CN105031729B - 一种真皮组织仿生海绵的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种真皮组织仿生海绵的制备方法，该真皮组织仿生海绵中丝蛋白的质量分数为10％～95％，胶原蛋白的质量分数为5％～90％，将丝蛋白溶液与胶原蛋白溶液混合后，经过水蒸气蒸发成膜，然后经过1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺混合水溶液浸泡，干燥等过程制得所述真皮组织仿生海绵。本发明真皮组织仿生海绵具有在微结构、力学性质和分子结构方面对真皮组织的仿生性能，有利于提高其抑制瘢痕形成和促进功能性真皮组织再生的性能，从而为解决病理性瘢痕的难题提供新方法。

Description

一种真皮组织仿生海绵的制备方法

技术领域

本发明涉及医用仿生材料技术领域，尤其是涉及一种以丝蛋白与胶原蛋白为原料制备真皮组织仿生海绵的方法。

背景技术

烧伤、创伤、手术切口等外伤所造成的皮肤缺损是临床常见病和多发病，在皮肤缺损修复过程中，伤口过度愈合会导致病理性瘢痕的发生和发展。病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，会造成瘙痒、毁容、残疾等一系列严重的并发症，有时甚至诱发恶性肿瘤，严重影响患者的生存质量。因此，病理性瘢痕的防治一直是烧伤、整形等外科学领域中亟待解决的难题。

近年来，随着创面愈合机制研究的不断深入，人们发现，瘢痕形成与真皮组织缺失程度具有高度相关性，这一理论在临床实践中也得到了佐证，如浅度烧伤创面在愈合后与正常皮肤类似，而深度烧伤创面在愈合后将形成病理性瘢痕。这一理论提示：真皮组织的存在能够抑制瘢痕发生和发展。因此，发挥真皮组织作用的真皮仿生材料被临床用于促进深度皮肤缺损创面的愈合并抑制瘢痕形成，并取得了一定的效果。

目前，已上市真皮仿生产品可分为两类：脱细胞真皮基质和体外合成高分子支架。脱细胞真皮基质是由人尸体皮、猪皮、猪小肠粘膜下层经脱细胞处理得到的成分异质的高分子支架材料，其主要成分为胶原蛋白。体外合成高分子支架是由合成高分子(如polyglactin)或动物源天然高分子(如胶原蛋白和/或糖胺聚糖)等体外合成的高分子支架。

虽然已有真皮仿生材料在促进创面修复和抑制瘢痕形成两方面发挥了有效作用，但在临床应用过程中仍然存在不足之处。首先，由于加工工艺难以控制，脱细胞真皮基质类真皮仿生材料的质量不稳定，各生产批次之间往往存在质量差别，这将其作为真皮替代物修复创面的应用效果，并可能造成二次手术等严重后果。其次，脱细胞真皮基质真皮仿生材料存在生物污染的可能性，由于原料人尸体皮可能携带病毒，并且这些病毒在材料加工过程中未被有效清除，而导致病毒传播。再次，体外合成真皮仿生材料在创面的降解速度与组织生成的速度不匹配，往往因降解过快而导致其促进伤口修复和抑制瘢痕形成的作用减弱。另外，现有真皮仿生材料在抑制瘢痕形成方面的作用效果远未达到促进功能性类真皮组织再生的目标。究其原因，真皮仿生材料在加工过程中结构被破坏和体外合成真皮仿生材料未实现对真皮组织的仿生是影响其再生的重要因素。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种真皮组织仿生海绵的制备方法。本发明真皮组织仿生海绵具有在微结构、力学性质和分子结构方面对真皮组织的仿生性能，有利于提高其抑制瘢痕形成和促进功能性真皮组织再生的性能，从而为解决病理性瘢痕的难题提供新方法。

本发明的技术方案如下：

一种真皮组织仿生海绵的制备方法，所述真皮组织仿生海绵所含原料的质量百分数为：丝蛋白10％～95％，胶原蛋白5％～90％；具体制备步骤为：

(1)将蚕茧置于Na₂CO₃水溶液中沸煮30min，然后用去离子水润洗3次，制得蚕丝素纤维；然后将蚕丝素纤维置于溴化锂溶液中，37℃条件下溶解，制得丝蛋白溴化锂溶液；最后将所得溶液在截留分子量为3500Da的透析盒中透析3天后，得丝蛋白溶液，调节溶液质量百分浓度为5％；

(2)将步骤(1)制得的丝蛋白溶液与质量百分浓度为1.5％的胶原蛋白溶液在37℃条件下按体积比0.4～57:10混合，在速度为50rpm/min的漩涡振荡器上振荡5min，至混合均匀，然后在离心力为1500g下离心3min，除去溶液中的气泡；

(3)将步骤(2)离心后的混合液转移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度为2mm，然后将此槽放置于37℃、吸风风速为0.3米/秒的通风橱中央，放置时间为24h，形成丝蛋白/胶原蛋白高分子膜；

(4)将丝蛋白/胶原蛋白高分子膜浸没于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合水溶液中，40℃下放置8h；将所得高分子膜在300ml去离子水中浸泡30min，此步骤重复3次，最后将所得高分子膜在300ml液氮溶液中冷冻10min；

(5)将冷冻的高分子膜在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，真空冷冻干燥条件为：冷阱温度-55℃、真空度3～5Pa，时间18h，制得丝蛋白/胶原蛋白复合材料，即所述真皮组织仿生海绵。

步骤(1)中所述Na₂CO₃水溶液浓度为0.01～1M；所述溴化锂溶液的浓度为1～20M。

步骤(4)中所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合水溶液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的浓度比为1:1，均为0.02M；所述混合溶液的pH值为4.5。

本发明有益的技术效果在于：

(1)本发明以蚕茧来源的天然高分子丝蛋白作为构建真皮仿生海绵的主要原料、胶原蛋白作为次要原料，通过水蒸气蒸发法使海绵中的丝蛋白分子发生物理交联，改善了海绵的微结构，增强了材料的多孔性能；通过此制备方法，丝蛋白基海绵的硬度降低，接近正常皮肤的弹性；引入胶原蛋白并并与丝蛋白形成互穿网络，能够促进海绵对真皮组织中细胞的黏附性和增殖活性，并降低海绵的生物降解速度。丝蛋白是所制备真皮组织仿生海绵的主要基质，胶原蛋白次要基质和对丝蛋白自组装过程具有调控作用的物质。

(2)本发明所用丝蛋白分子能够发生物理交联，避免了在构建真皮替代物的过程中引入有毒的化学交联剂，提高海绵的生物相容性；丝蛋白分子结构中约含有85％的甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的重复嵌段，这些重复嵌段之间会形成氢键而使丝蛋白分子内部或丝蛋白分子之间产生疏水结构，这种疏水结构使丝蛋白分子发生物理交联，而避免使用化学交联剂。

(3)本发明通过水蒸气蒸发使丝蛋白分子发生物理交联，能够促进海绵对真皮组织结构和力学性能的仿生性能，水蒸气蒸发过程能够促进丝蛋白分子自组装形成Silk I结构并抑制Silk II结构的产生，而在甲醇水溶液中丝蛋白分子发生自组装主要形成Silk II的机构。当丝蛋白分子的物理交联形式主要为Silk I时，所获得的丝蛋白基海绵材料在孔结构和力学性能方面优于Silk II结构为主的丝蛋白材料，从而降低了所制备的丝蛋白/胶原蛋白海绵硬度，使其在力学性质方面与真皮组织更加接近，具有抑制瘢痕形成和促进真皮组织再生的功能。(4)本发明胶原蛋白分子的引入能够提高真皮成纤维细胞和微血管内皮细胞在丝蛋白/胶原蛋白海绵中的黏附和增殖活性，胶原蛋白分子结构中含有细胞黏附所需的氨基酸序列，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)，这一序列在细胞表面的受体为整合蛋白，RGD与整合蛋白的结合会激活促进细胞增殖的信号通路，从而加速细胞增殖。

(5)本发明采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度和N-羟基琥珀酰亚胺对丝蛋白/胶原蛋白膜进行交联处理，能够将胶原蛋白分子固定于丝蛋白交联网络中，形成完全互穿网络，有利于延长丝蛋白/胶原蛋白海绵在体内的降解周期，作为真皮替代物更长时间地参与创面愈合，发挥更强地抑制瘢痕形成和促进真皮组织再生的功能。

(6)本发明采用真空冷冻干燥处理获得丝蛋白/胶原蛋白基海绵，能够材料在干态下保持其多孔结构和力学特性。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的真皮组织仿生海绵的扫描电镜图。

图2为本发明对比例1制得的纯丝蛋白膜的扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1

(1)将10g蚕茧置于500ml的0.02M Na₂CO₃水溶液中沸煮30min，然后用去离子水润洗3次，制得蚕丝素纤维；然后将蚕丝素纤维置于10ml 9.3M的溴化锂溶液中，37℃条件下溶解，制得丝蛋白溴化锂溶液；最后将所得溶液在截留分子量为3500Da的透析盒中透析3天后，得丝蛋白水溶液，调节溶液质量百分浓度为5％；

(2)将步骤(1)制得的丝蛋白溶液与质量百分浓度为1.5％的胶原蛋白溶液在37℃条件下按体积比7:10混合，在速度为50rpm/min的漩涡振荡器上振荡5min，至混合均匀，然后在离心力为1500g下离心3min，除去溶液中的气泡；

(3)将步骤(2)离心后的混合液转移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度为2mm，然后将此槽放置于37℃、吸风风速为0.3米/秒的通风橱中央，放置时间为24h，形成丝蛋白/胶原蛋白高分子膜；

(4)将丝蛋白/胶原蛋白高分子膜浸没于300ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合水溶液中(溶质1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为0.02M，溶质N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.02M，pH＝4.5)，40℃下放置8h；将所得高分子膜在300ml去离子水中浸泡30min，此步骤重复3次，最后将所得高分子膜在300ml液氮溶液中冷冻10min；

(5)将冷冻的高分子膜在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，真空冷冻干燥条件为：冷阱温度-55℃、真空度5Pa，时间18h，制得丝蛋白/胶原蛋白复合材料，即所述真皮组织仿生海绵。其中，丝蛋白的质量分数为70％，胶原蛋白的质量分数为30％。

通过扫描电子显微镜观察实施例1所述真皮组织仿生海绵的微观结构，如图1所示。由图1可以看出，由水蒸气蒸发处理所得的真皮组织仿生海绵，其内部微观结构为联通的多孔结构。

实施例2

(1)将10g蚕茧置于500ml的1M Na₂CO₃水溶液中沸煮30min，然后用去离子水润洗3次，制得蚕丝素纤维；然后将蚕丝素纤维置于10ml 10M的溴化锂溶液中，37℃条件下溶解，制得丝蛋白溴化锂溶液；最后将所得溶液在截留分子量为3500Da的透析盒中透析3天后，得丝蛋白水溶液，调节溶液质量百分浓度为5％；

(2)将步骤(1)制得的丝蛋白溶液与质量百分浓度为1.5％的胶原蛋白溶液在37℃条件下按体积比57:10混合，在速度为50rpm/min的漩涡振荡器上振荡5min，至混合均匀，然后在离心力为1500g下离心3min，除去溶液中的气泡；

(3)将步骤(2)离心后的混合液转移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度为2mm，然后将此槽放置于37℃、吸风风速为0.3米/秒的通风橱中央，放置时间为24h，形成丝蛋白/胶原蛋白高分子膜；

(4)将丝蛋白/胶原蛋白高分子膜浸没于300ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合水溶液中(溶质1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为0.02M，溶质N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.02M，pH＝4.5)，40℃下放置8h；将所得高分子膜在300ml去离子水中浸泡30min，此步骤重复3次，最后将所得高分子膜在300ml液氮溶液中冷冻10min；

(5)将冷冻的高分子膜在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，真空冷冻干燥条件为：冷阱温度-55℃、真空度3Pa，时间18h，制得丝蛋白/胶原蛋白复合材料，即所述真皮组织仿生海绵。其中，丝蛋白的质量分数为95％，胶原蛋白的质量分数为5％。

实施例3

(1)将10g蚕茧置于500ml的0.05M Na₂CO₃水溶液中沸煮30min，然后用去离子水润洗3次，制得蚕丝素纤维；然后将蚕丝素纤维置于10ml 15M的溴化锂溶液中，37℃条件下溶解，制得丝蛋白溴化锂溶液；最后将所得溶液在截留分子量为3500Da的透析盒中透析3天后，得丝蛋白水溶液，调节溶液质量百分浓度为5％；

(2)将步骤(1)制得的丝蛋白溶液与质量百分浓度为1.5％的胶原蛋白溶液在37℃条件下按体积比0.4:10混合，在速度为50rpm/min的漩涡振荡器上振荡5min，至混合均匀，然后在离心力为1500g下离心3min，除去溶液中的气泡；

(3)将步骤(2)离心后的混合液转移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度为2mm，然后将此槽放置于37℃、吸风风速为0.3米/秒的通风橱中央，放置时间为24h，形成丝蛋白/胶原蛋白高分子膜；

(4)将丝蛋白/胶原蛋白高分子膜浸没于300ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合水溶液中(溶质1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为0.02M，溶质N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.02M，pH＝4.5)，40℃下放置8h；将所得高分子膜在300ml去离子水中浸泡30min，此步骤重复3次，最后将所得高分子膜在300ml液氮溶液中冷冻10min；

(5)将冷冻的高分子膜在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，真空冷冻干燥条件为：冷阱温度-55℃、真空度5Pa，时间18h，制得丝蛋白/胶原蛋白复合材料，即所述真皮组织仿生海绵。其中，丝蛋白的质量分数为10％，胶原蛋白的质量分数为90％。

对比例1

(1)将10g蚕茧置于500ml的0.02M Na₂CO₃水溶液中沸煮30min，然后用去离子水润洗3次，制得蚕丝素纤维；然后将蚕丝素纤维置于10ml 9.3M的溴化锂溶液中，37℃条件下溶解，制得丝蛋白溴化锂溶液；最后将所得溶液在截留分子量为3500Da的透析盒中透析3天后，得丝蛋白水溶液，调节溶液质量百分浓度为5％；

(2)将步骤(1)制得的溶液转移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度为2mm，然后将此槽放置于37℃、吸风风速为0.3米/秒的通风橱中央，放置时间为24h，形成丝蛋白高分子膜；

(3)步骤(2)制得的高分子膜在300ml去离子水中浸泡30min，然后在液氮溶液中冷冻10min；

(4)将冷冻的高分子膜在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，真空冷冻干燥条件为：冷阱温度-55℃、真空度5Pa，时间18h，制得纯丝蛋白膜。

通过扫描电子显微镜观察对比例所得纯丝蛋白膜的微观结构，如图2所示。由图2可以看出，纯丝蛋白膜内部微观结构含大量的板层结构，无显著多孔结构。

对比例2

(1)将10g蚕茧在500ml的0.02M Na₂CO₃水溶液中沸煮30min，然后用去离子水润洗3次。将所得产物在37℃条件下溶解于10ml浓度为9.3M的溴化锂溶液中。将此溶液在截留分子量为3500Da的透析盒中透析3天后，所得溶液为质量百分浓度为5％的丝蛋白水溶液。

(2)将所得丝蛋白溶液与质量百分浓度为1.5％的胶原蛋白溶液在37℃下按体积比7:10混合，在速度为100rpm/min的漩涡振荡器上振荡5min，至混合均匀，然后在离心力为1500g下离心3min，出去溶液中的气泡；

(3)将所得溶液转移至聚四氟乙烯槽中，并使溶液在槽中的厚度保持为2mm，在300ml液氮溶液中冷冻10min后，在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，冷阱温度-55℃、真空度3～5Pa，时间18h，得丝蛋白/胶原蛋白高分子膜；

(4)将步骤(3)制得的丝蛋白/胶原蛋白高分子膜在甲醇水溶液(V甲醇:V水＝1:1)中浸泡1h，得甲醇水溶液处理的丝蛋白/胶原蛋白高分子膜；

(5)将经过步骤(4)处理的丝蛋白/胶原蛋白高分子膜在300ml液氮溶液中冷冻10min；然后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，真空冷冻干燥条件为：冷阱温度-55℃、真空度3～5Pa，时间18h，制得丝蛋白/胶原蛋白膜。

测试例：

(1)通过观察真皮成纤维细胞和微血管内皮细胞在实施例1～3及对比例1所得材料中的黏附和增殖，考察其生物相容性及其作为伤口修复材料的性能。真皮成纤维细胞的接种密度为5×10⁴/cm²，内皮细胞的接种密度为1×10⁴/cm²，以DNA含量测定法定量测定两种细胞在材料中接种1天的黏附率和培养3天后的增殖率。测试结果见表1所示。

(2)按GB/T1040.3-2006测试实施例1～3及对比例2所得材料的力学性质。测试结果见表1所示。

(3)按GB/T16886.13-2001对实施例1～3及对比例2所得材料进行降解试验，选择的温度为37℃，试验溶液中胰酶浓度定为0.2IU/ml，降解时间为7天。测试结果见表1所示。

表1

通过表中所列数据可以看出，实施例所制备的真皮组织仿生海绵具有与真皮组织相似的力学性质和多孔微结构，这些仿生性能能够使其在创面修复过程中发挥替代真皮的作用，从而促进创面修复和抑制瘢痕形成；细胞实验表明，实施例所制备的真皮组织仿生海绵能够促进真皮组织成纤维细胞、微血管内皮细胞的黏附和增殖，与对比例相比具有较好的生物相容性。因此，真皮组织仿生海绵有望成为促进真皮组织功能性再生的新型创面修复材料。

Claims (1)

1.一种真皮组织仿生海绵的制备方法，其特征在于所述真皮组织仿生海绵所含原料的质量百分数为：丝蛋白10％～95％，胶原蛋白5％～90％；具体制备步骤为：

(1)将蚕茧置于Na₂CO₃水溶液中沸煮30min，然后用去离子水润洗3次，制得蚕丝素纤维；然后将蚕丝素纤维置于溴化锂溶液中，37℃条件下溶解，制得丝蛋白溴化锂溶液；最后将所得溶液在截留分子量为3500Da的透析盒中透析3天后，得丝蛋白溶液，调节溶液质量百分浓度为5％；

(2)将步骤(1)制得的丝蛋白溶液与质量百分浓度为1.5％的胶原蛋白溶液在37℃条件下按体积比0.4～57:10混合，在速度为50rpm的漩涡振荡器上振荡5min，至混合均匀，然后在离心力为1500g下离心3min，除去溶液中的气泡；

(3)将步骤(2)离心后的混合液转移至聚四氟乙烯槽中，溶液的厚度为2mm，然后将此槽放置于37℃、吸风风速为0.3米/秒的通风橱中央，放置时间为24h，形成丝蛋白/胶原蛋白高分子膜；

(4)将丝蛋白/胶原蛋白高分子膜浸没于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合水溶液中，40℃下放置8h；将所得高分子膜在300ml去离子水中浸泡30min，此步骤重复3次，最后将所得高分子膜在300ml液氮溶液中冷冻10min；

(5)将冷冻的高分子膜在真空冷冻干燥机中冷冻干燥，真空冷冻干燥条件为：冷阱温度-55℃、真空度3～5Pa，时间18h，制得丝蛋白/胶原蛋白复合材料，即所述真皮组织仿生海绵；

步骤(4)中所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合水溶液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的浓度比为1:1，均为0.02M；所述混合水溶液的pH值为4.5；

步骤(1)中所述Na₂CO₃水溶液浓度为0.01～1M；所述溴化锂溶液的浓度为1～20M。