CN108404209B - 一种胶原-丝素共组装海绵材料、共组装人工皮肤及其制备方法 - Google Patents

一种胶原-丝素共组装海绵材料、共组装人工皮肤及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胶原‑丝素共组装海绵材料、共组装人工皮肤及其制备方法。所述胶原‑丝素共组装海绵材料具有有序多孔空间结构，由胶原和丝素共组装所得的胶原‑丝素共组装产物制备而得。所述共组装人工皮肤包括胶原‑丝素共组装海绵真皮层和表皮层。本发明提供的共组装人工皮肤的真皮层在组成和结构上更加接近于真实细胞外基质，这种有序的新型结构可诱导细胞的有序排列和再生，从而促进创面愈合和减少瘢痕形成，具有良好生物相容性。

Description

一种胶原-丝素共组装海绵材料、共组装人工皮肤及其制备 方法
技术领域
本发明涉及一种胶原-丝素共组装海绵材料、共组装人工皮肤及其制备方法，属于生物医用材料领域。
背景技术
皮肤是人体最大、最重要的器官之一，具有呼吸、保持体液流失和生物屏障等功能。重度烧伤、深度烫伤、严重外伤、感染、溃疡等造成的大面积皮肤缺损是临床上面临的重大难题，目前常用的方法包括自体皮肤移植、同种异体皮肤移植、异种皮肤移植，但往往存在供应不足、免疫排斥及易传播疾病等不足和缺陷。应用生物材料学和组织工程学的原理和技术，研制出结构和功能与人体正常皮肤相似的人工皮肤，作为损伤皮肤的替代物，发挥保护创面和促进创面愈合的作用，可有效弥补上述不足和缺陷。显然，人工皮肤的制备原料应具有来源安全广泛、免疫原性低、生物相容性良好、机械性能较好、能诱导自体皮肤再生、可控降解等特征；理想的人工皮肤应能够模仿人体正常皮肤的结构和功能，具有表皮层和真皮层等基本结构，能为皮肤再生相关干细胞、成纤维细胞等提供黏附、增殖、分化、迁移的适宜空间环境，促进创伤愈合。
胶原是细胞外基质的主要成份之一，具有良好生物相容性、生物降解性、低免疫原性、低细胞毒性以及促进细胞生长等性能，已广泛用于人工皮肤研制。
Figure BDA0001601276140000011
是已商品化的胶原基双层人工皮肤，其表皮层由硅胶膜组成，具有保护创面、防止水分流失、防止细菌感染等作用；真皮层由单一胶原海绵组成，多孔的胶原海绵能诱导细胞聚集，促进毛细血管的生长，起到促进创面愈合的作用，但是其单一胶原海绵真皮层的机械性能、降解周期和空间结构还有待改善。公开号为CN 103961749 A的中国发明专利“一种制备胶原蛋白/硅胶膜双层支架的方法”中，表皮层为硅胶膜，真皮层为通过不同的交联方法制得的单一胶原海绵，虽然真皮层的机械性能和降解周期得到一定改善，但其海绵的空间结构还有待改善。由于基于单一胶原材料难以满足人工皮肤的全面要求，所以目前研究较为广泛的是将胶原和其他合成高分子或天然高分子交联或复合制备得到胶原基复合材料，以改善单一胶原材料在应用中存在的一些问题。商品化人工皮肤
Figure BDA0001601276140000012
的真皮层由胶原和6-硫酸软骨素共价交联制成的海绵组成，表皮层为硅胶膜。虽然真皮层复合多孔支架力学性能稍有改善，但由于胶原、6-硫酸软骨素结构、性能等差异较大，该人工皮肤又存在降解周期难以控制、多孔结构不规则等不足和缺陷。公开号为CN 107050521 A的中国发明专利“一种双层胶原真皮支架及其制备方法”中，表皮层为硅胶膜，真皮层为胶原-硫酸软骨素复合支架，也存在真皮层多孔结构杂乱的不足。
作为人类最早利用的天然材料之一，蚕丝是一种性能优良的天然高分子材料，近年来广泛被应用于生物技术、医药、精细化工等诸多方面，如手术后的缝合线、涂料、化妆品、药物的缓慢释放、分离膜及生物活性物的固定化和生物传感器的制作等。丝素具有来源丰富、成本低廉的特点，约占蚕丝的70％-80％，其生物相容性、细胞黏附性和生物降解性良好，无刺激及毒副作用，同时具有良好的力学性能，能弥补胶原力学性能不足、降解周期过快等问题，是一种优良的天然生物材料。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种通过共组装技术制得的胶原-丝素共组装海绵材料、共组装人工皮肤及其制备方法。本发明提供的共组装人工皮肤的真皮层在组成和结构上更加接近于真实细胞外基质，这种有序的新型结构可诱导细胞的有序排列和再生，从而促进创面愈合和减少瘢痕形成，具有良好生物相容性。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
提供一种胶原-丝素共组装海绵材料，所述胶原-丝素共组装海绵材料具有有序多孔空间结构，由胶原和丝素共组装所得的胶原-丝素共组装产物制备而得，所述的胶原-丝素共组装产物具有稳定二级结构。
按上述方案，所述胶原-丝素共组装海绵孔径大小为50～500μm，孔隙率在75％以上。
按上述方案，所述的胶原-丝素共组装海绵材料由胶原-丝素共组装产物经冷冻干燥-交联-冷冻干燥工艺制得；所述的胶原-丝素共组装产物由胶原溶液和丝素溶液按照胶原-丝素等物质的量比例混合，机械搅拌均匀，共组装获得。
优选地，所述胶原溶液浓度为1～10μmol/L；所述丝素溶液浓度为1～20μmol/L。
按上述方案，所述的共组装条件为：温度0～37℃、湿度40％～80％、共组装时间12～48h。
优选地，所述胶原为去端肽Ⅰ型胶原；所述丝素为桑蚕蚕丝丝素。
提供一种共组装人工皮肤，包括真皮层和表皮层，所述真皮层为上述胶原-丝素共组装海绵。
优选地，所述的表皮层为硅胶膜。
提供一种共组装人工皮肤的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备胶原溶液和丝素溶液；
(2)取胶原溶液和丝素溶液，按照胶原-丝素等物质的量比例混合，机械搅拌均匀，共组装得到胶原-丝素共组装产物，然后通过冷冻干燥-交联-冷冻干燥工艺，制得共组装胶原-丝素海绵；
(3)在共组装胶原-丝素海绵上涂布一层硅胶膜，室温固化，制得共组装人工皮肤。
优选地，机械搅拌均匀的条件为：转速1～400rpm、温度0～37℃、搅拌时间0.5～24h。
优选地，共组装条件为：温度0～37℃、湿度40％～80％、共组装时间12～48h。
优选地，所述步骤(2)中第一次冷冻干燥为：依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点进行梯度降温冷冻，每一温度点冷冻时间为12～48h；然后将得到的冷冻体进行冷冻干燥，冷冻体干燥条件为：温度-40～-120℃、压强1～50Pa、时间24～72h。
优选地，所述步骤(2)中，所述交联为湿热交联或EDC/NHS体系交联或戊二醛体系交联；所述湿热交联条件为：温度37～100℃、湿度50～80％、时间1～120h；所述EDC/NHS体系交联条件为：5～50mmol/L EDC、1.5～32.5mmol/L NHS、95％乙醇、温度0～37℃、时间1～48h；所述戊二醛体系交联条件为：0.1～0.5％戊二醛、温度0～37℃、时间1～48h。
优选地，所述步骤(2)中，交联后用纯水冲洗，然后进行第二次冷冻干燥，所述的冷冻干燥为：依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点进行梯度降温冷冻，每一温度点冷冻时间为12～48h，然后将得到的冷冻体进行冷冻干燥，冷冻体干燥条件为温度-40～-120℃、压强1～50Pa、时间24～72h。
优选地，所述步骤(3)中，用胶枪将硅胶打在共组装胶原-丝素海绵上，然后用聚四氟乙烯刮刀涂布均匀，室温固化，制得共组装人工皮肤。
本发明以胶原和丝素为原料，先通过共组装技术制得具有稳定二级结构的新型共组装产物，再通过冷冻干燥-交联-冷冻干燥工艺，制得有序、结构性匹配的胶原-丝素共组装海绵，由此制得的共组装胶原-丝素海绵材料可用于制备人工皮肤。具体地，将共组装胶原-丝素海绵材料作为真皮层，然后复合表皮层，即可制得共组装人工皮肤。
本发明提供的共组装人工皮肤的真皮层在组成和结构上更加接近于真实细胞外基质，不仅孔径大小适合皮肤创面愈合相关的干细胞、成纤维细胞等的植入，其多孔、有序的结构还能为皮肤创面愈合相关细胞的粘附、生长、增值、分化提供有序、规则的空间构型，能够诱导细胞的有序排列和再生，从而促进创面愈合和减少瘢痕形成。本发明共组装人工皮肤的表皮层具有保护创面、防止感染、防止体液流失和利于人工皮肤缝合固定的作用。由此本发明提供的共组装人工皮肤不仅具有良好生物相容性、机械性能和可控降解性，还可诱导细胞的有序排列和再生，由此减少瘢痕形成，提高愈合质量并促进创面愈合，有效填补了当前人工皮肤支架材料存在的空间结构杂乱无序、机械性能差、降解周期短、再生瘢痕多等缺陷和不足。
如上所述，本发明具有以下显著优势：
(1)本发明通过共组装技术制得的胶原-丝素共组装海绵具有有序多孔空间结构，这种有序、结构性匹配的新型材料不仅具有良好生物相容性、机械性能和可控降解性，以其作为人工皮肤真皮层还可诱导细胞的有序排列和再生，减少瘢痕形成，提高愈合质量并促进创面愈合。
(2)本发明提供的胶原-丝素共组装海绵材料的机械性能、降解速度和孔径大小可调。相对而言，较大的胶原溶液和丝素溶液浓度、较高的共组装温度、较长的共组装时间，有利于提高真皮层的机械性能、降低降解速度、减小孔径大小，由此本发明通过胶原溶液和丝素溶液浓度，共组装工艺条件的调控可满足不同的临床需求。
(3)本发明制得的共组装人工皮肤优选使用去端肽Ⅰ型胶原，避免了人工皮肤在应用时的免疫排斥、异物反应和病毒感染等方面的问题。
(4)本发明制得的共组装人工皮肤中的表皮层优选使用硅胶膜，硅胶具有很强的粘合性，可以与胶原-丝素共组装海绵牢固结合，对局部组织起一定的支撑作用，有利于人工皮肤缝合固定。同时具有保护创面、防止感染、防止体液流失和的作用，其良好的半透性能为创面修复提供一个相对湿润的环境，加速创面愈合。
(5)本发明以胶原和丝素为原料制备胶原-丝素共组装海绵材料，原料来源安全、充足，基于胶原-丝素共组装海绵材料制备的人工皮肤的形状、厚度、空间结构、机械性能、降解速度等可控，同时制备方法简单，工艺成熟，易于工业化生产。
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步具体说明。
附图说明
图1为本发明中胶原-丝素共组装海绵材料、共组装人工皮肤的制备工艺流程图。
图2为胶原自组装、丝素自组装、胶原-丝素复合以及胶原-丝素共组装所得产物在水溶液中圆二色谱图。本发明的胶原-丝素共组装产物、胶原自组装产物、丝素自组装产物在水溶液中的圆二色谱图见图2A；胶原-丝素复合产物在水溶液中的圆二色谱图也见图2B。
图3为实施例1制备的胶原-丝素共组装海绵材料和胶原自组装海绵材料、丝素自组装海绵材料、胶原-丝素复合海绵材料的扫描电镜图；其中A为胶原自组装海绵材料，B为丝素自组装海绵材料，C为一般胶原-丝素复合海绵材料，D为胶原-丝素共组装海绵材料。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易的了解本发明的其他优点和功效。本发明还可以通过另外不同的具体实例方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
(1)称取适量去端肽Ⅰ型胶原，用0.5mol/L乙酸溶液配置浓度为2.5μmol/L的胶原溶液。称取适量桑蚕蚕丝丝素冻干粉，溶于氯化钙三元体系溶液(氯化钙：乙醇：水摩尔比1:2:8)中，用截留分子量3500Da的透析袋纯水透析，配置浓度为2.5μmol/L的丝素溶液。
(2)取2.5μmol/L的胶原溶液和2.5μmol/L的丝素溶液，等体积混合，在转速200rpm、温度0℃的条件下机械搅拌8h，再在温度0℃、湿度40％的条件下共组装48h(胶原-丝素共组装产物)，共组装完后的混合溶液依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻12h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥48h。所得冻干产物在温度37℃、湿度80％的条件下湿热交联90min，交联完后，纯水清洗多次，依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻12h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥48h，制得共组装胶原-丝素海绵。
(3)在共组装胶原-丝素海绵上涂布一层硅胶膜，室温固化，制得共组装人工皮肤。所得共组装人工皮肤的真皮层具有有序多孔空间结构，孔径大小为200～300μm，孔隙率在80％以上。
共组装人工皮肤制备方法的工艺流程图见图1。
上述步骤(2)中共组装得到的胶原-丝素共组装产物、胶原自组装产物、丝素自组装产物在水溶液中的圆二色谱图见图2A。
胶原-丝素复合产物在水溶液中的圆二色谱图见图2B。
胶原、丝素自组装产物的获得：分别制备2.5μmol/L的胶原溶液和丝素溶液，分别在转速200rpm、温度0℃的条件下机械搅拌8h，然后分别在温度0℃、湿度40％的条件下单独自组装48h，分别制得胶原、丝素自组装产物(水溶液中)。
胶原-丝素复合产物的获得：分别制备2.5μmol/L的胶原溶液和丝素溶液，等体积混合，然后在转速200rpm、温度0℃的条件下机械搅拌8h，制得胶原-丝素复合产物(水溶液中)。
图2分析表明：胶原自组装产物具有典型的三股螺旋结构，其特征是在195nm处有一个负吸收峰，在220nm处有一个很强正吸收峰；丝素自组装产物以无规则卷曲结构为主，其特征是在195-200nm处有最大负吸收峰；胶原-丝素复合产物检测结果显示只有胶原、丝素自组装产物特征结构，未见有新的结构。说明胶原-丝素复合仅为机械性混合，只是两种组分的一般共混。
胶原-丝素共组装产物体系中二级结构的分布分别是α-helix 0％，β-sheet44.2％，β-turn15.3％，Random 40.5％，体系中α-helix结构整体向β-sheet和β-turn转化，整个体系向稳定态转变，表明形成了新的二级结构，这说明胶原-丝素在相互结合时发生了共组装现象，由于氢键、静电作用、范德华力等弱相互作用的影响而产生了适配性良好的空间配位和结构契合，形成了新的二级结构。这种新的、具有有序二级结构和规则空间构型的共组装产物也是制备有序、结构性匹配的新型材料的前提条件。
上述步骤(2)得到的胶原-丝素共组装海绵材料的扫描电镜图见图3D。胶原自组装海绵材料见图3A，丝素自组装海绵材料见图3B，胶原-丝素复合海绵材料见图3C。
1)自组装海绵的获得：分别制备2.5μmol/L的胶原溶液和丝素溶液，分别在转速200rpm、温度0℃的条件下机械搅拌8h，然后分别在温度0℃、湿度40％的条件下单独自组装48h。自组装完后的溶液分别依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻12h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥48h。所得冻干产物在温度37℃、湿度80％的条件下湿热交联90min，交联完后，纯水清洗多次，依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻12h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥48h，分别制得胶原自组装海绵和丝素自组装海绵。
2)胶原-丝素复合海绵的获得：实施例1中，胶原溶液和丝素溶液混合均匀后，不进行共组装，直接冷冻干燥-交联-冷冻干燥，制得胶原-丝素复合海绵。
图3结果分析表明：相比胶原自组装海绵材料、丝素自组装海绵材料、胶原-丝素复合海绵材料而言，胶原-丝素共组装海绵材料具有多孔性和高孔隙率、内表面积大、孔径大小分布均匀、空间结构规则等突出优势。该电镜检测结果与附图2中圆二色谱检测结果也具有十分显著的一致性和相互验证性。
综上，本发明共组装人工皮肤的真皮层在组成和结构上更加接近于真实细胞外基质。由此，可为皮肤再生相关细胞的粘附、生长、增值、分化提供有序、规则的空间构型，能够诱导细胞有序排列和再生，从而促进创面愈合和减少瘢痕形成。
实施例2
(1)称取适量去端肽Ⅰ型胶原，用0.5mol/L乙酸溶液配置浓度为5.0μmol/L的胶原溶液。称取适量桑蚕蚕丝丝素冻干粉，溶于氯化钙三元体系溶液(氯化钙：乙醇：水摩尔比1:2:8)中，用截留分子量3500Da的透析袋纯水透析，配置浓度为5.0μmol/L的丝素溶液。
(2)取5.0μmol/L的胶原溶液和5.0μmol/L的丝素溶液，等体积混合，在转速150rpm、温度20℃的条件下机械搅拌4h，再在温度20℃、湿度60％的条件下共组装24h，共组装完后的混合溶液依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻24h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥60h。所得冻干产物在温度37℃、湿度80％的条件下湿热交联90min，交联完后，纯水清洗多次，依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻12h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥60h，制得共组装胶原-丝素海绵。
(3)在共组装胶原-丝素海绵上涂布一层硅胶膜，室温固化，制得共组装人工皮肤。所得共组装人工皮肤真皮层具有有序多孔空间结构，孔径大小为120～200μm，孔隙率在80％以上。
实施例3
(1)称取适量去端肽Ⅰ型胶原，用0.5mol/L乙酸溶液配置浓度为10.0μmol/L的胶原溶液。称取适量桑蚕蚕丝丝素冻干粉，溶于氯化钙三元体系溶液(氯化钙：乙醇：水摩尔比1:2:8)中，用截留分子量3500Da的透析袋纯水透析，配置浓度为10.0μmol/L的丝素溶液。
(2)取10.0μmol/L的胶原溶液和10.0μmol/L的丝素溶液，等体积混合，在转速100rpm、温度37℃的条件下机械搅拌1h，再在温度37℃、湿度80％的条件下共组装12h，共组装完后的混合溶液依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻36h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥72h。所得冻干产物在温度37℃、湿度80％的条件下湿热交联90min，，交联完后，纯水清洗多次，依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻36h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥72h，制得共组装胶原-丝素海绵。
(3)在共组装胶原-丝素海绵上涂布一层硅胶膜，室温固化，制得共组装人工皮肤。所得共组装人工皮肤真皮层具有有序多孔空间结构，孔径大小为50～150μm，孔隙率在80％以上。
实施例4
(1)称取适量去端肽Ⅰ型胶原，用0.5mol/L乙酸溶液配置浓度为2.5μmol/L的胶原溶液。称取适量桑蚕蚕丝丝素冻干粉，溶于氯化钙三元体系溶液(氯化钙：乙醇：水摩尔比1:2:8)中，用截留分子量3500Da的透析袋纯水透析，配置浓度为2.5μmol/L的丝素溶液。
(2)取2.5μmol/L的胶原溶液和2.5μmol/L的丝素溶液，等体积混合，在转速200rpm、温度0℃的条件下机械搅拌8h，再在温度0℃、湿度40％的条件下共组装48h，共组装完后的混合溶液依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻12h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥48h。所得冻干产物在0.1％(w/w)戊二醛、4℃条件下交联24h，交联完后，纯水清洗多次，依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻12h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥48h，制得共组装胶原-丝素海绵。
(3)在共组装胶原-丝素海绵上涂布一层硅胶膜，室温固化，制得共组装人工皮肤。所得共组装人工皮肤的真皮层具有有序多孔空间结构，孔径大小为200～300μm，孔隙率在80％以上。
实施例5
(1)称取适量去端肽Ⅰ型胶原，用0.5mol/L乙酸溶液配置浓度为5.0μmol/L的胶原溶液。称取适量桑蚕蚕丝丝素冻干粉，溶于氯化钙三元体系溶液(氯化钙：乙醇：水摩尔比1:2:8)中，用截留分子量3500Da的透析袋纯水透析，配置浓度为5.0μmol/L的丝素溶液。
(2)取5.0μmol/L的胶原溶液和5.0μmol/L的丝素溶液，等体积混合，在转速150rpm、温度20℃的条件下机械搅拌4h，再在温度20℃、湿度60％的条件下共组装24h，共组装完后的混合溶液依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻24h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥60h。所得冻干产物在0.1％(w/w)戊二醛、4℃条件下交联24h，交联完后，纯水清洗多次，依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻12h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥60h，制得共组装胶原-丝素海绵。
(3)在共组装胶原-丝素海绵上涂布一层硅胶膜，室温固化，制得共组装人工皮肤。所得共组装人工皮肤真皮层具有有序多孔空间结构，孔径大小为120～200μm，孔隙率在80％以上。
实施例6
(1)称取适量去端肽Ⅰ型胶原，用0.5mol/L乙酸溶液配置浓度为10.0μmol/L的胶原溶液。称取适量桑蚕蚕丝丝素冻干粉，溶于氯化钙三元体系溶液(氯化钙：乙醇：水摩尔比1:2:8)中，用截留分子量3500Da的透析袋纯水透析，配置浓度为10.0μmol/L的丝素溶液。
(2)取10.0μmol/L的胶原溶液和10.0μmol/L的丝素溶液，等体积混合，在转速100rpm、温度37℃的条件下机械搅拌1h，再在温度37℃、湿度80％的条件下共组装12h，共组装完后的混合溶液依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻36h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥72h。所得冻干产物在0.1％(w/w)戊二醛、4℃条件下交联24h，交联完后，纯水清洗多次，依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻36h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥72h，制得共组装胶原-丝素海绵。
(3)在共组装胶原-丝素海绵上涂布一层硅胶膜，室温固化，制得共组装人工皮肤。所得共组装人工皮肤真皮层具有有序多孔空间结构，孔径大小为50～150μm，孔隙率在80％以上。
实施例7
(1)称取适量去端肽Ⅰ型胶原，用0.5mol/L乙酸溶液配置浓度为2.5μmol/L的胶原溶液。称取适量桑蚕蚕丝丝素冻干粉，溶于氯化钙三元体系溶液(氯化钙：乙醇：水摩尔比1:2:8)中，用截留分子量3500Da的透析袋纯水透析，配置浓度为2.5μmol/L的丝素溶液。
(2)取2.5μmol/L的胶原溶液和2.5μmol/L的丝素溶液，等体积混合，在转速200rpm、温度0℃的条件下机械搅拌8h，再在温度0℃、湿度40％的条件下共组装48h，共组装完后的混合溶液依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻12h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥48h。所得冻干产物在25mmol/L EDC、16mmol/L NHS、95％乙醇、20℃条件下交联12h，交联完后，纯水清洗多次，依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻12h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥48h，制得共组装胶原-丝素海绵。
(3)在共组装胶原-丝素海绵上涂布一层硅胶膜，室温固化，制得共组装人工皮肤。所得共组装人工皮肤的真皮层具有有序多孔空间结构，孔径大小为200～300μm，孔隙率在80％以上。
实施例8
(1)称取适量去端肽Ⅰ型胶原，用0.5mol/L乙酸溶液配置浓度为5.0μmol/L的胶原溶液。称取适量桑蚕蚕丝丝素冻干粉，溶于氯化钙三元体系溶液(氯化钙：乙醇：水摩尔比1:2:8)中，用截留分子量3500Da的透析袋纯水透析，配置浓度为5.0μmol/L的丝素溶液。
(2)取5.0μmol/L的胶原溶液和5.0μmol/L的丝素溶液，等体积混合，在转速150rpm、温度20℃的条件下机械搅拌4h，再在温度20℃、湿度60％的条件下共组装24h，共组装完后的混合溶液依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻24h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥60h。所得冻干产物在25mmol/L EDC、16mmol/L NHS、95％乙醇、20℃条件下交联12h，交联完后，纯水清洗多次，依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻12h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥60h，制得共组装胶原-丝素海绵。
(3)在共组装胶原-丝素海绵上涂布一层硅胶膜，室温固化，制得共组装人工皮肤。所得共组装人工皮肤真皮层具有有序多孔空间结构，孔径大小为120～200μm，孔隙率在80％以上。
实施例9
(1)称取适量去端肽Ⅰ型胶原，用0.5mol/L乙酸溶液配置浓度为10.0μmol/L的胶原溶液。称取适量桑蚕蚕丝丝素冻干粉，溶于氯化钙三元体系溶液(氯化钙：乙醇：水摩尔比1:2:8)中，用截留分子量3500Da的透析袋纯水透析，配置浓度为10.0μmol/L的丝素溶液。
(2)取10.0μmol/L的胶原溶液和10.0μmol/L的丝素溶液，等体积混合，在转速100rpm、温度37℃的条件下机械搅拌1h，再在温度37℃、湿度80％的条件下共组装12h，共组装完后的混合溶液依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻36h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥72h。所得冻干产物在25mmol/L EDC、16mmol/L NHS、95％乙醇、20℃条件下交联12h，交联完后，纯水清洗多次，依次在0℃、-20℃、-40℃、-80℃四个温度点分别冷冻36h，然后在-80℃、1Pa条件下干燥72h，制得共组装胶原-丝素海绵。
(3)在共组装胶原-丝素海绵上涂布一层硅胶膜，室温固化，制得共组装人工皮肤。所得共组装人工皮肤真皮层具有有序多孔空间结构，孔径大小为50～150μm，孔隙率在80％以上。

Claims (7)

1.一种共组装人工皮肤，包括真皮层和表皮层，其特征在于：所述真皮层为胶原-丝素共组装海绵材料，所述胶原-丝素共组装海绵材料具有有序多孔空间结构，由去端肽Ⅰ型胶原和桑蚕蚕丝丝素共组装所得的去端肽 Ⅰ 型胶原胶原-桑蚕蚕丝丝素共组装产物制备而得，所述的去端肽 Ⅰ 型胶原胶原-桑蚕蚕丝丝素共组装产物具有稳定二级结构，由去端肽Ⅰ型胶原溶液和桑蚕蚕丝丝素溶液按照胶原-丝素等物质的量比例混合，机械搅拌均匀，共组装获得；所述的共组装条件为：温度 0~37℃、湿度 40%~80%、共组装时间 12~48 h，所述端肽 Ⅰ 型胶原胶原溶液浓度为2.5~10 μmol/L；所述桑蚕蚕丝丝素溶液浓度为2.5~10 μmol/L。
2.根据权利要求1所述的共组装人工皮肤，其特征在于：所述的表皮层为硅胶膜。
3.根据权利要求1所述的共组装人工皮肤，其特征在于：所述胶原-丝素共组装海绵材料的孔径大小为 50~500 μm，孔隙率在 75% 以上。
4.根据权利要求1所述的共组装人工皮肤，其特征在于：所述的胶原-丝素共组装海绵材料由去端肽 Ⅰ 型胶原胶原-桑蚕蚕丝丝素共组装产物经冷冻干燥-交联-冷冻干燥工艺制得。
5.如权利要求1或2所述的共组装人工皮肤的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1） 制备胶原溶液和丝素溶液；
（2） 取胶原溶液和丝素溶液，按照胶原-丝素等物质的量比例混合，机械搅拌均匀，共组装得到胶原-丝素共组装产物，然后通过冷冻干燥-交联-冷冻干燥工艺，制得共组装胶原-丝素海绵；
（3） 在共组装胶原-丝素海绵上涂布一层硅胶膜，室温固化，制得共组装人工皮肤。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，机械搅拌均匀的条件为：转速 1~400 rpm、温度 0~37℃、搅拌时间 0.5~24 h；
所述步骤（2）中第一次冷冻干燥为：依次在 0℃、-20℃、-40℃、-80℃ 四个温度点进行梯度降温冷冻，每一温度点冷冻时间为 12~48 h；然后将得到的冷冻体进行冷冻干燥，冷冻体干燥条件为：温度 -40~-120℃、压强 1~50 Pa、时间 24~72 h；
所述交联为湿热交联或 EDC/NHS 体系交联或戊二醛体系交联；所述湿热交联条件为：温度 37~100℃、湿度 50~80%、时间 1~120 h；所述 EDC/NHS 体系交联条件为：5~50 mmol/L EDC、1.5~32.5 mmol/L NHS、95% 乙醇、温度 0~37℃、时间 1~48 h；所述戊二醛体系交联条件为： 0.1~0.5% 戊二醛、温度 0~37℃、时间1~48 h；
交联后用纯水冲洗，然后进行第二次冷冻干燥，所述的冷冻干燥为：依次在 0℃、-20℃、-40℃、-80℃ 四个温度点进行梯度降温冷冻，每一温度点冷冻时间为 12~48 h，然后将得到的冷冻体进行冷冻干燥，冷冻体干燥条件为温度 -40~-120℃、压强 1~50 Pa、时间 24~72 h。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，用胶枪将硅胶打在共组装胶原-丝素海绵材料上，然后用聚四氟乙烯刮刀涂布均匀，室温固化，制得共组装人工皮肤。
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