜色素上皮细胞构成的片层并通过移植向患有眼疾病的患者诸如患有年龄相关性黄斑变性等的患者应用。尤其是，当用于培养的细胞是来源于iPS细胞的视网膜色素上皮细胞时，可以通过利用患者自身细胞作为来源来避免移植中的排斥。
附图简述
图1显示视网膜色素上皮细胞的细胞因子分泌能力的检测结果。
实施方案描述
本发明在下文中详细说明。
本发明提供细胞片层的生产方法，包括以下步骤：
（1）在胶原凝胶上接种并培养视网膜色素上皮细胞以形成由视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层，和
（2）用胶原酶降解胶原凝胶来分离由视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层。
尽管在步骤（1）中待接种的视网膜色素上皮细胞可以是来源于任何哺乳动物的细胞，只要它来源于哺乳动物（例如人、猴、小鼠、大鼠、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、兔、仓鼠、豚鼠等），但它优选是来源于人的细胞。
接种的视网膜色素上皮细胞可以是直接从眼球收集的原代细胞或几次传代后的细胞。原代视网膜色素上皮细胞可以通过已知的方法分离。例如，在眼球来源的视网膜色素上皮细胞的情况下，将尸体眼球分离，在赤道段快速分开，将玻璃体和视网膜去除并必要时用胶原酶、透明质酸酶等处理，用细胞刮棒刮擦收集细胞，或在胰蛋白酶或EDTA溶液中处理以从Bruch膜上释放细胞，在培养基中静置以诱导向培养皿上粘附和生长，并且将以所需数目生长的细胞用胰蛋白酶处理等适当传代，以确保细胞数目。
此外，这些细胞还可以是通过诱导未分化的多能干细胞诸如胚胎干细胞（ES细胞）、诱导多能干细胞（iPS细胞）等，干细胞包括成体干细胞诸如神经干细胞等，或祖细胞包括神经祖细胞和视网膜祖细胞分化而获得的细胞。ES细胞还可以是通过体细胞核重编程产生的ES细胞。此外，作为干细胞，可以通过诱导近年来报道的诱导多能干细胞（iPS细胞）的分化来制备目标细胞。iPS细胞是具有与ES细胞的那些相同的特性的体细胞来源的诱导干细胞，其可以通过向体细胞中引入特定的核重编程物质（核酸、蛋白、低分子量化合物等）来产生[Takahashi, K.和Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006); Takahashi, K.等, Cell, 131: 861-872 (2007)]。用于上述干细胞向目标分化细胞分化的条件和培养基可以按照常规已知的条件和培养基，或者可以由本领域普通技术人员合适地确定。在本发明中，由于可以制备在合适成熟期的视网膜色素上皮细胞，并且具体而言，可以制备相比而言未成熟的视网膜色素上皮细胞并且可以方便地形成细胞片层，因此通过诱导干细胞或祖细胞（优选多能干细胞）分化获得的细胞优选用作视网膜色素上皮细胞来用于细胞片层。此外，由于使用接受移植的受试者的体细胞作为iPS细胞来源获得的细胞片层没有针对受试者的抗原性，因此当通过本发明产生的细胞片层用于移植时，优选使用iPS细胞。当诱导干细胞分化时，例如，人ES细胞或多能干细胞诸如iPS细胞等在加有Wnt拮抗物诸如Dkk-1、CKI-7等和Nodal拮抗物诸如Lefty A、SB-431542等的ES分化培养基中培养。当培养给定时期时，表达Rx、Pax6和Mitf（其是视网膜祖细胞标记），并且可以通过用光学显微镜形态观察，通过确定细胞具有多边形形态和色素，来获得人视网膜色素上皮细胞[Neuroscience Letters 2009 Jul 24 458(3) 126-31, Journal of Cell Science 2009 Sep 1 122(Pt 17) 3169-79]。
本发明的视网膜色素上皮细胞通过接种在胶原凝胶上来培养。用于胶原凝胶的胶原可以是任何胶原，只要它来源于哺乳动物（例如人、猴、小鼠、大鼠、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、兔、仓鼠、豚鼠等）并且，例如，使用人或猪来源的胶原。胶原来源的组织的实例包括腱、皮肤等。尽管胶原的种类可以是任何种类，但除构成人基膜的胶原之外的胶原是优选的，除IV型胶原之外的胶原是特别优选的。其中，优选使用I型胶原。尽管胶原凝胶可以通过例如常规已知的生产方法来产生，但在本发明中，如下文提及的实施例中描述，由胶原纤维网格构成的凝胶通过诱导胶原的纤维发生来产生。由于纤维化胶原具有强度和柔性的组合，因此它易于操作，显示出细胞增殖和细胞分化的良好保持，并且优选作为胶原凝胶用于本发明中。此外，用于本发明中的胶原对于将接种在胶原凝胶上的细胞保持在凝胶表面而不使它们沉入凝胶层中是必需的。因此，优选其中凝胶具有对细胞增殖所必需的强度的一种作为胶原，并且，例如，优选具有大量分子间交联的胶原。腱来源的胶原可以作为此类胶原而提及。
尽管上述胶原凝胶的胶原浓度可以在任何范围内，只要它能够提供这样的凝胶，其具有允许视网膜色素上皮细胞植入和生长的强度，并满足易于被胶原酶所降解的可溶性、能够易于操作的粘度等，但它优选0.1% (W/V) - 0.5% (W/V)，更优选0.2% (W/V) - 0.3% (W/V)。当胶原凝胶的胶原浓度低于0.1% (W/V)，胶原凝胶的强度变得不足，因此，视网膜色素上皮细胞的建群率和细胞增殖率降低。当胶原凝胶的胶原浓度超过0.5% (W/V)，胶原酶处理以降解胶原凝胶的时间变长，担心其会对细胞产生不利影响。
尽管用于生产上述胶原凝胶的胶原凝胶混合溶液的体积根据培养面积和用于细胞培养的培养基材的形状而变化，但它优选每单位面积(cm2)约100 μl-约250 μl，更优选约150 μl-约200 μl。当胶原凝胶混合溶液的量太小时，由于应用到凝胶表面上的表面张力的影响，会形成具有薄的中心部分的胶原凝胶层，并且由于当培养视网膜色素上皮细胞时细胞直接与培养基材接触，因此在切出细胞片层的过程中片层容易受损。当胶原凝胶混合溶液的量过量时，在培养基材上形成厚的胶原凝胶层，其相对降低了培养基的量，因此，保持培养不易进行，胶原酶处理耗费时间，并且担心细胞片层上的损伤。
在步骤（1）中，可以通过在细胞培养基材的胶原凝胶上接种并培养上述视网膜色素上皮细胞来生产细胞片层。本发明中的细胞培养基材无具体限定，只要它用于细胞培养。其实例包括具有多孔膜的培养容器，诸如transwell等、瓶、组织培养瓶、皿、培养皿、组织培养皿、多皿、微量培养板、微孔板、多板、多孔板、腔室培养玻片、培养皿、管、盘、培养袋和滚瓶。优选具有多孔膜的培养容器，这是因为方便进行胶原酶处理和细胞片层的切割操作。例如，优选使用商品化的transwell。本说明书中细胞培养基材的材料的实例包括但不限于无机材料，诸如金属、玻璃、陶瓷、硅等，有机材料，代表是高弹体、塑料（例如聚酯树脂、聚乙烯树脂、聚丙烯树脂、ABS树脂、尼龙、丙烯酸树脂、氟树脂、聚碳酸酯树脂、聚氨基甲酸酯树脂、甲基戊烯树脂、酚树脂、三聚氰胺树脂、环氧树脂、氯乙烯树脂）。
接种的视网膜色素上皮细胞的数目可以在任何范围内，只要它是能够形成细胞片层的细胞密度。然而，当细胞密度太低时，细胞形状不好，达到汇合前的培养时间长，并且进一步，细胞成熟和着色所需时间长。当细胞密度太高时，类似地，细胞增殖受到抑制，达到汇合前的培养时间趋于变长，并且细胞可能由于过于密集而死亡。因此，接种的细胞密度优选约4.5×104细胞/cm2 - 约8.5×105细胞/cm2，更优选约8.5×104 细胞/cm2 - 约8.5×105细胞/cm2，最优选约4.5×105细胞/cm2。
由视网膜色素上皮细胞构成的单层细胞群（细胞片层）可以通过培养在培养基中的胶原凝胶上接种的视网膜色素上皮细胞来形成。可以无具体限定地使用培养基，只要它是一般用于相关领域中的细胞培养基。例如，可以使用描述于由Asakura Shoten出版的“Japan tissue culture conference编辑, Technique of Tissue Culture第三版”第581页中的基础培养基，诸如F-10培养基、F12培养基、MEM、BME培养基、DMEM、αMEM、IMD培养基、ES培养基、DM-160培养基、Fisher培养基、WE培养基、RPMI1640培养基等。此外，可以将血清（胎牛血清等）、多种生长因子（EGF、FGF、HGF、PDGF等）、抗生素、氨基酸等加入到基础培养基中。培养基的pH优选约6-约8。至于培养，例如，原代培养通常在约30 - 约40℃下进行约15-约60小时，直至视网膜色素上皮细胞达到汇合。随后，继代培养进行约1周－约2个月，同时更换培养基，其后，进行培养同时必要时通气并搅拌，直至形成细胞片层。构成经这样培养获得的细胞片层的细胞保持为视网膜色素上皮细胞。可以通过检测作为特异性分化标记的BEST1、RPE65、MERTK、CRALBP等来确定细胞保持为视网膜色素上皮细胞。
由于在步骤（1）中形成的细胞片层粘附在胶原凝胶上，例如，当它直接用于移植等时，担心胶原凝胶会妨碍在移植受体中的植入。如果可以预先去除胶原凝胶，这有助于解决这一问题。在本发明的步骤（2）中，通过胶原酶降解粘附到步骤（1）中形成的细胞片层上的胶原凝胶。本领域普通技术人员可以根据用于制备胶原凝胶的胶原种类选择合适的胶原酶。尽管用于降解胶原凝胶的胶原酶并无具体限定，只要它具有消化胶原凝胶的活性，但优选不容易降解构成人基膜的胶原（例如IV型胶原等）的胶原酶。例如，可以使用来源于微生物从梭菌属（溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)）或链霉菌属（微小链霉菌(Streptomyces parvulus)）中诱导的胶原酶，其是商业可购的、安全的并且具有高的酶活性。
作为上述胶原酶的活性，重要的是相对于胶原凝胶中的胶原重量的比活，而非每单位重量胶原酶的活性和每单位体积的水性胶原酶溶液的活性。用于溶解胶原凝胶的胶原酶的比活（胶原酶活性/胶原重量）优选不低于0.1 U/mg。当胶原酶的比活低于0.1 U/mg时，胶原凝胶的溶解可能不优选耗费太长时间，或者凝胶可能不优选不充分地溶解。它更优选在0.1 - 10,000 U/mg，还优选1 - 3,000 U/mg的范围内。
在本发明的细胞片层的生产方法中，胶原酶作用于胶原凝胶的方法并无具体限定。可以将使用具有缓冲能力的培养基或等渗溶液作为溶剂制备的胶原酶溶液加入到培养基中，或者可以将从细胞培养皿上分离下的结合细胞的胶原凝胶浸入到上述胶原酶溶液中。由于将transwell用作本发明的细胞培养基材，因此可以通过回收插入物并去除插入物底部上的膜而使胶原凝胶层暴露出来，并且将暴露出的胶原凝胶优选直接浸入到上述胶原酶溶液中。
在本发明的细胞片层的生产方法中，通过胶原酶溶解胶原凝胶的时间并无具体限定。当胶原酶的作用时间太长时，细胞功能诸如粘附能力、增殖能力等可能不优选地下降。尽管通过胶原酶的溶解时间由于胶原酶的比活、温度、胶原凝胶的形状、胶原酶处理方法等而发生变化，但它通常为15 min - 60 min。胶原酶处理可以是单次处理或进行多次。
由于当活体生物体内的温度变得不高于10℃ (在人中约30℃)时，细胞的细胞质的流动性通常下降并且代谢能力下降，而当温度超过42℃时，蛋白会变性并且细胞功能下降，因此在本发明的细胞片层生产方法中，通过胶原酶的胶原凝胶处理过程中的温度优选设定在10 - 42℃，更优选30 - 40℃，还优选36 - 38℃的范围内，并且胶原酶的最佳温度主要是37℃，并且低于该水平的温度延长溶解时间。
在本发明的细胞片层生产方法中，当胶原凝胶的溶解进行时，细胞片层逐步从凝胶上分离，并且最终释放于胶原酶溶液中。为了回收细胞片层，细胞片层可以从残留凝胶上机械分离，或者可以在凝胶完全溶解后回收。尽管机械分离缩短了至细胞片层回收的时间，但由于细胞片层可能被破坏，因此优选在凝胶完全溶解后回收。
尽管如上文提及回收的细胞片层可以直接用于多种应用，但由于残留胶原酶可以抑制细胞片层之间的粘附性或与组织的粘附性，因此它优选用具有缓冲能力的培养基或等渗溶液洗涤。可以根据用胶原酶的胶原凝胶溶解处理来确定清洗过程中的温度。为了充分去除残留胶原酶，优选用具有缓冲能力的培养基或等渗溶液洗涤所述片层一次或多次。
在通过本发明的方法获得的细胞片层中，以具有与活体生物中的相似的极性分泌对视网膜色素上皮细胞特异性的细胞因子，并且作为细胞间的紧密粘附结合指数的跨上皮电阻（TER）如活体生物中升高。因此，它具有与活体生物中的相似的细胞层屏障功能。根据本发明的方法，可以获得具有与活体生物中的那些相似的功能的细胞片层。
在通过本发明的方法获得的细胞片层中，紧密连接在视网膜色素上皮细胞之间形成，并且基膜在与胶原凝胶的接触面上形成。在本说明书中，“基膜”是从视网膜色素上皮细胞产生的组分形成的膜，并且表示包含至少部分基膜组分的膜（下文中称作“视网膜色素上皮细胞的基膜”）。活体生物中视网膜色素上皮细胞的基膜作为视网膜色素上皮细胞层和构成Bruch膜的内胶原层之间的薄膜而存在，并且是具有IV型胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（基底膜聚糖）、巢蛋白等作为代表性组分的胞外基质。Bruch膜是在视网膜色素上皮细胞层和脉络膜之间的薄膜，并且具有视网膜色素上皮细胞的基膜、内胶原层、弹性蛋白层、外胶原层和脉络膜的毛细管层的基膜的5层结构。本发明的细胞片层包含Bruch膜结构的部分（视网膜色素上皮细胞的基膜）。紧密连接的形成可以通过观察六角形紧密粘附的细胞形式和通过免疫染色的细胞间闭合蛋白、ZO-1等的表达来确定。基膜的形成可以通过免疫染色观察细胞表面上基膜标记诸如层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（基底膜聚糖）、巢蛋白或IV型胶原等的表达，或者用扫描电镜观察来确定。
通常，在培养皿上培养的视网膜色素上皮细胞产生基膜组分，但非常难于以从培养皿上分离的可用的视网膜色素上皮细胞片层的形式分离细胞(Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36(2), 1995, 381-390)。根据本发明的方法，从视网膜色素上皮细胞产生的视网膜色素上皮细胞连同基膜可以作为片层回收而不利用人工膜。由于视网膜色素上皮细胞形成单层结构，因此当将它们单独操作时，片层结构会瓦解并且细胞分散成细胞单元。因此，其作为片层的移植是非常困难的。另一方面，由于本发明的细胞片层伴有基膜，并且具有足够的刚性，因此它在回收过程中不容易起皱，其使得其操作非常容易。因此，由于放置到细胞移植设备上和移植操作可以流畅地进行，因此细胞移植可以以最小侵入来进行，并且期望效果和预后会改善。此外，由于细胞片层伴有基膜，因此它非常有利于在其中基膜同时受损的疾病中进行移植。例如，年龄相关性黄斑变性有时伴随Bruch膜的受损。本发明的细胞片层中的基膜补偿受损部分，由此可以改善细胞片层的植入率，并且可以还期望其治疗效果。因此，本发明的细胞片层优选作为用于针对患有受损基膜的疾病的移植的片层，并且可以优选用作用于尤其针对年龄相关性黄斑变性移植的片层。
本发明的细胞片层的生产方法还可以包括以下步骤（3）：
（3）确定基膜是否存在于分离的细胞片层和胶原凝胶之间的接触面上。
在步骤（3）中，具有由视网膜色素上皮细胞和基膜构成的细胞层的细胞片层的形成可以通过确定细胞片层的基膜是否存在来确定。基膜是否存在可以通过与上述确定基膜形成相似的方法来确定，例如，基膜标记的表达、用扫描电镜观察等。对于基膜的检测，基膜标记的表达可以在细胞的任何位置（例如，细胞质、细胞膜、核膜等）处确定。优选地，将表达在与胶原凝胶的接触面上的标记作为目标。
本说明书中的基膜标记包括特异性表达于基膜中的基因的转录产物、翻译产物或降解产物。此类基因的实例包括层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（基底膜聚糖）、巢蛋白、IV型胶原等。其中，优选使用是基膜主要成分的层粘连蛋白、IV型胶原等。
用于“确定基膜是否存在于分离的细胞片层和胶原凝胶之间的接触表面上”的样品并无具体限定，只要它包含来源于步骤（2）中分离的细胞片层（或细胞）的基膜标记（例如，其RNA、蛋白、降解产物等）。
当上述样品是RNA时，基膜标记基因的表达可以如下检测，通过从步骤（2）中分离的细胞片层的细胞制备RNA（例如，总RNA、mRNA）级分并检测该级分中包含的标记基因的转录产物，或直接检测细胞中的标记基因产物而不从细胞中提取RNA。
当从细胞中制备RNA（例如，总RNA、mRNA）级分时，它可以使用已知方法诸如胍-CsCl超速离心方法、AGPC方法等来制备。使用商品化的RNA提取试剂盒（例如，RNeasy Mini Kit；由QIAGEN等制造），可以快速且方便地从痕量样品中制备具有高纯度的总RNA。在RNA级分中检测基膜标记基因的转录产物的方法的实例包括使用杂交的方法（RNA印迹、斑点印迹、DNA芯片分析等）、使用PCR的方法（RT-PCR、竞争性PCR、实时PCR等）等。优选定量PCR方法诸如竞争性PCR、实时PCR等，这是由于基膜标记基因的表达变化可以快速且方便地从痕量的样品中检测到，并且优选DNA芯片分析，这是由于多种标记基因的表达变化可以共同检测，并且定量性能还可以通过选择检测方法等来改善。
当使用RNA印迹或斑点印迹杂交时，可以使用能够与基因的转录产物杂交的核酸（探针）来检测基膜标记基因。此类核酸的实例包括能够在高严格性条件下与基膜标记基因的转录产物杂交的核酸。“高严格性条件”的实例包括在45℃下在6×SSC（氯化钠/柠檬酸钠）中杂交反应，随后在65℃下在0.2×SSC/0.1% SDS中洗涤一次或多次等。本领域普通技术人员可以通过合适地改变杂交溶液的盐浓度、杂交反应的温度、探针浓度、探针长度、错配数、杂交反应时间、洗涤的盐浓度、洗涤温度等来容易地调整至所需的严格性。核酸可以是DNA、RNA或DNA/RNA嵌合体，优选DNA。
用作探针的核酸可以是双链的或单链的。当是双链时，它可以是双链DNA、双链RNA或DNA:RNA杂化物。当是单链时，可以使用反义链。尽管核酸长度并无具体限定，只要它可以特异地与目标核酸杂交，但例如，它不少于约15个碱基，优选不少于约30个碱基。为了能够检测并定量目标核酸，核酸优选进行标记。标记的实例包括放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。放射性同位素的实例包括[32P]、[3H]、[14C]等。作为酶，优选具有高比活的稳定酶，例如，β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等。荧光物质的实例包括荧光胺、异硫氰酸荧光素等。发光物质的实例包括鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、光泽精等。此外，生物素-（链霉）抗生物素蛋白也可以用于结合探针和标记。
当使用RNA杂交时，将如上文所述制备的RNA级分通过凝胶电泳分离，转移到硝酸纤维素、尼龙、聚偏二氟乙烯等的膜上，在上述“高严格性条件”下在含有如上文所述制备的标记探针的杂交缓冲液中杂交，并且通过合适的方法对每一条带测定结合到膜上的标记的量，由此可以测定每一基膜标记基因的表达水平。还在斑点印迹的情况下，将用RNA级分点样的膜进行相似的杂交反应（对每一标记基因进行），并且测定斑点上标记的量，由此可以测定每一标记基因的表达水平。
当使用DNA芯片分析时，例如，从如上文所述制备的RNA级分通过反转录反应合成引入有合适启动子诸如T7启动子等的cDNA，使用RNA聚合酶合成cRNA（在这种情况下，通过使用用生物素等标记的单核苷酸作为底物获得标记的cRNA）。将标记的cRNA与具有固定于其上的上述探针的芯片接触来进行杂交反应，并且测定固相上与每一探针结合的标记的量，由此可以测定每一基膜标记基因的表达水平。由于检测的差异标记基因（因此，探针为固相化的）的数目增加，因此该方法在快速和便利方面是有利的。
另一方面，当不从细胞中提取RNA的情况下检测标记基因时，可以使用原位杂交作为检测方法。在该方法中，通过用固定剂（优选沉淀固定剂，例如丙酮）处理细胞或将细胞在缓冲性甲醛溶液中孵育短时间来将细胞固定化，而不是从细胞中提取RNA。固定化后，将细胞包埋入石蜡中以形成块，并且从中切出的切片可用作样品。良好制备的石蜡包埋样品可以在室温下保存多年。至于用作探针的核酸，可以使用与上述实例相似的那些。由于基膜标记在细胞和胶原凝胶之间的接触表面上的表达可以直接确定，因此在本发明中优选使用原位杂交。
或者，可以通过从细胞片层（或细胞）制备蛋白级分并检测所述级分中包含的标记基因的翻译产物（即标记蛋白），或通过直接检测细胞片层（或细胞）中标记基因的翻译产物而不从细胞片层（或细胞）中提取蛋白来确定步骤（2）中分离的细胞片层中基膜标记的表达。标记蛋白可以通过免疫测定方法（例如，ELISA、FIA、RIA、蛋白印迹等）使用每一蛋白的抗体来检测，并且在显示可测定的生理活性的蛋白（诸如酶等）的情况下，它可以通过用已知方法测定每一标记蛋白的生理活性来检测。或者，标记蛋白还可以通过质谱方法（诸如MALDI-TOFMS等）来检测。
每一标记蛋白的抗体可以根据常用的多克隆抗体或单克隆抗体生产技术并使用标记蛋白或蛋白、或其部分肽作为免疫抗原来获得。
当各种免疫测定方法用于本发明的检测方法时，具体条件、操作等的设定不是必要的。基膜标记蛋白的测定系统可以通过在每一方法的一般条件和操作方法中加入本领域普通技术人员的一般性技术考虑来建立。至于这些一般技术方法的细节，可以参考汇编、图书等。例如，可以参考由Hiroshi Irie编辑的“Radioimmunoassay” (Kodansha, 出版于1974年)、由Hiroshi Irie编辑的“cont. Radioimmunoassay”(Kodansha, 出版于1979年)、由Eiji Ishikawa等编辑的“Enzyme Immunoassay”(Igaku-Shoin, 出版于1978年)、由Eiji Ishikawa等编辑的“Enzyme Immunoassay”(第2版) (Igaku-Shoin, 出版于1982年)、由Eiji Ishikawa等编辑的“Enzyme Immunoassay”(第3版) (Igaku-Shoin, 出版于1987年)、“Methods in ENZYMOLOGY”, 第70卷(Immunochemical Techniques (A部分))、同处，第73卷(Immunochemical Techniques (B部分))、同处，第74卷(Immunochemical Techniques (C部分))、同处，第84卷(Immunochemical Techniques (D部分: Selected Immunoassays))、同处，第92卷(Immunochemical Techniques (E部分: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同处，第121卷(Immunochemical Techniques (I部分: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (均由Academic Press出版)。
本发明还涉及根据上述细胞片层生产方法获得的细胞片层，优选为包含由通过先体内后体外分化诱导获得的视网膜色素上皮细胞形成的细胞层和基膜的用于移植的细胞片层。本发明的视网膜色素上皮细胞片层优选作为移植材料用于患有眼疾病的患者的视网膜治疗。眼疾病的实例包括视网膜退行性疾病，诸如年龄相关性黄斑变性病、色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变、视网膜脱离等。由于本发明的细胞片层包含基膜，因此它可以以高植入率对同时涉及受损的Bruch膜的疾病进行移植。此外，由于本发明的视网膜色素上皮细胞片层具有由与活体生物中的组分相似的组分制成的基膜，因此它还可以用于在上述眼疾病中的多种筛选目的，诸如效力筛选、毒性评价等。对于上述眼疾病的效力筛选，例如，根据JP-A- 2007-500509中描述的方法，本发明的细胞片层可以用于筛选对上述眼疾病具有效力的物质。为了是特异的，将本发明的细胞片层在存在或不存在候选物质的情况下进行培养，所述候选物质在可能导致上述眼疾病的应激条件下具有效力（例如，光（例如，白光、蓝光；光诱导视网膜细胞尤其是光受体细胞死亡，并且可以是黄斑变性的刺激因子）、A2E[维甲酸N-亚视黄基-N-视黄基-乙醇胺]（认为A2E的积累促成视网膜细胞的年龄相关性神经变性，尤其是黄斑变性的表达）、香烟烟雾聚集体（认为吸烟是黄斑变性的风险因素）、外部压力（例如，液体静压；怀疑眼内压力的增加与青光眼有关）），并且可以根据表达视紫红质的光受体数目并通过用抗胱天蛋白酶3抗体的免疫染色来进行评价。对于毒性评价，根据JP-A- 2007-517210中描述的方法，本发明的细胞片层可以用于筛选毒性物质。为了是特异的，本发明的细胞片层在存在或不存在毒性候选物质的情况下并且使用JP-A- 2007-517210中描述的整联蛋白标记肽进行培养，用激光在488 nm的波长下激发，并且在520 nm处检测荧光进行评价。此外，本发明的视网膜色素上皮细胞片层还可以用作体外模型用于评价视网膜色素上皮细胞的多种体内功能，诸如与视细胞保持相关的功能，诸如光受体外节的吞噬能力、神经保护作用等，视网膜血管屏障功能诸如泵作用（pumping action）、紧密连接等。
本发明的用于移植的细胞片层可以用于治疗人和除人之外的哺乳动物（例如猴、小鼠、大鼠、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、兔、仓鼠、豚鼠等）中的上述疾病。
根据施用受试者的目标疾病、动物物种、年龄、性别、体重和症状等，来适当地确定本发明用于移植的细胞片层可以应用的疾病区域的范围。
本发明用于移植的细胞片层可以以一次移植或以几部分移植。由健康护理专家根据疾病和指导方针来确定移植的应用次数。例如，当疾病是年龄相关性黄斑变性病时，根据其严重性，本发明用于移植的细胞片层可以移植两次或更多次。当移植进行多次时，间隔时间并无具体限定，并且可以设置几天至几周的时期。
本发明用于移植的细胞片层由健康护理专家根据合适的移植方法按照指导方针移植。当本发明用于移植的细胞片层在视网膜下移植时，可以使用包括将所述片层在来自穿刺注射针头的水流中递送至眼球视网膜下的移植位置上的移植方法，或者还可以使用专用于移植的治疗仪器。
实施例
通过参考以下实施例对本发明进行更为详尽的说明，其仅为示例而不以任何形式限制本发明的范围。
生产实施例 1. 视网膜色素上皮细胞的制备
作为在以下实施例1中用于形成片层的视网膜色素上皮细胞，按照Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131中描述的方法，使用通过诱导iPS细胞分化获得的成熟视网膜色素上皮细胞（253G1、K11PD2、59M8、59SV2、59SV3、59SV9、46a、K21EV15、101EV3、K11EV9、454E2）和通过诱导ES细胞分化获得的视网膜色素上皮细胞（hES、CMK6）。
<人iPS来源的视网膜色素上皮细胞>
253G1是通过诱导来源于健康人的人iPS细胞的分化而获得的视网膜色素上皮细胞，而K11PD2和59M8是从来源于彼此不同的色素性视网膜炎患者的人iPS细胞诱导分化的视网膜色素上皮细胞。按照Cell 131, 861-872, 2007中描述的方法，通过包括使用反转录病毒向人皮肤来源的成纤维细胞中引入Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的方法来建立iPS细胞。
59SV2、59SV3和59SV9是通过诱导来源于同一色素性视网膜炎患者的人iPS细胞分化而获得的视网膜色素上皮细胞。按照Proc. Jpn. Acad., Ser. B 85 (2009) 348-362中描述的方法，通过包括使用Sendai病毒向人皮肤来源的成纤维细胞中引入Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的方法来建立iPS细胞。
K21EV15、101EV3、K11EV9和454E2是通过诱导来源于彼此不同的色素性视网膜炎患者的人iPS细胞分化而获得的视网膜色素上皮细胞。按照Nat Methods. 2011 May; 8(5): 409-12)中描述的方法，通过包括使用附加型载体向人皮肤来源的成纤维细胞中引入人Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc和LIN28的方法来建立iPS细胞。
<猴iPS来源的视网膜色素上皮细胞>
46a是按照Jpn. J. Transplant. 44, 231-235中描述的方法通过诱导猴（食蟹猴）iPS细胞分化而获得的视网膜色素上皮细胞。
<ES来源的视网膜色素上皮细胞>
hES是通过诱导人ES细胞系khES-1分化而获得的视网膜色素上皮细胞。CMK6是按照Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131中描述的方法通过诱导猴ES细胞分化而获得的视网膜色素上皮细胞。
实施例 1. 视网膜色素上皮细胞片层的生产方法
<胶原凝胶混合溶液的制备>
制备A：猪腱来源的酸可溶性I型胶原细胞基质I-A (Nitta Gelatin, 3.0 mg/ml)，B：以5倍浓度的浓缩培养基[将DMEM/F12 (Invitrogen, 12500-062, 3 g)溶于MilliQ水中，并且将总体积(50 ml)用滤器处理]，和C：再生缓冲液[将1N NaOH (50 mM, 5 ml)、NaHCO3 (260 mM, 2.2 g)和HEPES (200 mM, 4.77 g)溶于MilliQ水中，并且将总体积(100 ml)用滤器处理]。冷却后，将B（2体积）与A（7体积）混合（淡黄色），不能起泡。随后，将C（1体积）加入并混合混合物（淡粉色）来生成0.21%的胶原凝胶混合溶液。
<视网膜色素上皮细胞片层的制备>
将0.21%的胶原凝胶混合溶液（200 μl）加入到12 mm transwell插入物(0.4 μm孔聚酯膜; Cornig, 3460)的插入物中，并且将混合物在37℃下孵育30 min。随后，将F10-10% FBS [F-10 (Sigma, N6908, 445 ml)、FBS (50 ml)、青霉素-链霉素(Invitrogen, 15140-122, 5 ml)]1500 μl加入到插入物的外部以及500 μl加入到插入物的内部，并将transwell在37℃下孵育24小时。随后，用F10-10% FBS洗涤插入物的内部和外部一次，将在生产实施例1中获得的各种视网膜色素上皮细胞按5×105个细胞(F10-10% FBS, 500 μl)接种到插入物内部，并将F10-10% FBS (1500 μl)加入插入物的外部。在F10-10% FBS中培养视网膜色素上皮细胞直至汇合。达到汇合后，将培养基更换为SFRM-B27 [DMEM (Sigma, D6046, 350 ml)、F12 HAM (Sigma, N6658, 150 ml)、B27 (Invitrogen, 17504-044, 10 ml)、200 mM L-谷氨酰胺 (Sigma, G7513, 5 ml)、青霉素-链霉素(Invitrogen, 15140-122, 5 ml)、bFGF (wako, 060-04543, 10 ng/ml)]（1500 μl至插入物的内部，500 μl至插入物的内部，培养基更换为3次/周），并且培养视网膜色素上皮细胞直至它们显示出合适的颜色和形状。
<切出>
从培养起始进行6周后，去除插入物的膜，将胶原酶L(Nitta Gelatin, PBS(+): Sigma, 2600 U/ml, 100 μl)加入到插入物下，并将插入物在37℃下孵育60 min并用PBS(+)洗涤3次。将SFRM-B27逐滴加入以使视网膜色素上皮细胞片层不会变干，并用PALM MicroBeam (ZEISS)切成所需大小。
实施例 2. 视网膜色素上皮细胞片层的生产方法（胶原种类）
除了在实施例1中使用253G1（iPS-视网膜色素上皮细胞）生成细胞片层的步骤中，分别用以下步骤：（A）使用猪皮肤来源的I型胶原TE（特殊订货产品：主要包含I型胶原、少量的III型胶原、Nitta Gelatin, 5 mg/ml）作为0.35%胶原混合溶液/孔，（B）使用猪腱来源的I型胶原T-1002（特殊订货产品：I型胶原、Nitta Gelatin, 5.1 mg/ml）作为0.35%胶原混合溶液/孔，（C）使用FITC标记的胶原I (Chondrex, 1 mg/ml)作为0.07%胶原混合溶液/孔，（D）使用FITC标记的胶原I (特殊订货，Chondrex, 3 mg/ml)作为0.21%胶原混合溶液/孔，（E）使用去端肽胶原(KOKEN, 3 mg/ml)作为0.21%胶原混合溶液/孔，和（F）使用用于细胞培养的渗透性胶原膜(KOKEN)，来代替猪腱来源的酸可溶性I型胶原细胞基质I-A (Nitta Gelatin, 3 mg/ml)作为0.21%胶原混合溶液/孔之外，以与实施例1中相同的方式，生成并切出细胞片层来获得视网膜色素上皮细胞片层。
比较实施例1的检测结果和使用每一种上述胶原的情况，并评价以下4项[1.凝胶强度; 2. 细胞粘附; 3.细胞生长; 4. 安全性]。结果是：(A) {1. 差; 2. 相同; 3. 差; 4. 好}, (B) {1. 好 (5.1 mg/ml); 2. 相同; 3. 差; 4. 好}, (C) {1. 差 (1 mg/ml); 2. 差; 3. 未知; 4. 未知}, (D) {1. 相同 (3 mg/ml); 2. 相同; 3.差; 4. 未知}, (E) {1. 相同 (3 mg/ml); 2. 差; 3. 未知; 4. 好}, 和(F) {未被胶原酶溶解，因此无法使用}。至于凝胶强度，需要某一水平的强度以保证视网膜色素上皮细胞的生长。从这一方面，尤其优选的胶原种类和浓度是以上述浓度使用的实施例1的猪腱来源的酸可溶性I型胶原细胞基质I-A和（B）猪腱来源的I型胶原T-1002。当基材不具有某一水平强度时，视网膜色素上皮无法生长并且不能用于本发明。
实施例 3. 视网膜色素上皮细胞片层的生产方法（胶原量）
除了在实施例1的使用253G1（iPS-视网膜色素上皮细胞）生成细胞片层的步骤中，将使用的胶原凝胶混合溶液的量从200 μl变为100 μl或300 μl之外，以与实施例1中相同的方式，生成并切出细胞片层，由此回收视网膜色素上皮细胞片层。
与实施例1相比，当所用的胶原凝胶混合溶液的量为100 μl时，由于少量的胶原凝胶混合溶液所导致的表面张力的影响，在中心部分形成薄的胶原凝胶层，并且，当培养进行时，接种的视网膜色素上皮细胞容易直接接触底膜，其导致在切出片层的操作过程中视网膜色素上皮细胞片层的破裂。当所用的胶原凝胶混合溶液的量为300 μl时，由于胶原凝胶混合溶液的量高，形成厚的胶原凝胶层，其相对降低了可以保持在插入物中的培养基的量，并且因此，不易进行保持培养，胶原酶处理耗费时间，并且担心细胞片层上的损伤加重。当所用的胶原凝胶混合溶液的量为100 μl时，细胞直接与膜接触，并且在去除膜时细胞片层从该部分处断裂。
实施例 4. 视网膜色素上皮细胞片层的生产方法（胶原酶的量和处理时间）
除了在实施例1的使用253G1（iPS-视网膜色素上皮细胞）生成细胞片层的步骤中，将1%的胶原酶L (Nitta Gelatin)或I型胶原酶(Roche)以10 μl的量与视网膜色素上皮细胞片层接触10 min，以10 μl的量接触20 min，以10 μl的量接触30 min，以20 μl的量接触20 min，以20 μl的量接触60 min，和以30 μl的量接触50 min，来代替以30 μl的量接触30 min之外，以与实施例1中相同的方式，生成并切出细胞片层，由此回收视网膜色素上皮细胞片层。
结果是，当以10 μl的量进行胶原酶处理60 min或以20 μl的量处理60 min时，观察到与以30 μl的量处理30 min时相同水平的胶原降解。
实施例 5. 视网膜色素上皮细胞片层的生产方法（接种细胞的数目）
除了在实施例1的使用253G1（iPS-视网膜色素上皮细胞）生成细胞片层的步骤中，将接种到插入物内部的细胞数目从5×105细胞/500 μl改为(A) 5×104细胞/500 μl、(B) 1×105/500 μl或(C) 1×106/500 μl之外，以与实施例1中相同的方式，生成并切出细胞片层，由此回收视网膜色素上皮细胞片层。
与实施例1相比，由于细胞数目少，(A)和(B)需要更长时间来达到细胞汇合，并且(C)显示出缓慢生长并且还趋于需要更长时间来达到细胞汇合。
实施例 6. 在视网膜色素上皮细胞片层上形成的基膜
从在实施例1中从253G1（iPS-视网膜色素上皮细胞）生成的细胞片层制作冷冻切片（冰冻切片），并用于免疫组织化学染色。通过ZO-1的表达确定紧密结合的形成，并且通过层粘连蛋白和IV型胶原的表达确定基膜的形成。对于每一蛋白的检测，使用由Zymed制造的兔抗ZO-1 (1:100稀释)、由Abcam制造的兔层粘连蛋白(1:200稀释)和由Calbiochem制造的小鼠抗人IV型胶原抗体(1:40)的各自抗体。此外，从使用由Molecular Probes制造的4’,6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI; 1 μg/ml)的核染色状态来确定视网膜色素上皮细胞片层具有单层上皮形式。
评价 1. 细胞片层的视网膜色素上皮细胞特异性基因表达概况
在实施例1中从59SV3、59SV9（iPS-视网膜色素上皮细胞）生成细胞片层的步骤中，在过去1周、4周、2个月之后（其中在细胞汇合后将培养基更换为SFRM-B27的日期为第0天），通过RT-PCR确定BEST1、RPE65、MERTK、CRALBP在构成片层的细胞中的表达。结果是，观察到与阳性对照（人视网膜色素上皮细胞总RNA（由ScienCell制造, 货号 6545））的表达相同水平的表达。此处，BEST1、RPE65、MERTK是特异性表达于视网膜色素上皮细胞中的基因。CRALBP是表达于视网膜色素上皮细胞和Muller细胞中的基因。
评价 2. 视网膜色素上皮片层中残留胶原的测定
在胶原酶处理之前或之后，通过从实施例1的253G1（iPS-视网膜色素上皮细胞）生成的各个细胞片层切出来制作冷冻切片（冰冻切片），并用于免疫组织化学染色。将细胞核用由Molecular Probes制造的4’,6-二脒-2-苯基吲哚(DAPI; 1 μg/ml)染色，并且将1型胶原用由Calbiochem制造的兔抗人I型胶原抗体（1:40稀释）染色。结果是，在胶原酶处理后的片层中未检测到胶原，并且确定了胶原酶去除了培养皿上包被的胶原。另一方面，在胶原酶处理前切出的片层中检测到胶原。
评价 3. 视网膜色素上皮细胞片层的细胞因子分泌能力
在从实施例1的253G1（iPS-视网膜色素上皮细胞）和454E2（iPS-视网膜色素上皮细胞）生成的细胞片层中切出视网膜色素上皮细胞片层的步骤之前，回收transwell的顶面侧和基面侧上的培养基，并且按照Arvydas M, IOVS. 2006; 47: 3612-3624中描述的方法通过ELISA检测VEGF和PEDF的产生量。结果是，确定与Arvydas M, IOVS. 2006; 47: 3612-3624中报道的人胚胎来源的视网膜色素上皮相似，VEGF主要在基面侧上分泌，而PEDF主要在顶面侧上分泌（图1）。显示出本发明的细胞片层具有与活体生物中的细胞片层相似的细胞因子分泌能力，并且在功能性上是优异的。
评价 4. 视网膜色素上皮细胞片层的跨上皮电阻
在细胞层的屏障功能和阻抗之间，即跨上皮/跨内皮电阻（TER）之间观察到紧密相关。在切出从实施例1的454E2（iPS-视网膜色素上皮细胞）生成的视网膜色素上皮细胞片层的步骤之前，按照MILLIPORE描述的方法(使用Millicell ERS-2)，将探针置于插入物内部和外部的培养基中，并且用电测定TER。结果是，TER为640Ω･cm2，并且显示出与Nature Protocols vol 4, No 5 662-673 (2009), 图10中报道的人胚胎来源的视网膜色素上皮相似的高TER值。显示出本发明的细胞片层具有与活体生物中的细胞片层相似的高屏障功能。
评价 5. 来源于猴 ES 细胞的视网膜色素上皮细胞片层的移植
按照Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995 Feb; 36(2): 381-90中描述的方法，将实施例1中从猴ES细胞来源的视网膜色素上皮细胞CMK6产生的猴视网膜色素上皮细胞片层移植到猴的一个眼中。移植前，进行视网膜光凝固法将待移植的眼的视网膜损伤。在向具有其中形成视网膜光凝固斑的猴的一个眼中进行移植的第28天，拍摄眼的眼底照片，并且通过使用OCT（光学相干计算机断层摄影术）形成眼底切片图像作为组织切片，根据其确定视网膜的状况。结果是，通过荧光素血管造影术没有发现荧光泄漏，移植物存活，并且未发现病症诸如感觉视网膜变薄等。
评价 6. 来源于猴 iPS 细胞的视网膜色素上皮细胞片层的移植
按照Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995 Feb; 36(2): 381-90中描述的方法，将实施例1中从猴iPS细胞来源的视网膜色素上皮细胞46a产生的猴视网膜色素上皮细胞片层移植到一个眼的视网膜下进行自体移植以及三个眼的视网膜下进行交叉移植。直到移植后一年，拍摄眼底照片，并且通过使用OCT（光学相干计算机断层摄影术）形成眼底切片图像作为组织切片，根据其观察视网膜随时间推移的状况。在交叉移植中，发现了明显的排斥反应，诸如移植物周围纤维性变化，通过荧光素血管造影术发现荧光泄漏和通过OCT发现视网膜下高亮度损伤。另一方面，在自体移植中，未发现这种明显排斥，通过荧光素血管造影术没有发现荧光泄漏，移植物存活，并且未发现病症诸如感觉视网膜变薄等。
产业实用性
使用本发明的方法，可以比较方便地生产通过移植向患有年龄相关性黄斑变性的患者应用的视网膜色素上皮细胞片层。尤其是，当用于培养的细胞是iPS细胞来源的视网膜色素上皮细胞时，可以利用患者自身的细胞，其可以避免移植中的排斥。此外，由于通过本发明的方法获得的细胞片层具有由与活体生物中相同组分制成的基膜，因此可以复制更接近活体生物状态的视网膜色素上皮细胞片层，其可用于多种筛选目的。
本申请基于在日本申请的专利申请号2011-040130(申请日: 2011年2月25日)，其内容完整地并入本文。

Claims (8)

1.细胞片层的生产方法，其包括以下步骤
（1）在胶原凝胶上接种并培养视网膜色素上皮细胞以形成由所述视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层，和
（2）用胶原酶降解所述胶原凝胶来分离由所述视网膜色素上皮细胞构成的细胞片层。
2.权利要求1的细胞片层的生产方法，其中所述视网膜色素上皮细胞是通过诱导干细胞或祖细胞分化获得的细胞。
3.权利要求2的细胞片层的生产方法，其中所述干细胞是ES细胞或iPS细胞。
4.权利要求1的细胞片层的生产方法，其中所述胶原凝胶中胶原的浓度为0.1% - 0.5%。
5.权利要求1-4中任一项的细胞片层的生产方法，还包括以下步骤（3）：
（3）确认基膜是否存在于分离的细胞片层和所述胶原凝胶之间的接触表面上。
6.通过权利要求1-5中任一项的方法生产的细胞片层。
7.用于移植的细胞片层，包含由通过先体内后体外诱导干细胞或祖细胞分化获得的视网膜色素上皮细胞形成的细胞片层和由所述细胞分泌的基膜。
8.用于筛选的细胞片层，包含由通过先体内后体外诱导干细胞或祖细胞分化获得的视网膜色素上皮细胞形成的细胞片层和由所述细胞分泌的基膜。
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