CN112341640A - 一种生物基自修复水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物基自修复水凝胶及其制备方法和应用，制备方法包括将半胱氨酸修饰的γ‑聚谷氨酸和醛基化透明质酸聚合物于水或缓冲溶液中混合成型即得。本发明通过半胱氨酸分子上的巯基基团和醛基之间的硫醇‑醛加成反应，在生理pH环境下构建动态共价交联水凝胶，具有自适应性、自愈合性和可生物降解等优点，且操作便捷，如自由成型、易于注射，有望应用于医用敷料、3D打印及组织工程等领域。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种生物基自修复水凝胶及其制备方法和在生物医药中的应用。具体是通过半胱氨酸修饰的γ-聚谷氨酸和醛基化透明质酸动态共价交联的方法得到的可注射的自修复水凝胶。
背景技术
水凝胶是一种极具吸引力的生物材料，在许多方面都具有广泛的应用前景，尤其是在组织工程和再生医学领域。动态共价交联水凝胶的聚合物网络具有自适应性和自愈合性，被破坏后可以自发修复，已成为医用材料领域的研究热点。
目前，水凝胶材料的成型方式主要包括化学交联、辐射交联、光引发聚合和物理交联四种方式。但现有技术的成型方式往往不够温和，或者交联成型后的水凝胶无法适配不规则伤口，存在生物相容性差和无法自修复等问题。
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一种天然微生物来源的聚肽高分子，相对分子质量在10万～200万之间，其侧链存在大量游离羧基，易于各类化学修饰，且具有良好的生物相容性、生物可降解性以及与蛋白质相似的仿生二级结构等优点。因而聚谷氨酸水凝胶在3D细胞培养、组织工程领域等方面被认为是最具应用潜力的生物材料之一，受到越来越多的关注。
如中国发明专利CN 110790951A公开了一种具有高生物相容性、可原位交联的γ-聚谷氨酸水凝胶及其制备方法，该方法通过半胱胺修饰的聚谷氨酸与甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的聚谷氨酸发生迈克尔加成反应制备水凝胶；但其成胶需在生理条件(pH7.0～7.8，37℃)下反应至少10min，成胶周期长，且缺乏自愈合性能。
透明质酸(HA)是一种酸性粘多糖，具有优良的生理学功能，同时也是天然人体组织成分，具有保水性、润滑性、成膜性、促进组织再生性、生物安全性等特性，被广泛应用于医药、化妆品、美容等领域，具有较高商业应用价值。中国发明专利申请CN 110251721A公开可了一种由醛基化透明质酸钠与聚阳离子聚合物通过希夫碱反应原位交联形成的自修复抗菌水凝胶，但通过希夫碱反应形成的水凝胶在生理条件下的自愈合性质十分有限，且其粘弹性与天然人体组织相差较大，并缺乏抗氧化性能和黏附性能。
发明内容
本发明针对现有水凝胶交联方式不够温和、形状可塑能力弱、自愈合性能差的问题，提供一种生物基自修复水凝胶及其制备方法和应用。本发明通过硫醇-醛加成反应，将聚谷氨酸和透明质酸交联在一起，形成的水凝胶易于操作，具有反应条件温和、生物相容性好、自适应性好并且可在体内完全降解等特点，被破坏后室温下30min内完全恢复原有性能，可较好的黏附于人体组织表面，形状可塑且易于去除。此外，聚谷氨酸和透明质酸可分别模拟人体组织细胞外基质(ECM)中的胶原成分和多糖成分，二者形成的水凝胶具有与人体组织相似的粘弹性特征，如应力松弛等等。最后，半胱氨酸是人体内谷胱甘肽的前体，其修饰的聚谷氨酸赋予水凝胶独特的抗氧化性质，可以在皮肤修复过程中有效清除过多的活性氧自由基，促进伤口愈合，这对组织工程和生物医药等领域具有重要的意义。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种生物基自修复水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)；
(2)制备醛基化透明质酸聚合物(HA-CHO)；
(3)分别配置第一原液和第二原液，所述第一原液的溶质为步骤(1)得到的所述半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物，溶剂为PBS缓冲液或水，所述第二原液的溶质为步骤(2)得到的醛基化透明质酸聚合物，溶剂为PBS缓冲液或水；将所述第一原液和所述第二原液混合成型，即得所述生物基自修复水凝胶。
优选的，步骤(1)包括如下步骤：
(1-1)向含有γ-聚谷氨酸的水溶液或含有γ-聚谷氨酸的缓冲溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺或1-羟基苯并三唑(HOBT)后活化；
(1-2)将半胱氨酸盐酸盐加入到步骤(1-1)活化后的体系中，反应18～32h后于水中透析，即得所述半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物。
步骤(2)所述醛基化透明质酸聚合物采用如下步骤制备得到：
向透明质酸的水溶液中加入高碘酸钠水溶液，于0～50℃下反应1～6h，之后加入过量的乙二醇，反应1～6h后于水中透析，即得所述醛基化透明质酸聚合物。
优选的，步骤(1-1)所述的含有γ-聚谷氨酸的水溶液的pH为4～6。
优选的，步骤(1-1)所述的含有γ-聚谷氨酸的缓冲溶液为含有γ-聚谷氨酸的MES缓冲液。
优选的，所述的MES缓冲液浓度为0.05～0.2M，pH为4～6。
优选的，步骤(1-1)所述的活化的时间为15～120min。
优选的，步骤(1-1)所述的活化的温度为0～37℃。
优选的，步骤(1-1)所述γ-聚谷氨酸的分子量为10万～200万道尔顿。
优选的，步骤(1-1)中，所述含有γ-聚谷氨酸的水溶液或含有γ-聚谷氨酸的缓冲溶液的浓度为10～30g/L。
优选的，步骤(1-1)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺或1-羟基苯并三唑的摩尔比为1～3:1；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与γ-聚谷氨酸中羧基的摩尔比为1～3:1。
优选的，所述γ-聚谷氨酸中的羧基与所述半胱氨酸盐酸盐的摩尔比为1:0.5～3。
优选的，步骤(1-2)所述的透析的时间为3～7天。
优选的，步骤(1-2)还包括透析后冷冻干燥的步骤。
优选的，步骤(2)所述的透析的时间为3～7天。
优选的，步骤(2)还包括透析后冷冻干燥的步骤。
优选的，步骤(2)所述透明质酸的分子量为30万～200万道尔顿。
优选的，步骤(2)所述透明质酸的水溶液的浓度为1～30g/L。
优选的，步骤(2)中，高碘酸钠与透明质酸的摩尔比为1～3:1。
优选的，步骤(2)中透明质酸与高碘酸的反应在避光条件下进行。
优选的，步骤(2)中高碘酸钠水溶液的浓度为0.5～6mol/L。
优选的，步骤(3)中，所述第一原液中，所述半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物的质量浓度为5％～15％；所述第二原液中，所述醛基化透明质酸聚合物的质量浓度为5％～15％。
优选的，步骤(3)中所述的PBS缓冲液的浓度为0.01～0.15M，pH为7.0～7.8。
优选的，步骤(3)中所述第一原液和所述第二原液的用量满足：半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物上的巯基与醛基化透明质酸上醛基的摩尔比为1:0.3～3。
优选的，步骤(3)中所述的成型的时间最短10s成型。
所制得的生物基自修复水凝胶可用0.1～1mol/L的二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽(GSH)等含巯基化合物快速溶解，可在15～60秒内迅速溶解。
所述制备方法的反应式为：
(1)
(2)
本发明还提供由上述方法制得的生物基自修复水凝胶。
本发明还提供由上述方法制得的生物基自修复水凝胶在医疗器械、3D打印或组织工程材料领域中的应用。
所述应用包括：制备医用敷料或细胞支架、。
本发明的有益效果在于：
硫醇-醛加成反应具有反应动力学快速、热力学可逆的特点，是一种制备动态共价交联水凝胶的有效策略。本发明通过硫醇-醛加成反应开发出一种成胶条件温和、生物相容性高、可生物降解的自修复水凝胶。
本发明以聚谷氨酸和透明质酸为基材，充分利用硫醇-醛加成反应的快速、可逆的特点在生理条件下构建自适应自修复水凝胶，该基于硫醇-醛加成反应的水凝胶具有良好的适应性和可注射性质，形状可塑且可迅速自修复，并能在体内完全降解，具备较好的抗氧化性能和黏附性能，在软组织修复尤其是皮肤伤口修复方面具有很好的应用潜力。
本发明以安全无毒、可生物降解材料γ-聚谷氨酸和透明质酸为主体材料，利用温和无害的硫醇-醛加成反应成胶，可匹配复杂的不规则组织伤口。同时天然γ-聚谷氨酸具有与天然蛋白质相似的二级结构，模拟组织细胞基质中的蛋白成分仿生构建组织工程多孔支架，使之能够有效促进损伤后组织的再生与重建。与现有技术相比，所述的聚谷氨酸与醛基化透明质酸组成的水凝胶在生理条件下具有更快的自愈合性能，粘弹性与天然人体组织更为相似，并具有优异的抗氧化性能和皮肤组织黏附性能。
硫醇-醛加成反应可在人体生理条件下快速进行，不需要任何引发剂、催化剂和有机溶剂，不产生任何有害的毒副产物，具有自适应性、自愈合性和生物降解性等优点，且操作便捷，如形状可塑且易于去除，是一种理想的用于生物医用材料的化学交联反应。
该水凝胶材料有效解决了传统化学交联类水凝胶具有一定细胞毒性的缺陷，且具有可塑性强、生物相容性好、操作条件温和、黏附性能好、抗氧化、体内可完全降解、自修复能力强等优点，在医用敷料、药物载体和细胞支架等领域具有广阔的市场应用前景。
附图说明
图1为实施例1制备得到的所述生物基自修复水凝胶的扫描电镜图片(SEM)。
图2为实施例8中γ-PGA-SH和HA-CHO水凝胶的细胞毒性实验结果图。
图3为实施例10中生物基自修复水凝胶促进伤口愈合的实验效果图。
图4为所述生物基自修复水凝胶可以覆盖不规则的伤口，并可以和伤口完美整合。
图5为所述生物基自修复水凝胶可以在30min内自愈合，恢复其原有性能。
图6为实施例7中生物基自修复水凝胶可以很好的黏附在人体的手指、肘部等关节部位。
图7为所述生物基自修复水凝胶具有与人体组织相似的粘弹性特征(应力松弛)。
图8为所述生物基自修复水凝胶具有较好的DPPH自由基清除能力，展现除较好的抗氧化性能。
图9为所述生物基自修复水凝胶进行自愈合过程的外观图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详述的本发明。
实施例1
(1)将γ-聚谷氨酸(700kDa)溶解于去离子水中，γ-PGA的质量浓度为10g/L，搅拌混合均匀，制成pH＝4的溶液；然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在18℃条件下搅拌活化30min。加入半胱氨酸盐酸盐(Cys·HCl)，室温搅拌反应18h；各物质的摩尔比如下，EDC:γ-PGA(-COOH)＝1:1，EDC:NHS＝1:1，γ-PGA(-COOH):Cys·HCl＝1:1。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，Cys的接枝率为25％。
(2)将透明质酸(1000kDa)溶解于去离子水中，HA的质量浓度10g/L，搅拌混合均匀；然后在避光条件下向透明质酸水溶液中加入高碘酸钠水溶液(1mol/L)于25℃下反应2h后，摩尔比NaIO4:HA＝1:1。将过量的乙二醇(摩尔比EG:HA>1:1)加入到步骤反应后的体系中，反应1h后于水中透析3天，即得所述醛基化透明质酸聚合物，醛化度为15.3％。
(3)用PBS缓冲液(0.15M，pH＝7.3)分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，第二原液溶质为醛基化透明质酸聚合物(HA-CHO)。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为5wt％；第二原液中，HA-CHO的浓度为5wt％。将第一原液和第二原液按照(-SH):(-CHO)＝1:3的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到生物基自修复水凝胶，成胶时间120s。
实施例2
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA，分子量为100万道尔顿)溶解于去离子水中，制成pH＝6的溶液，γ-PGA的质量浓度为15g/L，搅拌混合均匀；然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温条件下搅拌活化60min。加入半胱氨酸盐酸盐(Cys·HCl)，室温搅拌反应25h；各物质的摩尔比如下，EDC:γ-PGA(-COOH)＝1.5:1，EDC:NHS＝1.5:1，γ-PGA(-COOH):Cys·HCl＝1:1。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，Cys的接枝率为31％。
(2)将透明质酸(1000kDa)溶解于去离子水中，HA的质量浓度10g/L，搅拌混合均匀；然后在避光条件下向透明质酸水溶液中加入高碘酸钠水溶液(1mol/L)于25℃下反应3h后，将过量的乙二醇(EG)加入到步骤反应后的体系中；各物质摩尔比如下NaIO4:HA＝1:1。反应1h后于水中透析5天，即得所述醛基化透明质酸聚合物，醛化度为18.3％。
(3)用PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.5)分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，第二原液溶质为醛基化透明质酸聚合物(HA-CHO)。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为5wt％；第二原液中，HA-CHO的浓度为5wt％。将第一原液和第二原液按照SH:CHO＝1:2的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到生物基自修复水凝胶，成胶时间60s。
实施例3
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA，分子量为10万道尔顿)溶解于MES缓冲液(pH＝6.0，0.2M)，γ-PGA的质量浓度为30g/L，搅拌混合均匀；然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在37℃条件下搅拌活化120min。加入半胱氨酸盐酸盐(Cys·HCl)，室温搅拌反应32h；各物质的摩尔比如下，EDC:γ-PGA(-COOH)＝3:1，EDC:NHS＝2:1，γ-PGA(-COOH):Cys·HCl＝1:1.5。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析7天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，Cys的接枝率为43％。
(2)将透明质酸(300kDa)溶解于去离子水中，HA的质量浓度30g/L，搅拌混合均匀；然后在避光条件下向透明质酸水溶液中加入高碘酸钠水溶液(0.5mol/L)于50℃下反应1h后，将过量的乙二醇(EG)加入到步骤反应后的体系中；各物质摩尔比如下NaIO4:HA＝2:1，EG:HA>1:1。反应1h后于水中透析7天，即得所述醛基化透明质酸聚合物，醛化度为25.3％。
(3)用PBS缓冲液(0.01M，pH＝7)分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，第二原液溶质为醛基化透明质酸聚合物(HA-CHO)。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为5wt％；第二原液中，HA-CHO的浓度为5wt％。将第一原液和第二原液按照SH:CHO＝1:0.3的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到生物基自修复水凝胶，成胶时间80s。
实施例4
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA，分子量为150万道尔顿)溶解于MES缓冲液(pH＝4.0，0.05M)，γ-PGA的质量浓度为10g/L，搅拌混合均匀；然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在10℃条件下搅拌活化15min。加入半胱氨酸盐酸盐(Cys·HCl)，室温搅拌反应24h；各物质的摩尔比如下，EDC:γ-PGA(-COOH)＝1.5:1，EDC:NHS＝3:1，γ-PGA(-COOH):Cys·HCl＝1:0.5。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析5天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，Cys的接枝率为13％。
(2)将透明质酸(2000kDa)溶解于去离子水中，HA的质量浓度1g/L，搅拌混合均匀；然后在避光条件下向透明质酸水溶液中加入高碘酸钠水溶液(3mol/L)于10℃下反应6h后，将过量的乙二醇(EG)加入到步骤反应后的体系中；各物质摩尔比如下NaIO4:HA＝3:1，EG:HA>1:1。反应1h后于水中透析3天，即得所述醛基化透明质酸聚合物，醛化度为35.4％。
(3)用纯水分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，第二原液溶质为醛基化透明质酸聚合物(HA-CHO)。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为10wt％；第二原液中，HA-CHO的浓度为10wt％。将第一原液和第二原液按照SH:CHO＝1:1的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到生物基自修复水凝胶，成胶时间50s。
实施例5
(1)将γ-聚谷氨酸(γ-PGA，分子量为200万道尔顿)溶解于MES缓冲液(pH＝4.0，0.05M)，γ-PGA的质量浓度为10g/L，搅拌混合均匀；然后加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBT)，在0℃条件下搅拌活化100min。加入半胱氨酸盐酸盐(Cys·HCl)，室温搅拌反应24h；各物质的摩尔比如下，EDC:γ-PGA(-COOH)＝1.5:1，EDC:HOBT＝1.5:1，γ-PGA(-COOH):Cys·HCl＝1:3。得到的体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析3天；将得到的透析后的纯化溶液冷冻干燥得到半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物(γ-PGA-SH)，Cys的接枝率为53％。
(2)将透明质酸(1000kDa)溶解于去离子水中，HA的质量浓度20g/L，搅拌混合均匀；然后在避光条件下向透明质酸水溶液中加入高碘酸钠水溶液(6mol/L)于4℃下反应6h后，将过量的乙二醇(EG)加入到步骤反应后的体系中；各物质摩尔比如下NaIO4:HA＝1.5:1，EG:HA>1:1。反应6h后于水中透析3天，即得所述醛基化透明质酸聚合物，醛化度为35.4％。
(3)用PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.8)分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为γ-PGA-SH，第二原液溶质为醛基化透明质酸聚合物(HA-CHO)。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为15wt％；第二原液中，HA-CHO的浓度为15wt％。将第一原液和第二原液按照SH:CHO＝1:1的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到生物基自修复水凝胶，成胶时间10s。
实施例6
步骤(1)和步骤(2)与实施例5相同。
(3)用PBS缓冲液(0.01M，pH＝7.4)在37℃条件下分别配置水凝胶的第一原液和第二原液，第一原液溶质为γ-PGA-SH，第二原液溶质为HA-CHO。第一原液中，γ-PGA-SH的浓度为5wt％；第二原液中，HA-CHO的浓度为5wt％。将第一原液和第二原液按照SH:CHO＝1:1的用量分别加入双头注射器的AB管中，缓慢推出得到生物基自修复水凝胶，成胶时间20s。将得到的水凝胶冻干后对内部截面进行扫描电镜表征，其扫描电镜图片如图2所示。
实施例7：粘附性能测试
通过猪皮肤粘附实验，定量测定了半胱氨酸修饰的聚谷氨酸、醛基化透明质酸和生物基自修复水凝胶的粘附强度(表1)。半胱氨酸修饰的聚谷氨酸、醛基化透明质酸基本没有黏附性能，而两者形成的生物基自修复水凝胶的对猪皮肤的粘结强度增加到12.36kPa，使其(10wt％)能够很好地附着在发明人手肘和手指的皮肤表面，可以自由弯曲关节而不脱离(如图6所示)。综上所述，该水凝胶具有良好的粘接性能，验证了该水凝胶作为医用敷料的实际应用价值。
表1粘附强度对比表
实施例8：细胞毒性评价实验
采用死活染色评生物基自修复水凝胶的细胞相容性，实验对象为小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)。具体实验步骤为：(1)将NIH 3T3细胞培养在含10％胎牛血清和1％双抗的高糖DMEM培养基中，置于37℃、CO2培养箱中直到细胞汇合率达80％后，用胰蛋白酶消化后离心，并用培养基调整细胞密度为1×104cell/mL的细胞悬液；(2)然后接种该细胞悬液到48孔板中，每孔100μL，置于细胞培养箱中，置于细胞培养箱中培养24小时贴壁后；(3)吸出原有的培养液，实验组加入所述生物基自修复水凝胶(直径5mm，高度1mm)和100μL完全培养基，空白对照组加入同样大小的商品化水凝胶GelMA和100μL空白对照液(即新鲜完全培养基)，每组共3个平行样本；(4)分别在24h，48h，72h三个时间点每孔按照每毫升加入20μL的比例加入AO/EB染色工作液，37℃恒温培养箱中放置5min后于荧光倒置显微镜下观察荧光染色的细胞。染色后的细胞在荧光显微镜下，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质着橘红色并呈正常结构。
细胞相容性实验结果如图2所示，仅有极少量晚期凋亡细胞(NVA)，其余都表现为活细胞(VN)。
注①：染色工作液配置：将吖啶橙(AO)溶液和溴化乙锭(EB)溶液按体积比1:1混合成工作液，现用现配。本实验AO、EB溶液浓度分别为100μg/ml，所含稳定剂不影响实验效果。
实施例9:
采用MTT法评测半胱氨酸修饰的聚谷氨酸、醛基化透明质酸和生物基自修复水凝胶的细胞相容性，实验对象为小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3)。记录半胱氨酸修饰的聚谷氨酸、醛基化透明质酸和生物基自修复水凝胶的细胞相容性(值越高越好)，其对比如表2所示。
表2细胞存活率对比表
由于聚谷氨酸和透明质酸可分别模拟人体组织细胞外基质(ECM)中的胶原成分和多糖成分，二者可协同增效，所形成的生物基自修复水凝胶具有与人体组织相似的成分，更利于细胞的生长和繁殖，显示出比半胱氨酸修饰的聚谷氨酸和醛基化透明质酸更好的生物相容性。
实施例10
生物基自修复水凝胶作为伤口敷料在皮肤修复中的应用：
用PBS(0.01M，pH＝7.4)配置水凝胶前体液(10％wtγ-PGA-SH和10％wtHA-CHO)，经过0.22μm滤膜除菌。在SD大鼠的背部构建直径1cm的圆形全层皮肤伤口，用注射器将半胱氨酸修饰聚谷氨酸、醛基化透明质酸前体液分别注射于伤口表面，同时用双筒注射器将水凝胶前体液注射于伤口表面，前体液在伤口表面迅速成胶。原位成型的生物基自修复水凝胶可以很好的黏附在伤口表面，即使将伤口朝下也水凝胶也不会脱落，展现出良好的皮肤组织粘合性能(图4)。随后，每24h更换新的前体液和水凝胶敷料，观察14天内大鼠伤口愈合情况。由照片(图3)、表3所示，7、14天后，生物基自修复水凝胶处理的实验组的伤口愈合效果明显高于空白对照组、半胱氨酸修饰聚谷氨酸和醛基化透明质酸前体液治疗组。
表3伤口愈合程度对比表
半胱氨酸修饰的聚谷氨酸和醛基化透明质酸配比形成的生物基自修复水凝胶具有三维网状结构，有利于氧、营养物质和生长因子在创面愈合各个阶段的渗透，为细胞增殖、促进创面愈合提供稳定的潮湿微环境。同时，两者配比形成的水凝胶具有与天然人体组织的相似的粘弹性，可以作为临时的人工皮肤保护受损部位，而且可在体内完全降解。因此，该生物基自修复水凝胶有效促进了皮肤缺损的修复和愈合。
实施例11水凝胶自愈合实验
用PBS(0.01M，pH＝7.4)配置生物基自修复水凝胶前体液(10％wtγ-PGA-SH和10％wtHA-CHO)，将水凝胶前体液注射于长方形模具中，制成长片状水凝胶。
将水凝胶从右侧切断，然后拼接到一起，30min后可以完全自愈合成完整的长片状水凝胶，并可经受一定程度的拉伸而不会再次断开，展现出良好的自愈合性能(图5所示)。
将所述的生物基自修复水凝胶切成碎片，然后将碎片放入心型模具中，7小时后碎片可以完全整合到一起，自愈合形成一块完整的心型水凝胶，展现出优异的自愈合性能(图9所示)。
实施例12
水凝胶的粘弹性(应力松弛，图7)
应力松弛(Stress relaxation)是高分子粘弹性特有的现象，指材料用外力突然让它发生特定的变形，应力(Stress)随时间(time)缓慢降低的现象。天然人体组织具有应力松弛的粘弹性特征，具有应力松弛特性的水凝胶使其能够提供天然组织的一定功能，具有足够的弹性来抵抗机械变形，保护创面愈合。这种可调节的粘弹性使水凝胶具有可个性化定制的特征，以满足不同实际应用的需要。
水凝胶的抗氧化能力(图8)
大量的自由基会破坏组织中的蛋白质和DNA，导致伤口愈合过程中的关键酶失活和炎症反应。半胱氨酸是机体最重要的还原剂——谷胱甘肽的前体，将其接枝到聚谷氨酸上可促进清除过表达的自由基，从而保护组织免受自由基的侵害。由图8可见，所述的水凝胶对DPPH(一种稳定的自由基)的清除效果十分明显，清除率分别为78.6％(5wt％水凝胶)、82.9％(10wt％水凝胶)、86.2％(15wt％水凝胶)和88.8％(γ-PGA-SH)。这些结果表明，所述的生物基自修复水凝胶具有优异的抗氧化能力，通过减少自由基的过量产生，在促进伤口愈合方面表现出优异的功效。因此，具有良好抗氧化活性的生物基自修复水凝胶在创面愈合中具有巨大的应用潜力。
综上表明，我们提供了一种利用γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和透明质酸(HA)通过硫醇-醛加成反应来构建的仿生水凝胶支架材料不仅具有自修复性能，也具有优良的细胞相容性，有望用于伤口敷料等生物医药领域，用于促进受损组织的再生与重建，因此该水凝胶在医用敷料、药物载体和细胞支架等领域具有广阔的市场应用前景。
Claims (10)
1.一种生物基自修复水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物；
(2)制备醛基化透明质酸聚合物；
(3)分别配置第一原液和第二原液，所述第一原液的溶质为步骤(1)得到的所述半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物，溶剂为水或PBS缓冲液，所述第二原液的溶质为步骤(2)得到的醛基化透明质酸聚合物，溶剂为水或PBS缓冲液；将所述第一原液和所述第二原液混合成型，即得所述生物基自修复水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括如下步骤：
(1-1)向含有γ-聚谷氨酸的水溶液或含有γ-聚谷氨酸的缓冲溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺或1-羟基苯并三唑后活化；
(1-2)将半胱氨酸盐酸盐加入到步骤(1-1)活化后的体系中，反应18～32h后于水中透析，即得所述半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1-1)所述γ-聚谷氨酸的分子量为10万～200万道尔顿。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述γ-聚谷氨酸中的羧基与所述半胱氨酸盐酸盐的摩尔比为1:0.5～3。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括：
向透明质酸的水溶液中加入高碘酸钠水溶液，于4～50℃下反应1～6h，之后加入过量的乙二醇，反应1～6h后于水中透析，即得所述醛基化透明质酸聚合物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述透明质酸的分子量为30万～200万道尔顿。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，高碘酸钠与透明质酸的摩尔比为1～3:1。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述第一原液和所述第二原液的用量满足：半胱氨酸分子修饰的γ-聚谷氨酸聚合物上的巯基与醛基化透明质酸上醛基的摩尔比为1:0.3～3。
9.权利要求1-8所述制备方法制得的生物基自修复水凝胶。
10.权利要求1-8所述制备方法制得的生物基自修复水凝胶在医疗器械、3D打印或组织工程材料领域中的应用。
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