JP7333573B1 - 接着細胞の細胞剥離方法、接着細胞の培養方法および接着細胞培養用のキット - Google Patents
接着細胞の細胞剥離方法、接着細胞の培養方法および接着細胞培養用のキット Download PDFInfo
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Abstract
Description
また、接着細胞の細胞培養容器への接着性を高めるために、細胞培養容器の表面に、プラズマ処理、ゼラチンコーティング、コラーゲンコーティングなどの表面処理を行う技術が知られている(たとえば、特許文献1)。
さらに、接着細胞の接着性を高めるために、従来、プラズマ処理、ゼラチンコーティング、コラーゲンコーティングなどの表面処理を行った細胞培養容器が提供されていたが、これら表面処理を行った細胞培養容器は高価であり、このような点も、製造コストを増大する要因となっていた。
上記接着細胞の細胞剥離方法において、前記接着細胞の培養に使用した液体培地を除去することなく、前記Protease XIVを添加して、前記接着細胞を剥離する構成とすることができる。
上記接着細胞の細胞剥離方法において、前記接着細胞の培養に使用した液体培地を除去し、前記液体培地を除去した後に、前記細胞培養基材を洗浄することなく、前記Protease XIVを添加して、前記接着細胞を剥離する構成とすることができる。
上記接着細胞の細胞剥離方法において、前記剥離工程の後に、前記剥離工程で添加した前記プロテアーゼを失活させる処理をすることなく、剥離した前記接着細胞を回収する回収工程をさらに有する構成とすることができる。
上記接着細胞の細胞剥離方法において、前記Protease XIVが、Streptomyces griseus由来のプロテアーゼである構成とすることができる。
本発明に係る接着細胞の培養方法は、接着細胞を前記細胞培養容器で培養する培養工程と、上記接着細胞の細胞剥離方法による剥離工程と、を有する。
本発明に係る接着細胞培養用のキットは、シルクプロテイン、シルクプロテインの加水分解物、フィブロイン、フィブロインの加水分解物のうちいずれか1以上のタンパク質を有効成分として含有する細胞培養基材、または、前記細胞培養基材がコーティングされた細胞培養容器と、前記細胞培養基材に接着した接着細胞の剥離剤であるProtease XIVとを含む。
本実施形態に係る細胞培養基材は、接着細胞の培養容器への接着性を高めるための足場材料として機能する基材であり、細胞培養容器をコーティングするコーティング剤として用いることができる基材である。本実施形態において、細胞培養基材は、酵素により分解可能であるとともに、細胞培養容器の底部表面に固着して足場材料として機能する、接着細胞が有しないタンパク質を有効成分として含有することを特徴とする。より具体的には、細胞培養基材は、シルクプロテイン、シルクプロテインの加水分解物、フィブロイン、または、フィブロインの加水分解物を有効成分として含有することを特徴とする。
本実施形態に係る細胞培養容器は、上述した本実施形態に係る細胞培養基材を、未処理の細胞培養容器の底部表面に塗布し、コーティングしたものである。具体的には、シルクプロテイン、シルクプロテインの加水分解物、フィブロイン、または、フィブロインの加水分解物を有効成分として含有する液体状の細胞培養基材を、表面未処理の細胞培養容器の底部表面に滴下あるいはスプレーして底部表面にまんべんなく塗布した後に、乾燥機に入れるなどして底部表面を乾燥させる。あるいは、シルクプロテイン、シルクプロテインの加水分解物、フィブロイン、または、フィブロインの加水分解物などの有効成分が液体培地に溶け出てしまわないように、乾燥させた細胞培養容器の底部表面に、エタノールやメタノールを添加して接触させることで、あるいは、水蒸気飽和状態で1晩程度放置することで、シルクプロテイン、シルクプロテインの加水分解物、フィブロイン、または、フィブロインの加水分解物などの有効成分の不溶化処理が行われる。これらの処理の後に本実施形態の細胞培養容器を乾燥しても良い。
次に、本実施形態に係る細胞培養容器を用いて培養した接着細胞の剥離方法について説明する。まず、図1および図2に基づいて、従来のトリプシンを用いた細胞剥離方法の手順と、本実施形態に係る細胞剥離方法の手順とについて説明する。図1は、従来のトリプシンを用いた接着細胞の剥離方法の手順を説明するためのフローチャートであり、図2は、本実施形態に係る接着細胞の剥離方法の手順を説明するためのフローチャートである。
後述する実施例1~10では、特に明示する場合を除いて、以下に説明するように、フィブロインを有効成分とする細胞培養基材を作製した。具体的には、まず、乾燥させた家蚕繭を1cm四方程度にカットした。そして、乾燥した家蚕繭10gに対して、0.02M(mol/L)の炭酸ナトリウム溶液1Lを加え、95~98℃で30分程度撹拌し家蚕繭からセリシンを取り除き、フィブロイン繊維を得た。その後、得られたフィブロイン繊維をイオン交換水または超純水で洗浄し、炭酸ナトリウムを除去し乾燥させた。乾燥させた精練繭(フィブロイン繊維)3gに対して、9M(mol/L)の臭化リチウム溶液を50ml加えて、精練繭を溶解した。なお、臭化リチウム溶液を加えた後は、25℃程度の室温にて、一定時間、手作業で撹拌し、精練繭が溶液化したことを確認してから、スターラーで1晩撹拌した。そして、溶解した50ml程度のフィブロイン溶液を透析フィルム(直径28mm程度、分画分子量12,000~14,000)に入れ8Lのイオン交換水または超純水で半日程度かけて透析する工程を6回繰り返した。これにより、溶液中の臭化リチウムを取り除いた。さらに、透析を終えたフィブロイン水溶液の濃度を測定し、イオン交換水または超純水を加えて0.1~1.0%の濃度に調整した。なお、透析を終えたフィブロイン水溶液の濃度の測定は、直接重量法(透析を終えたフィブロイン水溶液を全蒸発させた残留物(フィブロイン)の重量を求めることで、フィブロイン水溶液の濃度を測定する方法)により行った。これにより、以下に説明する実施例1~10で用いる細胞培養基材(以下、本実施例に係る細胞培養基材ともいう)を得た。
また、後述する実施例11~13では、フィブロインおよびセリシンを有効成分とする細胞培養基材、または、フィブロインの加水分解物を有効成分とする細胞培養基材を作製した。実施例11~13における細胞培養基材の作製方法については、実施例11~13でそれぞれ説明する。
本実施例では、特に明示する場合を除き、以下のように、細胞培養基材をコーティングした細胞培養容器を作製した。具体的には、本実施例に係る細胞培養基材を、シャーレの内側底部に塗布した。なお、塗布する細胞培養基材は、容器の底面表面が全体的になじむ程度の量とし、多く塗布した場合は、不要分をスポイトなどで取り除いた。そして、シャーレを乾燥機に入れ、細胞培養基材の水分を蒸発させた。さらに、シャーレ表面を完全に乾燥させた後に、80%メタノールをシャーレの底面表面に全体的になじむ程度に塗布し、室温または乾燥機でメタノールを蒸発させることで、不溶化処理を行った。また、80%メタノールで不溶化する代わりに、水蒸気飽和状態で1晩程度放置することで不溶化処理も行った。このようにして、本実施例で用いる細胞培養容器(以下、本実施例に係る細胞培養容器ともいう。)を製作した。
実施例1では、本実施例に係る細胞培養容器を用いて、接着細胞を培養できるかを検証した。具体的には、実施例として、本実施例に係る細胞培養容器を用いて、接着細胞を培養し、比較例として、本実施例に係る細胞培養基材をコーティングしていない表面未処理(疎水性)のポリスチレンシャーレを用いて接着細胞を培養した。図4は、実施例1における細胞培養の検証結果を示す図であり、(A)は本実施例に係る細胞培養基材をコーティングしていない表面未処理のシャーレを用いて接着細胞を3日間培養した後のシャーレの撮像画像であり、(B)は本実施例に係る細胞培養基材をコーティングしたシャーレ(本実施例に係る細胞培養容器)を用いて接着細胞を3日間培養した後のシャーレの撮像画像である。なお、(B)においては、フィブロインを1%含有する細胞培養基材を用いて細胞培養容器を製作した。
実施例2では、本実施例に係る接着細胞の培養と、従来の接着細胞の培養とを比較し相違があるかを検証した。具体的には、実施例として、本実施例に係る細胞培養容器を用いて接着細胞をそれぞれ異なる培養時間で培養した後、酵素を用いて培養した接着細胞を剥離して回収し、回収した接着細胞群における乳酸脱水素酵素の活性量を計測し、接着細胞の細胞数を算出することで、本実施例に係る方法での増殖曲線を作成した。また、比較例として、従来の細胞培養容器(真空プラズマ処理を施した細胞培養容器)を用いて接着細胞の培養をそれぞれ異なる培養時間で培養した後、トリプシンを用いて培養した接着細胞を剥離し回収することで、従来の方法での増殖曲線も作成した。図5に、本実施例に係る方法で接着細胞を培養した実施例における増殖曲線と、従来の方法で接着細胞を培養した比較例における増殖曲線とを示す。図5に示すように、本実施形態に係る細胞培養容器を用いて接着細胞を培養した場合でも、従来と同様の(むしろ従来よりも多くの)接着細胞の増殖が観察され、従来と同様の(むしろ従来よりも多くの)接着細胞が得られることがわかった。
実施例3では、本実施例に係る細胞培養容器を用いて培養した接着細胞を継代した場合でも、継代前と同様に、継代後の接着細胞も培養することができるかを検証した。具体的には、実施例として、本実施例に係る細胞培養容器を用いて接着細胞を培養した後、新たに、本実施例に係る細胞培養容器に継代を行い、1~6日目の接着細胞の様子を顕微鏡により観察した。また、比較例として、従来の細胞培養容器(真空プラズマ処理を行った細胞培養容器)を用いて接着細胞を培養した後に、新たに、従来の細胞培養容器に継代を行い、1~6日目の接着細胞の様子を顕微鏡により観察した。図6は、実施例3の検証結果を示す図であり、本実施例に係る方法で培養した接着細胞の継代後の撮像画像(実施例)と、従来の方法で培養した接着細胞の継代後の撮像画像(比較例)とを示す。図6に示すように、本実施例に係る細胞培養容器を用いて培養した接着細胞の継代後の増殖形態も、継代から6日経っても、従来の細胞培養容器を用いて培養した接着細胞の継代後の増殖形態と同様となり、本実施形態に係る細胞培養容器を用いて培養した接着細胞も、継代後も適切に培養することができることがわかった。
実施例4では、本実施例に係る細胞培養容器を用いて培養した接着細胞を、酵素を用いて剥離することができるかを検証した。図7(A)は、実施例1において、本実施例に係る細胞培養基材をコーティングしたシャーレ(本実施例に係る細胞培養容器)を用いて接着細胞を3日間培養した後のシャーレの撮像画像(図4の(B)と同じ撮像画像)であり、図7(B)は、(A)の接着細胞を0.1U/mlのProtease XIVを用いて剥離した後のシャーレの撮像画像である。図7(B)に示すように、本実施形態に係る細胞培養基材をコーティングした本実施形態に係る細胞培養容器を用いて培養した接着細胞は、フィブロインを分解可能な酵素(Protease XIV)により剥離することができることがわかった。
実施例5では、従来の細胞培養容器(真空プラズマ処理を行った細胞培養容器)で培養した接着細胞を、本実施例に係る酵素を用いて剥離できるかを検証した。図8は、実施例5における検証結果を示す図であり、(A)は、従来の細胞培養容器で培養した接着細胞を、トリプシンを用いて剥離した場合のシャーレの撮像画像を示し、(B)~(F)は、従来の細胞培養容器で培養した接着細胞を、酵素(Protease XIV)を用いて剥離を試みた場合のシャーレの撮像画像である。なお、(B)では0.1U/mlのProtease XIVを用い、(C)では0.5U/mlのProtease XIVを用い、(D)では1.0U/mlのProtease XIVを用い、(E)では2.0U/mlのProtease XIVを用い、(F)では5.0U/mlのProtease XIVを用いた。また、(A)~(F)においては、各酵素を37℃で10分間反応させた。図8(A)に示すように、従来の細胞培養容器で培養した接着細胞はトリプシンにより剥離することができたが、図8(B)~(F)に示すように、Protease XIVを用いて剥離することはできなかった。
実施例6では、本実施例に係る細胞培養基材におけるフィブロインの濃度を変えた場合、また、細胞培養容器を製作する際の不溶化処理の方法によって、接着細胞の増殖のしやすさや剥離のしやすさに変化があるかを検証した。ここで、図9~12は、実施例6における検証結果を示す図であり、図9,10は、80%メタノールを用いて不溶化処理を行った場合、図11,12は、水蒸気を用いて不溶化処理を行った場合を示す。また、実施例6では、接着細胞を3日間培養した後、リン酸緩衝液でシャーレを洗浄し、その後、1U/mlのProtease XIVを0.5ml添加し、37℃で5分反応させた後、リン酸緩衝液を用いて再度洗浄を行った。なお、図9~12において、(1)は細胞培養基材におけるフィブロインの濃度が1%の場合、(2)は細胞培養基材におけるフィブロインの濃度が0.5%の場合、(3)は細胞培養基材におけるフィブロインの濃度が0.1%の場合、(4)は細胞培養基材におけるフィブロインの濃度が0.05%の場合、(5)は細胞培養基材におけるフィブロインの濃度が0.01%の場合、(6)は細胞培養基材におけるフィブロインの濃度が0.005%の場合を示す。また、図9~12の(1)~(6)において、上段の画像は、Protease XIVによる接着細胞の剥離前の状態を示し、中段の画像は、Protease XIVによる接着細胞の剥離直後の状態を示し、下段の画像は、Protease XIVによる接着細胞の剥離後さらにリン酸緩衝液で洗浄した後の状態を示す。
実施例7では、酵素の濃度による接着細胞の剥離の影響を検証した。具体的には、フィブロインを0.1%含有する細胞培養基材を用い、メタノールで不溶化した細胞培養容器を用いて接着細胞を3日間培養し、液体培地を除去し、リン酸緩衝液で洗浄した後に、各濃度のProtease XIVを添加し、37℃で5分反応させた。図13は、実施例7の検証結果を示す図であり、(A)はProtease XIVによる剥離前の状態を示す図であり、(B)は0.01U/mlのProtease XIVによる剥離後の状態を示す図であり、(C)は0.05U/mlのProtease XIVによる剥離後の状態を示す図であり、(D)は0.1U/mlのProtease XIVによる剥離後の状態を示す図であり、(E)は0.5U/mlのProtease XIVによる剥離後の状態を示す図であり、(F)は1.0U/mlのProtease XIVによる剥離後の状態を示す図である。図13(B)~(F)に示すように、Protease XIVは0.01U/ml以上とすることで接着細胞を十分に剥離することができることがわかった。また、Protease XIVを(D)~(F)の0.1U/ml以上とすることで、より好適に接着細胞を剥離することができることがわかった。なお、図示していないが、フィブロインを1%含有する細胞培養基材を用いた場合でも、フィブロインを0.1%含有する細胞培養基材を用いた場合と同様の結果が得られた。また、水蒸気を用いて不溶化した場合も、メタノールで不溶化した場合と同様の結果が得られた。
実施例8では、本実施例に係る細胞培養基材をオートクレーブで滅菌し、オートクレーブ滅菌した細胞培養基材でコーティングした細胞培養容器を用いて接着細胞の培養および剥離が可能であるかを検証した。具体的には、本実施例に係る細胞培養基材を120℃および20分でオートクレーブにかけた後、滅菌済みの表面未処理(疎水性)のポリスチレンプレートに、滅菌した細胞培養基材を塗布し乾燥させた後に、不溶化処理を行い、細胞培養容器を製作した。そして、製作した細胞培養容器を用いて接着細胞を4日間培養した後に、0.1U/mlのProtease XIVを5分間反応させて、接着細胞の剥離を行った。なお、図14および図15は、実施例8における検証結果を示す図であり、図14は、本実施例に係る細胞培養基材をオートクレーブで滅菌した後、滅菌した細胞培養基材を用いて製作した細胞培養容器で培養した接着細胞を観察した撮像画像を示し、図15は、本実施例に係る細胞培養基材をオートクレーブで滅菌した後、滅菌した細胞培養基材を用いて製作した細胞培養容器で培養した接着細胞を剥離した状態を観察した撮像画像を示す。
実施例9では、本実施例に係る細胞培養容器を用いて接着細胞を培養し、液体培地を除去した後に、リン酸緩衝液で洗浄することなく、酵素を添加し、接着細胞を剥離できるかを検証した。具体的には、本実施形態に係る細胞培養基材(フィブロイン溶液)を120℃および20分でオートクレーブにかけて滅菌処理した後に、表面未処理(疎水性)のポリスチレンプレートに、フィブロイン溶液を塗布し不溶化処理を行うことで、本実施例に係る細胞培養容器を製作し、この細胞培養容器を用いて接着細胞の培養を4日間行った。その後、細胞培養容器から液体培地を除去し、かつ、リン酸緩衝液で洗浄しない状態のままで、シャーレに0.1U/mlのProtease XIVを添加し5分間反応させて、培養した接着細胞を剥離させた。図16は、実施例9の検証結果を示す図であり、(A),(D)は、0.1%のフィブロイン溶液を塗布し、水蒸気飽和状態で1晩程度放置して不溶化した場合を示し、(B),(E)は1%のフィブロイン溶液を塗布し、水蒸気飽和状態で1晩程度放置して不溶化した場合を示す。また、図16(C),(F)は、比較例であり、従来の組織培養用ポリスチレンプレートで培養した接着細胞を、培養液除去後、リン酸緩衝液で洗浄することなく、トリプシンを用いて剥離した場合を示す。図16(C),(F)に示すように、組織培養用ポリスチレンプレートで培養した接着細胞では、液体培養を除去した後、リン酸緩衝液で洗浄しない場合には、トリプシンを用いても剥離が不十分となり、リン酸緩衝液での洗浄が必要となることがわかった。これに対して、図16(A),(B),(D),(E)に示すように、本実施形態に係る細胞培養容器で培養した接着細胞は、液体培地を除去した後、リン酸緩衝液で洗浄しなくても、Protease XIVにより十分に接着細胞を剥離できることがわかった。
実施例10では、本実施例に係る細胞培養容器を用いて接着細胞を培養した後、液体培地を除去することなく、酵素を添加し、接着細胞を剥離できるかを検証した。具体的には、本実施形態に係る細胞培養基材(フィブロイン溶液)を120℃および20分でオートクレーブにかけて滅菌処理した後に、表面未処理(疎水性)のポリスチレンシャーレ(60mmφ)に、フィブロイン溶液1mlを添加し、室温で30分後にフィブロイン溶液を取り除き、インキュベーター内で一晩放置して不溶化処理を行った。そして、製作した細胞培養容器に、接着細胞(40,000セル/シャーレ)を播種し、接着細胞の培養を3日間行った。その後、細胞培養容器から液体培地を除去することなく、細胞培養容器にProtease XIVを添加し5~30分間反応させて、培養した接着細胞を剥離させた。図17および図18は、実施例10の検証結果を示す図であり、図17では、本実施例に係る細胞培養容器を用いて接着細胞を培養した後に、液体培地中におけるProtease XIVの濃度が0.1U/ml、0.5U/mlまたは1.0U/mlとなるように、Protease XIVを添加し、添加後、5分、15分および30分での状態を観察した。図17に示すように、0.1U/ml以上となるようにProtease XIVを添加すると、添加から5分程度で接着細胞の一部がめくれるように剥離した。ただし、Protease XIVの濃度が0.1U/mlの場合には、添加30分後においても剥離せずに接着したままの接着細胞が残った。一方、Protease XIVの濃度が0.5U/mlの場合は、添加15分後において多くの細胞が剥離し、添加30分後においてほとんどの細胞が剥離した。Protease XIVの濃度が1.0U/mlの場合は、添加15分後においてほとんどの細胞が剥離した。
実施例11では、セリシンとフィブロインとを混合した細胞培養基材を用いた細胞培養容器を作製した。具体的には、繭から精錬したフィブロインを、塩化カルシウム、エタノールおよび純水を8:2:1で混合した溶液に溶解させ、フィブロインを1重量%含むフィブロイン溶液を作製した。また、繭0.25gに20ml程度の純水を加え、120℃で20分間、加熱処理して抽出して、セリシンを1重量%含むセリシン水溶液を作製した。そして、フィブロイン溶液とセリシン水溶液とを重量比で7:3、5:5、3:7、0:10の割合でそれぞれ混合して混合液を調製した。調整した混合液を120℃および20分でオートクレーブ滅菌し、シャーレに各混合液をそれぞれ塗布した後に、50℃で一晩乾燥させ、実施例11に係る細胞培養容器を作製した。なお、実施例11では不溶化処理は行わなかった。そして、完成した細胞培養容器を用いて、接着細胞(HIH3T3細胞)を4日間培養した。
上述した実施例11では、フィブロインを含まず、セリシンのみを含有する細胞培養基材を用いた細胞培養容器では、接着細胞の培養は可能であったが、プロテアーゼを用いた剥離ができないことがわかった。そこで、実施例12では、セリシンとフィブロインとを混合した細胞培養基材において、どの程度フィブロインが必要となるか(必要となるフィブロインの割合)を検証した。具体的には、実施例12では、フィブロイン溶液とセリシン水溶液とを重量比でそれぞれ1:9、0.5:9.5、0.1:9.9で混合した細胞培養基材を調製した。なお、フィブロイン溶液とセリシン水溶液の作製方法は、実施例11と同じである。そして、混合した混合液を120℃および20分でオートクレーブ滅菌を行い、シャーレに塗布することで、実施例12に係る細胞培養容器を作製した。なお、細胞培養基材を細胞培養容器に塗布した後、50℃で一晩乾燥させ、不溶化処理は行わなかった。そして、作製した細胞培養容器を用いて、接着細胞(HIH3T3細胞)を3日間培養した。図21に、実施例12の細胞培養容器を用いて接着細胞を培養した後のシャーレの撮像画像を表示する。図21に示すように、フィブロイン溶液とセリシン水溶液とをそれぞれ1:9、0.5:9.5、0.1:9.9で混合した混合液を含有する細胞培養基材を用いた細胞培養容器の全てで、接着細胞を培養することができたが、実施例11と比べて、接着細胞の細胞培養基材への接着は低下傾向にあった。
実施例13では、フィブロインを加水分解した、フィブロイン加水分解物を有効成分とする細胞培養基材を含有する細胞培養容器を用いて、接着細胞の培養および細胞剥離を行った。具体的には、フィブロインを8重量%含むフィブロイン水溶液に、2Nとなるように水酸化ナトリウムを加え、60℃で1時間加水分解を行った。さらに、得られた加水分解物を塩酸により中和し、透析により加水分解フィブロイン水溶液を製作した。次いで、加水分解フィブロイン水溶液を120℃で20分、オートクレーブ滅菌し、フィブロイン当たりの重量が1重量%および0.1重量%となる濃度となる細胞培養基材を作製した。そして、作成した細胞培養基材を細胞培養容器に塗布した後、50℃で一晩乾燥させた。なお、フィブロイン当たりの重量が0.1重量%の細胞培養基材を用いた細胞培養容器では80%メタノールによる不溶化処理を実施し、フィブロイン当たりの重量が1重量%の細胞培養基材を用いた細胞培養容器では不溶化処理は行わなかった。そして、作製した細胞培養容器を用いて、接着細胞(HIH3T3細胞)を3日間培養した。図23に、実施例13で作製した細胞培養容器を用いて接着細胞を培養した後のシャーレの撮像画像を示す。図23に示すように、加水分解フィブロイン水溶液を有する細胞培養基材を用いた細胞培養容器の全てで接着細胞を培養することができたが、他の実施例と比べて接着細胞の増殖にバラツキが見られた。また、培地を除去した後に、Protease XIVを1U/ml加え、5分経過後に、細胞剥離の様子を観察した。その結果、図24に示すように、フィブロイン加水分解物を有効成分とする細胞培養基材を用いた細胞培養容器でも、剥離された接着細胞が浮いて丸く見えおり、接着細胞を剥離できることが確認できた。なお、図24は、実施例13で作製した細胞培養容器を用いた細胞剥離を説明するための図であり、実施例13の細胞培養容器で培養した接着細胞を剥離した後のシャーレの撮像画像を示す図である。このように、フィブロイン加水分解物を含む細胞培養基材でも、接着細胞の培養と細胞剥離を行うことができるが、接着細胞の培養については、他の実施例の方が好ましい結果となった。
さらに、本実施形態に係る細胞培養基材では、細胞外マトリックスや接着細胞自身と反応することも少ない酵素を用いるため、剥離後の接着細胞がバラバラとならず、接着細胞をシート状で得ることも可能となる。
Claims (7)
- シルクプロテイン、シルクプロテインの加水分解物、フィブロイン、フィブロインの加水分解物のうちいずれか1以上のタンパク質を有効成分として含有する細胞培養基材がコーティングされた細胞培養容器で培養した接着細胞を、前記細胞培養基材から剥離する接着細胞の剥離方法であって、
前記接着細胞の剥離剤として、Protease XIVを用いることを特徴とする、接着細胞の細胞剥離方法。 - 前記接着細胞の培養に使用した液体培地を除去し、前記液体培地を除去した後に、前記細胞培養基材を洗浄することなく、前記Protease XIVを添加して、前記接着細胞を剥離する、請求項1に記載の接着細胞の細胞剥離方法。
- 前記接着細胞の培養に使用した液体培地を除去することなく、前記Protease XIVを添加して、前記接着細胞を剥離する、請求項1に記載の接着細胞の細胞剥離方法。
- 添加した前記Protease XIVを失活させる処理をすることなく、剥離した前記接着細胞を回収する、請求項1に記載の接着細胞の細胞剥離方法。
- 前記Protease XIVが、Streptomyces griseus由来のプロテアーゼ混合物である、請求項1に記載の接着細胞の細胞剥離方法。
- 接着細胞を前記細胞培養容器で培養する培養工程と、
請求項1ないし5のいずれかに記載の接着細胞の細胞剥離方法による剥離工程と、を有する、接着細胞の培養方法。 - シルクプロテイン、シルクプロテインの加水分解物、フィブロイン、フィブロインの加水分解物のうちいずれか1以上のタンパク質を有効成分として含有する細胞培養基材、または、前記細胞培養基材がコーティングされた細胞培養容器と、
前記細胞培養基材に接着した接着細胞の剥離剤であるProtease XIVとを含む、接着細胞培養用のキット。
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---|---|---|---|---|
JPH11243948A (ja) * | 1998-03-02 | 1999-09-14 | Natl Inst Of Sericultural & Entomological Science | 動物細胞増殖用の細胞培養床基材及びその調製方法 |
JP2000273264A (ja) * | 1999-03-23 | 2000-10-03 | Natl Inst Of Sericultural & Entomological Science | 生体高分子/ポリアリルアミン複合体およびその製造方法 |
WO2005063968A1 (ja) * | 2003-12-26 | 2005-07-14 | Gs Platz Co Ltd | Es細胞培養用基礎培地 |
WO2012115244A1 (ja) * | 2011-02-25 | 2012-08-30 | 独立行政法人理化学研究所 | 網膜色素上皮細胞シートの製造方法 |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11243948A (ja) * | 1998-03-02 | 1999-09-14 | Natl Inst Of Sericultural & Entomological Science | 動物細胞増殖用の細胞培養床基材及びその調製方法 |
JP2000273264A (ja) * | 1999-03-23 | 2000-10-03 | Natl Inst Of Sericultural & Entomological Science | 生体高分子/ポリアリルアミン複合体およびその製造方法 |
WO2005063968A1 (ja) * | 2003-12-26 | 2005-07-14 | Gs Platz Co Ltd | Es細胞培養用基礎培地 |
WO2012115244A1 (ja) * | 2011-02-25 | 2012-08-30 | 独立行政法人理化学研究所 | 網膜色素上皮細胞シートの製造方法 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
CHEN, Ruru et al.,Degradation Behavior and Immunological Detection of Silk Fibroin Exposure to Enzymes,Analytical Sciences,2019年07月26日,Vol.35,p.1243-1249 |
CHEN, RURU ET AL.: "Degradation Behavior and Immunological Detection of Silk Fibroin Exposure to Enzymes", ANALYTICAL SCIENCES, vol. 35, JPN6022049370, 26 July 2019 (2019-07-26), pages 1243 - 1249, XP009548838, ISSN: 0005034870, DOI: 10.2116/analsci.19P222 * |
KE, Qicheng et al.,Carrier-free epithelial cell sheets prepared by enzymatic degradation of collagen gel,J. Tissue Eng. Regen. Med.,2011年,Vol.5,p.138-145,DOI: 10.1002/term.298 |
KE, QICHENG ET AL.: "Carrier-free epithelial cell sheets prepared by enzymatic degradation of collagen gel", J. TISSUE ENG. REGEN. MED., vol. 5, JPN6022049371, 2011, pages 138 - 145, XP055144347, ISSN: 0005034871, DOI: 10.1002/term.298 * |
MING, Jinfa et al.,Structure and properties of protein-based fibrous hydrogels derived from silk fibroin and sodium alg,J. Sol-Gel Sci. Technol.,2015年02月17日,(p.1-9),DOI 10.1007/s10971-015-3662-z |
MING, JINFA ET AL.: "Structure and properties of protein-based fibrous hydrogels derived from silk fibroin and sodium alg", J. SOL-GEL SCI. TECHNOL., JPN6022049372, 17 February 2015 (2015-02-17), pages 1 - 9, ISSN: 0005034872 * |
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