CN101314055A - 一种脱细胞真皮基质复合膜材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脱细胞真皮基质复合膜材料及其制备方法，其特点是胶原蛋白18～28重量份，用浓度为0.2～0.5mmol/L的醋酸水溶液溶解成溶液；聚乙烯醇10～24重量份、壳聚糖10～40重量份分别用85～95℃和40～60℃的蒸馏水溶解成不同浓度的溶液，将胶原蛋白溶液与聚乙烯醇溶液和/或壳聚糖溶液按比例混合后搅拌均匀成共混液；将上述共混液均匀涂敷于脱细胞真皮基质材料表面，使涂膜的厚度达到0.5～2.5cm并迅速冷冻，再经冷冻干燥获得脱细胞真皮基质复合膜材料；最后采用碳化二亚胺进行改性，获得脱细胞真皮基质复合胶原蛋白－聚乙烯醇和/或壳聚糖膜材料。

Description

一种脱细胞真皮基质复合膜材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种以动物皮本体胶原以及水解胶原蛋白与聚乙烯醇(PVA)、壳聚糖等为原料，制备一种脱细胞真皮基质复合膜材料的方法。

背景技术

来自动物皮的胶原蛋白，不仅具有独特的理化性能，而且还具有良好的生物相容性、可生物降解性、低免疫性以及止血性能等优良性能，尤其是其在动物体内容易被吸收，亲水性强、无毒副作用、安全性好，因而被认为是最为理想的生物医学材料之一。将胶原蛋白与其它天然/合成高分子化合物复合制成适合各种用途的生物医学材料，已经受到人们的高度重视。

通常，根据胶原形式的不同可以分为胶原本体和水解胶原。胶原本体是指以胶原为主要成分的动物组织或器官为主要原料，未经或经过少量的化学或物理方法处理，保留天然胶原结构和性质的动物组织或器官。水解胶原是指采用化学及物理方法对以胶原为主要成分的动物组织或器官进行处理，获得的保留了天然胶原结构并具有较高纯度的胶原。

关于胶原本体纯化的报道相对较少。国内，但卫华等人利用天然动物皮为主要原料，经过一系列物理化学作用进行纯化并最终获得胶原本体材料，很大程度上保留了天然胶原结构和性质(但卫华，廖隆理，李志强，等.脱细胞真皮基质材料的制备方法.中国发明专利.200410022506.9)。以此工艺制备的胶原本体材料具有机械强度高、微弱抗原性、易于加工成型等特点，具有应用于生物医学领域的潜力，如体表创伤修复材料、人工皮肤基质材料等。另外，柴家科等人亦利用猪皮为主要原料，选择性地去细胞并将其作为人工皮肤代替物(柴家科，杨红明，刘强.选择性去细胞猪皮作为人体皮肤代替物的应用及其制备方法.中国发明专利.200303148291.0)。胶原本体材料具有明显的优点，如材料物理机械性能良好、可赋形性极佳以及免疫抗原性微弱等特点，同时也具有非常突出的缺点，如孔径尺寸不足、孔率及孔结构通透性不够，与创伤体表的粘连性较差等特点。

关于水解胶原的提取、纯化以及应用已有很多报道，特别是近几年将其作为生物医用材料的研究已成为热点。在国内，但卫华等人以天然动物皮为主要原料，制备了生物医用胶原蛋白粉剂，并很大程度地保留了天然胶原的三股螺旋结构(但卫华，林海，曾睿，等.一种医用胶原蛋白粉剂的制备方法.中国发明专利.200510022190.8)。另有大量研究报道选用天然或合成高分子材料对胶原进行改性优化，以获得更加优良的综合性能。所选用的天然材料有壳聚糖、硫酸软骨素和硫酸皮肤素等，合成材料主要有聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯醇、聚氨酯、硅橡胶、聚四氟乙烯等。例如，但卫华等人制备出胶原基复合医用纤维纺丝原液，并制备出可应用于医学领域的胶原蛋白-壳聚糖共混纤维(但卫华，周文常，曾睿，等.中国发明专利.ZL 200410022640.9)。曲健健等人还研究了胶原-聚乙烯醇共混溶液的可纺性，并制备出符合医学应用要求的胶原蛋白-PVA复合型医用纤维(曲健健，但卫华，曾睿，等.胶原-聚乙烯醇共混溶液的可纺性研究.皮革科学与工程.2005，16(2)：14-17)。虽然水解胶原基的生物医用材料已经具有十分优良的性能，如良好的粘附性、可控的孔径与孔率、可控的降解性能等，但是其缺点也限制了水解胶原基生物材料的扩展应用，如力学性能不足、可赋形性较差等。

到目前为止，尚无文献资料将脱细胞真皮基质材料与膜材料进行复合的报道。因此，利用动物皮为主要原料制备胶原本体材料以及水解胶原材料，并进而引入天然高分子材料等其他组分以后制备得到脱细胞真皮基质复合膜材料，是一种具有重大意义的创新思路。

综上所述，现有技术存在以下不足：

1.脱细胞真皮基质具有力学性能优良、可赋形性极佳等优点，同时孔径、孔率有限，粘附性较差等明显缺点限制了其作为生物医用材料的应用；

2.胶原基膜材料具有可控的孔径、孔率结构以及降解性能、可通过多种材料的复合获得各种优良性能的潜力，良好的粘附能力与细胞增殖环境等明显的优点，但是其较差的力学性能和赋形性很大程度地限制了其在生物医学领域的应用。

发明内容

本发明的目的在于为生物医学领域提供一种应用范围更为宽广的脱细胞真皮基质复合膜材料及其制备方法，其特点是利用天然动物皮为原料获得胶原本体和水解胶原蛋白，将水解胶原蛋白与壳聚糖等天然高分子材料共混改性获得胶原基膜复合液以后制备成脱细胞真皮基质复合膜材料。

本发明的目的是由以下技术措施来实现的，其中所述原料份数除特别说明外，均为重量份数：

脱细胞猪真皮基质材料(厚度0.2-0.8mm)         100单位面积

胶原蛋白(纯度≥90％)                        18～28份

聚乙烯醇(纯度≥90％，平均聚合度≥1799±50)  10～24份

壳聚糖(纯度≥85％，脱乙酰度≥85％)          10～40份

所述脱细胞猪真皮基质材料是以动物皮肤为主要原料制备的合格脱细胞真皮基质材料。

所述胶原蛋白粉剂是以动物皮肤、结缔组织等为主要原料制备或市售合格胶原蛋白粉剂产品。

所述聚乙烯醇、壳聚糖均为市售分析纯试剂。

上述脱细胞真皮基质复合膜材料的制备方法，其特征是：所述方法是按照以下工艺分6个步骤：

(1)胶原溶液的配制

取医用胶原蛋白粉剂10～28重量份，加入1000～5000重量份0.2～0.5mol/L的醋酸溶液，低温搅拌至完全溶解；

(2)聚乙烯醇溶液的配制

取聚乙烯醇固体10～24重量份，加入100～200重量份蒸馏水，于85～95℃水浴中搅拌溶解成均匀溶液，冷却后备用；

(3)壳聚糖溶液的配制

取壳聚糖固体10～40重量份，加入800～2000重量份蒸馏水，于40～60℃水浴中搅拌溶解成均匀溶液，冷却后备用；

(4)共混液的配制

分别将上述胶原蛋白溶液与聚乙烯醇溶液和/或壳聚糖溶液加入到反应釜，搅拌30～120min使共混液均匀一致，过滤后真空脱泡。制备得到胶原蛋白-聚乙烯醇和/或壳聚糖二元或三元共混液；

(5)脱细胞真皮基质复合膜材料的制备

将单位面积为100的脱细胞猪真皮基质材料展平后，将上述二元或三元共混液均匀涂敷于该脱细胞猪真皮基质材料上，使涂膜的厚度达到0.5～2.5cm后迅速冷冻，并最终冷冻干燥得到脱细胞真皮基质复合膜材料；

(6)脱细胞真皮基质复合膜材料的改性

将上述脱细胞真皮基质复合膜材料浸泡于20～70mmol/L 2-N-吗啉乙烷磺酸(2-N-morpholino ethanesulfonic acid，MES)的40～80v/v％乙醇溶液中30min，pH控制为5.0～6.5，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)，使其浓度分别达到5～100mmol/L和5～100mmol/L，室温下振荡4h～24h；然后将复合膜材料依次用0.1M磷酸二氢钠溶液、pH 7.2～7.4的磷酸盐缓冲液、双蒸水反复清洗；最后将脱细胞真皮基质复合膜材料进行冷冻干燥。

鉴于胶原独特的结构与性能，胶原基生物医用材料的研究受到格外关注。胶原本体脱细胞真皮基质材料复合胶原-聚乙烯醇/壳聚糖膜材料秉承了胶原蛋白的优良特性，具有生物相容性、可生物降解性等性能，同时兼具有脱细胞真皮基质材料和胶原基膜材料的优点，克服各自单独材料的明显缺点。同时，聚乙烯醇和壳聚糖的引入有利于进一步调整真皮基质复合膜材料的组成和结构性能，使目标材料具有更好的细胞分化增殖环境，与创面的粘附能力，具有更强的实用性与适用性。通过复合材料的改性可以达到目标材料的可控降解，从而大大扩展了脱细胞真皮基质复合膜材料的应用范畴。与现有的工艺技术相比，本发明具有以下优点：

(1)选用合成高分子材料和/或天然高分子材料与胶原蛋白进行共混改性，通过配方及工艺条件的优化，充分发挥三元组分的各自优势而弥补主要缺陷，使得胶原基共混液的性能得到提高；

(2)建立脱细胞真皮基质材料复合膜材料的双层结构模型，使目标材料具有脱细胞真皮基质材料和胶原基膜材料的各自优点，具有良好的力学性能、可赋形性、可控降解性、良好的细胞分化增殖环境以及良好的粘附性能；

(3)采用碳化二亚胺改性可以有效提高脱细胞真皮基质材料复合膜材料的物理机械性能，增强两种材料的界面结合能力，同时达到对目标材料降解性可控的目的；

本发明所制备的脱细胞真皮基质复合膜材料，其性能能够满足以下应用要求：

(1)作为细胞培养和组织工程皮肤体外模型材料；

(2)作为体表创伤修复膜材料；

(3)可进一步复合其它有效成分，应用于组织工程其它领域。

具体实施方式

下面通过实施对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容做出一些非本质的改进和调整。

实施例1：

(1)胶原溶液的配制

取医用胶原蛋白粉剂10重量份，加入1000重量份0.5mol/L的醋酸溶液，低温搅拌至完全溶解；

(2)壳聚糖溶液的配制

取壳聚糖固体10重量份，加入1000重量份蒸馏水，于40℃水浴中搅拌溶解成均匀溶液，冷却后备用。

(3)共混液的配制

分别将上述胶原蛋白溶液与壳聚糖溶液加入到反应釜，搅拌120min使共混液均匀一致，过滤后真空脱泡。

(4)脱细胞真皮基质复合膜材料的制备

将单位面积为100的合格脱细胞猪真皮基质材料展平后，将上述胶原蛋白-壳聚糖共混液均匀涂敷于该脱细胞猪真皮基质材料表面，使液面厚度达到2.5cm后迅速冷冻，并最终冷冻干燥得到脱细胞真皮基质-胶原蛋白-壳聚糖复合膜材料；

(5)脱细胞真皮基质复合膜材料的改性

将上述脱细胞真皮基质-胶原蛋白-壳聚糖复合膜材料浸泡于20mmol/L MES的40v/v％乙醇溶液中30min，pH控制为5.5，再加入EDC和NHS，使其浓度分别达到5mmol/L和5mmol/L，室温下振荡4h；然后将复合膜材料依次用0.1M磷酸二氢钠溶液、pH 7.2的磷酸盐缓冲液、双蒸水反复清洗；最后将脱细胞真皮基质复合膜材料进行冷冻干燥得到目标产品。

实施例2

(1)胶原溶液的配制

取医用胶原蛋白粉剂25重量份，加入2000重量份0.2mol/L的醋酸溶液，低温搅拌至完全溶解；

(2)聚乙烯醇溶液的配制

取聚乙烯醇固体10重量份，加入100重量份蒸馏水，于95℃水浴中搅拌溶解成均匀溶液，冷却后备用；

(3)壳聚糖溶液的配制

取壳聚糖固体15重量份，加入800重量份蒸馏水，于60℃水浴中搅拌溶解成均匀溶液，冷却后备用。

(4)共混液的配制

分别将上述胶原蛋白溶液、聚乙烯醇溶液、壳聚糖溶液加入到反应釜，搅拌120min使共混液均匀一致，过滤后真空脱泡。制备得到胶原蛋白-聚乙烯醇-壳聚糖三元共混液；

(5)脱细胞真皮基质复合膜材料的制备

将单位面积为100的脱细胞猪真皮基质材料展平后，将上述三元共混液均匀涂敷于该脱细胞猪真皮基质材料上，使涂膜的厚度达到0.5cm后迅速冷冻，并最终冷冻干燥得到脱细胞真皮基质-胶原蛋白-聚乙烯醇-壳聚糖复合膜材料；

(6)脱细胞真皮基质复合膜材料的改性

将上述脱细胞真皮基质复合膜材料浸泡于70mmol/L MES的80v/v％乙醇溶液中30min，pH控制为6.5，再加入EDC和NHS，使其浓度分别达到60mmol/L和35mmol/L，室温下振荡12h；然后将复合膜材料依次用0.1M磷酸二氢钠溶液、pH 7.4的磷酸盐缓冲液、双蒸水反复清洗；最后将脱细胞真皮基质复合膜材料进行冷冻干燥得到目标产品。

实施例3

(1)胶原溶液的配制

取医用胶原蛋白粉剂56重量份，加入5000重量份0.2mol/L的醋酸溶液，低温搅拌至完全溶解；

(2)聚乙烯醇溶液的配制

取聚乙烯醇固体24重量份，加入160重量份蒸馏水，于95℃水浴中搅拌溶解成均匀溶液，冷却后备用；

(3)共混液的配制

分别将上述胶原蛋白溶液与聚乙烯醇溶液加入到反应釜，搅拌60min使共混液均匀一致，过滤后真空脱泡。制备得到胶原蛋白-聚乙烯醇二元共混液；

(4)脱细胞真皮基质复合膜材料的制备

将单位面积为100的脱细胞猪真皮基质材料展平后，将上述二元共混液均匀涂敷于该脱细胞猪真皮基质材料上，使涂膜的厚度达到1.0cm后迅速冷冻，并最终冷冻干燥得到脱细胞真皮基质-胶原蛋白-聚乙烯醇复合膜材料；

(5)脱细胞真皮基质复合膜材料的改性

将上述脱细胞真皮基质复合膜材料浸泡于50mmol/L MES的80v/v％乙醇溶液中30min，pH控制为5.0，再加入EDC和NHS，使其浓度分别达到100mmol/L和100mmol/L，室温下振荡24h；然后将复合膜材料依次用0.1M磷酸二氢钠溶液、pH 7.4的磷酸盐缓冲液、双蒸水反复清洗；最后将脱细胞真皮基质复合膜材料进行冷冻干燥得到目标产品。

Claims (2)

1.一种脱细胞真皮基质复合膜材料，其特征是：以动物皮肤为主要原料制备的合格脱细胞真皮基质材料，以动物皮肤、结缔组织等为主要原料制备或市售合格的胶原蛋白粉剂产品，以及市售聚乙烯醇和壳聚糖分析纯试剂为主要原料。胶原蛋白、聚乙烯醇、壳聚糖用相应浓度醋酸溶液或蒸馏水配制成溶液后按照一定配比混合，再均匀涂敷于脱细胞真皮基质材料表面，使涂膜的厚度达到0.5～2.5cm并迅速冷冻，经冷冻干燥获得脱细胞真皮基质复合膜材料；最后采用碳化二亚胺进行改性，即可获得脱细胞真皮基质胶原蛋白-聚乙烯醇和/或壳聚糖复合膜材料。其中各组分原料的重量百分比组成计为：

脱细胞猪真皮基质材料(厚度0.1-1.0mm)           100单位面积

胶原蛋白(纯度≥90％)                          18～28份

聚乙烯醇(纯度≥90％，平均聚合度≥1799±50)    10～24份

壳聚糖(纯度≥85％，脱乙酰度≥85％)            10～40份。

2.如权利要求1所述的脱细胞真皮基质复合基膜材料的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)胶原溶液的配制

取医用胶原蛋白粉剂10～28重量份，加入1000～5000重量份0.2～0.5mol/L的醋酸溶液，低温搅拌至完全溶解；

(2)聚乙烯醇溶液的配制

取聚乙烯醇固体10～24重量份，加入100～200重量份蒸馏水，于85～95℃水浴中搅拌溶解成均匀溶液，冷却后备用；

(3)壳聚糖溶液的配制

取壳聚糖固体10～40重量份，加入800～2000重量份蒸馏水，于40～60℃水浴中搅拌溶解成均匀溶液，冷却后备用；

(4)共混液的配制

分别将上述胶原蛋白溶液与聚乙烯醇溶液和/或壳聚糖溶液加入到反应釜，搅拌30～120min使共混液均匀一致，过滤后真空脱泡。制备得到胶原蛋白-聚乙烯醇/壳聚糖二元或三元共混液；

(5)脱细胞真皮基质复合膜材料的制备

将单位面积为100的脱细胞猪真皮基质材料展平后，将上述二元或三元共混液均匀涂敷于该脱细胞猪真皮基质材料上，使液面厚度达到0.5～2.5cm后迅速冷冻，并最终冷冻干燥得到脱细胞真皮基质复合膜材料；

(6)脱细胞真皮基质复合膜材料的改性

将上述脱细胞真皮基质复合膜材料浸泡于20～70mmol/L 2-N-吗啉乙烷磺酸(2-N-morpholino ethanesulfonic acid，MES)的40～80v/v％乙醇溶液中30min，pH控制为5.0～6.5，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)，使其浓度分别达到5～100mmol/L和5～100mmol/L，室温下振荡4h～24h；然后将复合膜材料依次用0.1M磷酸二氢钠溶液、pH 7.2～7.4的磷酸盐缓冲液、双蒸水反复清洗；最后将脱细胞真皮基质复合膜材料进行冷冻干燥。