CN103656729A - 一种基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶，其由γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联制备得到，且具有如下结构单元的聚合物，其中，m取值15～45中的自然数，n取值3900～17000中的自然数，x取值5～40中的自然数。本发明还公开了上述水凝胶的制备方法及其在制备医用创伤敷料中的应用。本发明方法制备得到的水凝胶因其良好的生物相容性，可广泛应用于创伤敷料等医疗卫生用品等。

Description

一种基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物相容性水凝胶的制备方法，具体来说是通过化学交联的方法得到生物相容性的γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法。
背景技术
皮肤是人体的重要器官，由于创伤、烧伤等原因，可能会导致皮肤的大范围伤害，并有可能导致并发症，危及人类生命，如何有效促进伤口快速愈合就一直是医学界不懈探索的课题。传统的观点认为，应该尽可能为伤口创造一个干燥的环境，减少感染机会，有利于伤口愈合。但是随着研究的深入，人们发现湿润的无感染的环境对连续的组织修复过程是最有利的[Wound repair and regeneration,2009(17):505-510]。在这种“湿润伤口愈合”理论指导下，医用高分子水凝胶创伤敷料的研究应用逐渐兴起，逐步取代传统敷料用于各类溃烂和创伤伤口。
水凝胶是能够吸收以及保持大量水分而又不溶于水的三维交联网络结构材料，其网络由大分子主链和亲水性官能团构成，是一类集吸水、保水于一体的功能高分子材料，具有高力学强度，生物可降解性，高溶胀率，生物相容性以及刺激响应性等独特性质。高分子水凝胶创伤敷料是水凝胶在医学材料上的一大应用，是近些年发展起来的一种新型敷料产品。传统上医生一般用无菌纱布及外用抗生素处理伤口，纱布容易与皮肤伤口组织粘连，换药时容易破坏新生的上皮和牙肉组织，引起出血，这不但延迟伤口愈合，而且使病人疼痛难忍。水凝胶敷料可有效克服上述缺点，其具有良好的水蒸气和气体透过率，不会和伤口粘连，易于更换。水凝胶敷料可以掺入药物成分和生长因子，促进伤口愈合，并且水凝胶材料本身的热容量大，对伤口有温和的冷却作用，可减轻伤口疼痛。因此，国内外学者对水凝胶敷料开展了广泛研究并取得了相当的成果。
在组成人体蛋白质的20中氨基酸中，γ-聚谷氨酸和ε-聚赖氨酸是目前仅有的两种自然存在的氨基酸均聚物，二者都是通过微生物发酵法制得的。γ-聚谷氨酸的分子量从十万到两百万道尔顿不等，在生物体内能降解为谷氨酸单体，被机体吸收，无毒副作用。其分子链上存在大量游离羧基，便于修饰改性。ε-聚赖氨酸的分子量在三千到五千道尔顿之间，与天然细胞外基质（ECM）中的蛋白成分和功能类似，分子链上拥有众多氨基，可有效促进细胞粘附生长，此外，ε-聚赖氨酸本身是聚阳离子，易与聚阴离子发生强静电作用，对生物膜有良好穿透力。γ-聚谷氨酸和ε-聚赖氨酸相较于传统凝胶材料优势明显，二者在体内的降解性和生物相容性都属优良，不会引起机体的排斥反应。
美国专利U.S Patent2003/0211129A1报道了以聚谷氨酸和聚赖氨酸为原料制备薄膜，利用静电吸附原理使聚谷氨酸和聚赖氨酸自组装，同时添加ZrO2、Al2O3和TiO2纳米颗粒使原料自组装成为薄膜，该薄膜可以用于药物载体。美国专利U.S Patent2012/0122219A1报道了以聚谷氨酸和软骨素为原料制备多空支架，聚谷氨酸和软骨素生物相容性极好，制备的多孔支架可以为细胞生长提供了三维的微环境，细胞在支架上的附着和生长能力很强，显示了该支架在组织工程方面的应用潜力。WO2007/075016A1报道了以聚谷氨酸和维他命C为原料制备水凝胶的报道，两种原料在EDC和NHS活化下反应成胶，冷冻干燥后得到固体。研究发现该产品可以显著抑制胶原酶的活力，并且具有抗氧化、防止皮肤褶皱的功能，在化妆品、医疗领域有广阔的应用前景。WO2009/157595A1报道了以Bacillus subtilis发酵制得的聚谷氨酸（分子量13000kDa为原料，在γ射线的作用下交联制备水凝胶，由于使用γ射线交联，没有任何化学残留，该水凝胶的安全性得到保障，且吸水保湿能力极强，在高档化妆品领域有广泛应用前景。
中国发明专利CN1629220A和CN101891954A中公开了以聚谷氨酸为主要原料制备水凝胶的方法，均采用了缩水甘油醚类交联剂，虽然所得凝胶吸水率较高，但由于其交联剂非生物源，使其生物相容性较差，一般应用于农田保水机环保絮凝等方面，医疗领域的应用大大受限。中国专利CN102585303A中公开了一种以聚赖氨酸为原料制备水凝胶的方法，该发明制备的壳聚糖/聚赖氨酸水凝胶仿生天然细胞外基质的多糖/多肽的组成成分和结构，有望作为可注射材料用作组织粘合剂，但是在制备过程中，需要分别对壳聚糖和聚赖氨酸进行化学修饰，合成的步骤较为繁琐。
综上，以聚谷氨酸和聚赖氨酸为原料分别制备水凝胶均有报道，存在着交联剂生物相容性差以及制备步骤繁琐等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种吸水率高、溶胀速率快且生物相容性好的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶。
本发明还要解决的技术问题是提供上述水凝胶的制备方法，该方法反应条件温和、步骤简易且不需要对原料做进一步化学修饰。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述水凝胶的医药用途。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶，其由γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联制备得到，且具有如下结构单元的聚合物：
Figure BDA0000435406050000031
其中，m取值15～45中的自然数，n取值3900～17000中的自然数，x取值5～40中的自然数。
其中，所述的γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸都是分别由微生物发酵法制备得到。
例如可以采用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis、巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium、炭疽芽孢杆菌Bacillus anthracis、极端耐碱芽孢杆菌Bacillus halodurans等发酵制备得到γ-聚谷氨酸【Ashiuchi M.Occurrence andbiosynthetic mechanism of poly-gamma-glutamic acid.In:Hamano Y editor.Amino-AcidHomopolymers Occurring in Nature[C].Berlin:Springer;2010.】。优选枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NX-2（保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏号：CGMCC NO.0833）发酵制备得到γ-聚谷氨酸，具体制备方法可以参考【Xu,H.,Jiang,M.,Li,H.,Lu,D.Q.,Ouyang,P.K.,Efficient production of poly(γ-glutamic acid)by newlyisolated Bacillus subtilis NX-2.Process Biochem.2005.（40）,519-523.】或【梁金丰，徐虹，姚俊，吴群，γ-聚谷氨酸提取的发酵液预处理及分离纯化工艺，食品与发酵工业，2009（3）10-15】。
例如可以采用白色链霉菌Streptomyces albulus、微白黄链霉菌streptomycesalbidoflavus、龟裂链霉菌Streptomyces rimosus、深蓝链霉菌Streptomyces cyaneus、北里孢菌Kitasatospora sp等发酵制备得到ε-聚赖氨酸【Nishikawa M,Ogawa K.Distribution ofmicrobes producing antimicrobialε-poly-L-lysine polymers in soil microflora determined bya novel method.Appl Environ Microbiol.,2002(68):3575-3581】，优选采用白色链霉菌Streptomyces albulus PD-1（保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号：CCTCCM2011043）制备得到ε-聚赖氨酸，具体制备方法可以参考【Hirohara H,Takehara M,Saimura M,Ikezaki A,Miyamoto M(2006)Biosynthesis of poly(ε-L-lysine)s in two newlyisolated strains of Streptomyces sp.Appl Microbiol Biotechnol73:321–331】或【周俊，徐虹，王军，姚忠，王辉，欧阳平凯，北里孢菌PL6-3产ε-聚赖氨酸的分离纯化和结构表征，化工学报，2006（08）：229-233】或【陈雄，袁金凤，王实玉，章莹，王金华，离子交换树脂提取发酵液中聚-ε-赖氨酸的研究，食品科技，2007（10）：144-146】。
本发明不局限于上述这些微生物以及上述这些发酵制备方法，在本专利申请日以前所有的现有的利用微生物（包括野生菌或者基因工程菌）制备得到的γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸都可以为本发明所用。采用上述生物来源的γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联后形成的聚合物都具有很好的生物相容性。
其中，γ-聚谷氨酸的分子量为50万～220万道尔顿，优选分子量为100万～120万道尔顿的γ-聚谷氨酸；ε-聚赖氨酸的分子量为2000～5500道尔顿，优选分子量为3000～4500道尔顿的ε-聚赖氨酸。
一种基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，它包括如下步骤：
(1)将含ε-聚赖氨酸的2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液（2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液简称MES缓冲液）滴加至含γ-聚谷氨酸的2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液（2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液简称MES缓冲液）中，搅拌混合均匀；
(2)将交联剂加入到步骤(1)得到的反应体系中，冰浴反应10～120min，再室温反应2～24h形成水凝胶；
(3)将步骤(2)形成的水凝胶放在透析袋中，置于去离子水中透析至溶胀平衡，之后采用冷冻干燥或者真空干燥，得到海绵状敷料。
步骤(1)中，所述的γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸都是分别由微生物发酵法制备得到。
步骤(1)中，γ-聚谷氨酸的分子量为50万～220万道尔顿，优选分子量为100万-120万道尔顿的γ-聚谷氨酸；ε-聚赖氨酸的分子量为2000～5500道尔顿，优选分子量为3000～4500道尔顿的ε-聚赖氨酸。
步骤(1)中，所述的MES缓冲液为0.1mol/L pH5.0的MES缓冲液。
步骤(1)中，含ε-聚赖氨酸的MES缓冲液为均相溶液，其中ε-聚赖氨酸的浓度为20g/L～160g/L，优选24g/L～60g/L；含γ-聚谷氨酸的MES缓冲液为均相溶液，其中γ-聚谷氨酸的质量百分含量为40g/L～200g/L，优选60g/L～120g/L。
步骤(2)中，所述交联剂为1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N–hydroxysulfosuccinimide，NHS)的组合（简称EDC/NHS）、或者为1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt，sulfo-NHS)的组合（简称EDC/sulfo-NHS），或者为1-环己基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate，简称CMC)，或者伍德沃德氏试剂K（即2-乙基-5-苯基异恶唑-3-磺酸盐，N-ethyl-3-phenylisoxazolium-3’-sulfonate）。
当所述交联剂为1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的组合，则γ-聚谷氨酸所含羧基：ε-聚赖氨酸所含氨基：1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺的投料摩尔比例范围为1：0.25～0.5：0.25～1：0.25～1，优选1：0.4～0.5：0.6～0.8：0.6～0.8。以EDC和NHS为活化剂制备水凝胶，EDC可快速催化原料形成酰胺键，NHS可以提高反应的效率并减少重排副产物的生成，并可以通过水洗透析将活化剂除去。
当所述交联剂为1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的组合，则γ-聚谷氨酸所含羧基：ε-聚赖氨酸所含氨基：1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺：N-羟基硫代琥珀酰亚胺的投料摩尔比例范围为1：0.25～0.5：0.25～1：0.25～1，优选1：0.4～0.5：0.5～0.8：0.5～0.8。
当所述交联剂为1-环己基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐，则γ-聚谷氨酸所含羧基：ε-聚赖氨酸所含氨基：1-环己基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐的投料摩尔比例范围为1：0.25～0.5：0.25～1，优选1:0.4～0.5：0.3～0.6。
当所述交联剂为伍德沃德氏试剂K，在γ-聚谷氨酸所含羧基：ε-聚赖氨酸所含氨基：伍德沃德氏试剂K的投料摩尔比例范围为1：0.25～0.5：0.25～1，优选1:0.4～0.5:0.6～0.9。
步骤(2)中，冰浴反应时间优选30min，室温反应时间优选2h。
步骤(3)中，冷冻干燥温度为-40℃；真空干燥温度为60℃，上述干燥过程后，使得产品的含水量控制在1～3wt%。
本发明方法还可以对制得的海绵状敷料做进一步的加工。
例如，可以将所述海绵状敷料研磨粉碎，用铝复合膜分装，以制得干凝胶粉剂。
或者，将所述海绵状敷料加1～10倍重量的水制成软材，分装于聚乙烯管中，密封包装，以制得水凝胶剂。
或者，将所述海绵状敷料加1～5倍重量的水制成软材，压成薄膜片置于聚乙烯膜上，70～90℃气流烘干，使其含水量为20～60wt%，再复合上聚乙烯透气膜，剪切后用铝复合膜密封，以制得凝胶膜剂。
按照上述所有的制备方法制得的水凝胶都在本发明的保护范围之内。
按照上述所有的制备方法制得的水凝胶在制备医用创伤敷料中的应用也都在本发明的保护范围之内。
本发明的反应原理图见图1。
本发明与现有技术相比，具有的显著优点是：以微生物发酵制得的γ-聚谷氨酸和ε-聚赖氨酸为原料，原料的体内的降解性和生物相容性都属优良，不会引起机体的排斥反应，细胞粘附性良好。制备方法反应条件温和，步骤简易，不需要对原料做进一步化学修饰即可反应制成水凝胶，所得水凝胶吸水率高，溶胀速率快，在创伤敷料领域具有良好应用前景。
附图说明
图1为本发明的反应原理图。
图2为基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的核磁共振氢谱（1H-NMR）。
图3为实施例1的γ-聚谷氨酸-ε-聚赖氨酸交联聚合物水凝胶红外图谱（FTIR）。(a)ε-聚赖氨酸，（b）γ-聚谷氨酸，（c）ε-聚赖氨酸-γ-聚谷氨酸水凝胶。
图4为基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶（实施例1）的电镜图片（SEM）。
图5为共聚光激光扫描显微镜（CLSM）测定细胞相容性情况，细胞生长在水凝胶支架上，活细胞为绿色，死亡细胞为红色。a)聚谷氨酸水凝胶支架上成纤维细胞的生长b）γ-聚谷氨酸-ε-聚赖氨酸交联聚合物水凝胶支架上成纤维细胞的生长。
图6为家兔背部伤口愈合实验，a)对照组仅用纱布覆盖后绷带包扎，b)使用聚谷氨酸水凝胶敷料处理组，c)使用γ-聚谷氨酸-ε-聚赖氨酸交联聚合物水凝胶敷料处理组。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例所用试剂来源如下：
γ-聚谷氨酸和ε-聚赖氨酸：购于南京轩凯生物科技有限公司。
MES（2-（N-吗啡啉）乙磺酸），EDC(1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺)
NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)购自国药集团化学试剂有限公司，CMC(1-环己基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐)和（2-乙基-5-苯基异恶唑-3-磺酸盐）购自Sigma-Aldrich公司。
以下实施例所用设备来源如下：
磁力搅拌器：型号85-2C，上海扭航仪器设备有限公司。
冷冻干燥机：型号FD-1C-50，北京博医康实验仪器有限公司。
真空干燥箱：型号YZG-600，南京焱泰电热设备有限公司。
红外光谱仪：型号Nicolet380，美国Thermo公司。
核磁共振仪：型号AVANCE AV-500，美国Bruker Daltonics公司。
实施例1：
室温下将4.0gγ-聚谷氨酸（100万～120万道尔顿，含有0.031mol羧基）溶解于50ml的0.1mol/L MES缓冲液（pH5.0）中，并搅拌至形成澄清溶液。室温下将1.78gε-聚赖氨酸（3000～4500道尔顿，含有0.014mol氨基）溶解于50ml0.1mol/L MES缓冲液（pH5.0），逐滴将ε-聚赖氨酸溶液滴加到聚谷氨酸溶液中，搅拌使溶液均匀混合。将4.17g(0.0217mol)EDC和2.50g(0.0217mol)NHS加入到上述γ-聚谷氨酸和ε-聚赖氨酸混合液中，控制γ-聚谷氨酸所含有的羧基：ε-聚赖氨酸所含有的氨基：EDC：NHS的投料摩尔比为1：0.45：0.7：0.7，冰浴反应30min，之后室温反应2h形成水凝胶。将形成的水凝胶放在透析袋中，置于去离子水中透析至溶胀平衡，之后采用冷冻干燥或者真空干燥得到海绵状敷料，所得水凝胶的膨胀率为96.6g/g。其结构鉴定见图2,γ-聚谷氨酸-ε-聚赖氨酸交联聚合物水凝胶NMR图谱，可以看到γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸的化学结合，形成了交联聚合物。图3的红外图谱同样证明了γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物水凝胶的形成。由于ε-聚赖氨酸有很多游离氨基，在1546cm-1和1113cm-1处特征峰明显，交联形成水凝胶后，在ε-聚赖氨酸的氨基与γ-聚谷氨酸的羧基之间发生反应生成酰胺键，在形成的聚合物中游离氨基数量大大减少，故这两处特征峰不再明显。此外，在3500～3300cm-1的位置出现的一个宽峰也是水凝胶的特征吸收峰，主要是羟基的伸缩振动和酰胺键上的N-H伸缩振动引起的。图4的扫描电镜显示了制备的水凝胶的表面形貌，表明本发明制备的水凝胶为三维孔状结构，孔径100～200μm之间，适合作为创伤敷料。
实施例2：
室温下将5.0gγ-聚谷氨酸（100万～120万道尔顿，含有0.039mol羧基）溶解于50mL的0.1mol/L MES缓冲液（pH5.0）中，并搅拌至形成澄清溶液。室温下将1.99gε-聚赖氨酸（3000～4500道尔顿，含有0.0156mol氨基）溶解于50mL0.1mol/L MES缓冲液（pH5.0），逐滴将ε-聚赖氨酸溶液滴加到聚谷氨酸溶液中，搅拌使溶液均匀混合。将4.49g（0.023mol）EDC和5.08g（0.023mol）sulfo-NHS加入到上述γ-聚谷氨酸和ε-聚赖氨酸混合液中，控制γ-聚谷氨酸所含有的羧基：ε-聚赖氨酸所含有的氨基：EDC：Sulfo-NHS的投料摩尔比为1：0.4：0.6：0.6，冰浴反应30min，之后室温反应2h形成水凝胶。将形成的水凝胶放在透析袋中，置于去离子水中透析至溶胀平衡，之后采用冷冻干燥或者真空干燥得到海绵状敷料，所得水凝胶的膨胀率为73.8g/g。
实施例3：
室温下将6.0gγ-聚谷氨酸（100万～120万道尔顿，含有0.047mol羧基）溶解于50mL的0.1mol/L MES缓冲液（pH5.0）中，并搅拌至形成澄清溶液。室温下将3.0gε-聚赖氨酸（3000～4500道尔顿，含有0.0235mol氨基）溶解于50mL0.1mol/L MES缓冲液（pH5.0），逐滴将ε-聚赖氨酸溶液滴加到聚谷氨酸溶液中，搅拌使溶液均匀混合。将7.95g（0.0188mol）CMC加入到上述γ-聚谷氨酸和ε-聚赖氨酸混合液中，控制γ-聚谷氨酸所含有的羧基：ε-聚赖氨酸所含有的氨基：CMC的投料摩尔比为1：0.5：0.4，冰浴反应30min，之后室温反应2h形成水凝胶。将形成的水凝胶放在透析袋中，置于去离子水中透析至溶胀平衡，之后采用冷冻干燥或者真空干燥得到海绵状敷料，所得水凝胶的膨胀率为48.4g/g。
实施例4：
室温下将4.5gγ-聚谷氨酸（100万～120万道尔顿，含有0.035mol羧基）溶解于50ml的0.1mol/L MES缓冲液（pH5.0）中，并搅拌至形成澄清溶液。室温下将2.24gε-聚赖氨酸（3000～4500道尔顿，含有0.0175mol氨基）溶解于50mL0.1mol/L MES缓冲液（pH5.0），逐滴将ε-聚赖氨酸溶液滴加到聚谷氨酸溶液中，搅拌使溶液均匀混合。将7.08g（0.028mol）伍德沃德氏试剂K加入到上述γ-聚谷氨酸和ε-聚赖氨酸混合液中，控制γ-聚谷氨酸所含有的羧基：ε-聚赖氨酸所含有的氨基：伍德沃德氏试剂K的投料摩尔比为1：0.5：0.8，冰浴反应30min，之后室温反应2h形成水凝胶。将形成的水凝胶放在透析袋中，置于去离子水中透析至溶胀平衡，之后采用冷冻干燥或者真空干燥得到海绵状敷料，所得水凝胶的膨胀率为52.7g/g。
实施例5：
同实施例1的方法，所不同的是控制γ-聚谷氨酸所含有的羧基：ε-聚赖氨酸所含有的氨基：EDC：NHS的投料摩尔比为1：0.25：0.25：0.25，结果所得水凝胶的膨胀率为12.5g/g。
实施例6：
同实施例1的方法，所不同的是控制γ-聚谷氨酸所含有的羧基：ε-聚赖氨酸所含有的氨基：EDC：NHS的投料摩尔比为1：0.5：1：1，结果所得水凝胶的膨胀率为38.6g/g。
实施例7：
同实施例2的方法，所不同的是控制γ-聚谷氨酸所含有的羧基：ε-聚赖氨酸所含有的氨基：EDC：Sulfo-NHS的投料摩尔比为1：0.25：0.25：0.25，结果所得水凝胶的膨胀率为30.2g/g。
实施例8：
同实施例2的方法，所不同的是控制γ-聚谷氨酸所含有的羧基：ε-聚赖氨酸所含有的氨基：EDC：Sulfo-NHS的投料摩尔比为1：0.5：1：1，结果所得水凝胶的膨胀率为42.3g/g。
实施例9：
同实施例3的方法，所不同的是控制γ-聚谷氨酸所含有的羧基：ε-聚赖氨酸所含有的氨基：CMC的投料摩尔比为1：0.25：0.25，结果所得水凝胶的膨胀率为33.7g/g。
实施例10：
同实施例3的方法，所不同的是控制γ-聚谷氨酸所含有的羧基：ε-聚赖氨酸所含有的氨基：CMC的投料摩尔比为1：0.5：1，结果所得水凝胶的膨胀率为39.4g/g。
实施例11：
同实施例4的方法，所不同的是控制γ-聚谷氨酸所含有的羧基：ε-聚赖氨酸所含有的氨基：伍德沃德氏试剂K的投料摩尔比为1：0.25：0.25，结果所得水凝胶的膨胀率为36.6g/g。
实施例12：
同实施例4的方法，所不同的是控制γ-聚谷氨酸所含有的羧基：ε-聚赖氨酸所含有的氨基：伍德沃德氏试剂K的投料摩尔比为1：0.5：1，结果所得水凝胶的膨胀率为43.4g/g。
实施例13：
同实施例4的方法，所不同的是冰浴反应10min，再室温5h形成水凝胶，结果所得水凝胶的膨胀率为35.8g/g。
实施例14：
同实施例4的方法，所不同的是冰浴反应120min，再室温24h形成水凝胶，结果所得水凝胶的膨胀率为26.9g/g。
对比例1：
室温下将4.0gγ-聚谷氨酸（100万～120万道尔顿，含有0.031mol羧基）溶解于50mL的0.1mol/L MES缓冲液（pH5.0）中，并搅拌至形成澄清溶液。将4.17g（0.0217mol）EDC和2.50g（0.0217mol）NHS加入到γ-聚谷氨酸溶液中，控制γ-聚谷氨酸所含有的羧基：EDC：NHS的投料摩尔比为1：0.7：0.7，冰浴反应30min，之后室温反6h形成水凝胶。将形成的水凝胶放在透析袋中，置于去离子水中透析至溶胀平衡，之后采用冷冻干燥或者真空干燥得到海绵状敷料，所得水凝胶的膨胀率为3.4g/g。
对比例2：
室温下将1.78gε-聚赖氨酸（3000～4500道尔顿，含有0.014mol氨基）溶解于50mL的0.1mol/L MES缓冲液（pH5.0）中，并搅拌至形成澄清溶液。将4.16g EDC（0.0217mmol）和2.50g NHS（0.0217mmol）加入到ε-聚赖氨酸溶液中，控制ε-聚赖氨酸所含有的氨基：EDC：NHS的投料摩尔比为0.45：0.7：0.7。冰浴反应30min，之后室温反9h形成水凝胶。将形成的水凝胶放在透析袋中，置于去离子水中透析至溶胀平衡，之后采用冷冻干燥或者真空干燥得到海绵状敷料，所得水凝胶的膨胀率为2.8g/g。
对比例3：
室温下将4.0gγ-聚谷氨酸（100万～120万道尔顿，含有0.031mol羧基）溶解于50mL的0.1mol/L MES缓冲液（pH5.0）中，并搅拌至形成澄清溶液。室温下将1.78gε-聚赖氨酸（3000～4500道尔顿，含有0.014mol氨基）溶解于50mL0.1mol/L MES缓冲液（pH5.0），逐滴将ε-聚赖氨酸溶液滴加到聚谷氨酸溶液中，控制γ-聚谷氨酸所含有的羧基：ε-聚赖氨酸所含有的氨基的投料摩尔比为1:0.45，搅拌使溶液均匀混合，不能形成水凝胶。
实施例15：
将实施例1-4中的海绵状敷料研磨粉碎，用铝复合膜分装，制成干凝胶粉剂。
实施例16：
取实施例1-4中的海绵状敷料5g，加30g水制成软材，分装于聚乙烯管中，密封而制成水凝胶剂。
实施例17：
取实施例1-4中的海绵状敷料5g，加20g水制成软材，压成薄膜片置于聚乙烯膜上，80℃气流烘干，使其含水量40wt%，再复合上聚乙烯透气膜，剪切后用铝复合膜密封而制成凝胶膜剂。
实验例18：细胞相容性实验。
向实施例1中的海绵状敷料中，加入3倍敷料重量的水制成软材水凝胶，将成纤维细胞以5×104/cm2的浓度，接种到水凝胶的表面，37℃体外培养6h。细胞用LIVE/DEAD荧光试剂盒染色，活细胞被染上绿色的荧光物质(calcein-AM)，而死细胞则被染上红色的荧光物质(EthD-I)。然后用共聚光激光扫描显微镜（CLSM）观测细胞存活情况。参见图5，a)中的红色荧光物质明显高于b)，说明γ-聚谷氨酸水凝胶支架上的细胞有相当数量的细胞死亡，而γ-聚谷氨酸-ε-聚赖氨酸交联聚合物水凝胶支架上的细胞，大部分都是存活的，这显示了本发明的水凝胶良好的生物相容性。
实验例19：伤口愈合实验。
在家兔背部剪毛后，再用硫化钠溶液脱毛48h，每只家兔皮下注射0.5%利多卡因注射液0.5mL局麻，供3处，在局麻部位用手术剪剪出直径约1.0cm的圆形全皮切口三处，用70v/v%酒精消毒，将实施例1中的创伤敷料涂布在伤口处，用石蜡脱脂棉纱布覆盖，再用绷带包扎，对照组一组仅用纱布覆盖后绷带包扎，另外一组采用γ-聚谷氨酸水凝胶敷料涂敷。实验过程中各组均未发生细菌感染现象，分别于0，7，14天后观察伤口愈合情况。参见图6，随着治疗时间的延长，三组家兔伤口均有愈合的现象，水凝胶敷料处理组均优于仅用纱布处理组；使用γ-聚谷氨酸-ε-聚赖氨酸交联聚合物水凝胶敷料处理组，伤口面积只有γ-聚谷氨酸水凝胶对照组的40%，伤口明显变小，表面光滑平整，显示出优良的生物相容性及促进伤口愈合的能力。
综合评价：本发明的γ-聚谷氨酸/ε-聚赖氨酸水凝胶创伤敷料，生物相容性良好，有利于细胞附着生长，对伤口愈合具有促进作用，有效减少组织液渗出，在医用创伤敷料领域应用前景广阔。

Claims (18)

1.一种基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶，其特征在于，其由γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联制备得到，且具有如下结构单元的聚合物：
Figure FDA0000435406040000011
其中，m取值15～45中的自然数，n取值3900～17000中的自然数，x取值5-40中的自然数。
2.根据权利要求1所述的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶，其特征在于，所述的γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸都是分别由微生物发酵法制备得到。
3.根据权利要求1或2所述的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶，其特征在于，γ-聚谷氨酸的分子量为50万～220万道尔顿，ε-聚赖氨酸的分子量为2000～5500道尔顿。
4.一种基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)将含ε-聚赖氨酸的2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液滴加至含γ-聚谷氨酸的2-（N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液中，搅拌混合均匀；
(2)将交联剂加入到步骤(1)得到的反应体系中，冰浴反应10～120min，再室温反应2～24h形成水凝胶；
(3)将步骤(2)形成的水凝胶放在透析袋中，置于去离子水中透析至溶胀平衡，之后采用冷冻干燥或者真空干燥，得到海绵状敷料。
5.根据权利要求4所述的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸都是分别由微生物发酵法制备得到。
6.根据权利要求4所述的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，γ-聚谷氨酸的分子量为50万～220万道尔顿，ε-聚赖氨酸的分子量为2000～5500道尔顿。
7.根据权利要求4所述的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的MES缓冲液为0.1mol/L pH5.0的MES缓冲液。
8.根据权利要求4所述的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，含ε-聚赖氨酸的MES缓冲液为均相溶液，其中ε-聚赖氨酸的浓度为20g/L～160g/L；含γ-聚谷氨酸的MES缓冲液为均相溶液，其中γ-聚谷氨酸的质量百分含量为40g/L～200g/L。
9.根据权利要求4所述的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述交联剂为1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的组合，或者为1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的组合，或者为1-环己基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐，或者为伍德沃德氏试剂K。
10.根据权利要求9所述的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述交联剂为1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的组合，则γ-聚谷氨酸所含羧基：ε-聚赖氨酸所含氨基：1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺的投料摩尔比例范围为1：0.25～0.5：0.25～1：0.25～1。
11.根据权利要求9所述的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述交联剂为1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺的组合，则γ-聚谷氨酸所含羧基：ε-聚赖氨酸所含氨基：1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺：N-羟基硫代琥珀酰亚胺的投料摩尔比例范围为1：0.25～0.5：0.25～1：0.25～1。
12.根据权利要求9所述的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述交联剂为1-环己基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐，则γ-聚谷氨酸所含羧基：ε-聚赖氨酸所含氨基：1-环己基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐的投料摩尔比例范围为1：0.25～0.5：0.25～1。
13.根据权利要求9所述的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述交联剂为伍德沃德氏试剂K，在γ-聚谷氨酸所含羧基：ε-聚赖氨酸所含氨基：伍德沃德氏试剂K的投料摩尔比例范围为1：0.25～0.5：0.25～1。
14.根据权利要求4所述的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，其特征在于，将所述海绵状敷料研磨粉碎，用铝复合膜分装，制得干凝胶粉剂。
15.根据权利要求4所述的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，其特征在于，将所述海绵状敷料加1～10倍重量的水制成软材，分装于聚乙烯管中，密封包装，制得水凝胶剂。
16.根据权利要求4所述的基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，其特征在于，将所述海绵状敷料加1～5倍重量的水制成软材，压成薄膜片置于聚乙烯膜上，70～90℃气流烘干，使其含水量为20～60wt%，再复合上聚乙烯透气膜，剪切后用铝复合膜密封，制得凝胶膜剂。
17.权利要求4～16中任意一项方法制备得到的水凝胶。
18.权利要求1～3中任意一项或权利要求17所述的水凝胶在制备医用创伤敷料中的应用。
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