CN109504082A - 一种蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，主要应用于大分子自组装领域，其制备及工艺为：首先使用等电聚焦法制备等电点在5.5‑6.0的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白，将相同浓度的ε‑聚赖氨酸与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液混合，进行组装，最后加入乙二醛固定液对胶组装体结构进行持续固定，自然晾干，制备出自组装纳米孔径膜。本发明利用聚氨基酸和蛋白质这两种天然高分子聚合物通过自组装的方法，首次制备了纳米孔径膜，在自组装领域尚属首次发现。本发明制备纳米孔径膜的方法，是一种绿色无毒害无污染的方法，具有良好的生物可降解性，在药物缓释，生物膜制备及生物开关等高新领域具有较高的科研价值及应用前景。

Description

一种蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法
技术领域
本发明涉及大分子自组装领域，具体涉及一种蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法。
背景技术
自组装指基本结构单元(分子，纳米材料，微米或更大尺度的物质）在非人为力量的作用下，通过静电作用、氢键、配位键、重力、亲水/疏水作用、表面张力、毛细管力、π-π相互作用、离心力、内应力、模板驱动等非共价键的作用力结合成热力学稳定，结构稳定，性质特殊具有一定规则几何外观的结构聚集体的过程就叫做自组装。自组装过程组成物质之间同时自发的发生关联并集合在一起形成一个紧密而又有序的整体，它是一种宏观的的复杂协同作用所导致的结果。
据研究，通过自组装技术可以形成团簇、球形、链状、管状、片状、囊泡、微管、团簇、球形、链状、管状和柱状等各种形貌的自组装体，可应用于药物缓释，生物传感器，生物滤膜，神经修复材料及基因传输系统等领域，自组装技术由于操作方法简便、制备产物结构多样、性能优良等等优点，已在物理、化学、生物、材料、医学等领域获得很大运用，并且越来越受到科学界重视。同时，自组装技术与纳米技术的结合，可以实现新型微小结构的成功构造，对现代技术小型传感器，生物载体，微型光学元件等多学科多交叉科学的发展和理论研究有着重要的意义。
ε-聚赖氨酸是一种含有25至30个赖氨酸残基的同型单体聚合物，ε-聚赖氨酸由赖氨酸单体组成，其等电点为9.0，其结构式为：。
ε-聚赖氨酸是一种广谱抗菌剂，对霉菌、病毒、革兰阳性和革兰阴性细菌等都有明显的杀灭和抑制作用。分子量在3600-4300之间的ε-聚赖氨酸其抑菌活性最好，当分子量低于1300时，ε-聚赖氨酸失去抑菌活性。ε-聚赖氨酸具有抑菌谱广、水溶性好、安全性高、热稳定性好、抑菌pH范围广等特点，微溶于乙醇，略有苦味。其理化性质稳定，对热比较稳定。
角蛋白分子结构的特点为二硫键、氢键、盐式键将α-氨基酸缩合而成的链状大分子组织在一起所形成网络状结构。角蛋白与其他结构蛋白的不同之处在于其含有大量的半光氨酸残基，占到氨基酸残基总量的7-20%，这些位于分子内及分子之间的半光氨酸残基通过二硫键将角蛋白连接成一个紧密的具有三维结构的稳定蛋白质。通过还原法制备的角蛋白大分子具有较强的自组装能力，能够自组装形成多种形貌聚集体，在天然大分子自组装领域有着良好的研究与应用前景。
角蛋白根据氨基酸中含硫量的高低可以分为三类：高硫角蛋白、低硫角蛋白及高甘氨酸/酪氨酸角蛋白。它们的等电点大致位于3.0-3.5，4.9-5.4及5.5-6.0之间，分子量范围分别位于11000-30000Da，45000-58000Da及10000Da以下。在角蛋白中低硫角蛋白约占49-68%，高硫角蛋白约占19-36%，高甘氨酸/酪氨酸角蛋白约占1%-12%。低硫角蛋白中半胱氨酸含量在16-30%之间，高硫角蛋白半胱氨酸含量大于30%，高甘氨酸/酪氨酸角蛋白甘氨酸和酪氨酸的含量在35-60%之间。为了使角蛋白的成膜性不受其含硫量的影响，本发明使用含硫量最低的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白作为自组装体制备的原料。
发明内容
本发明提出了一种蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，首次使用ε-聚赖氨酸与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白这两种天然高分子物质作为制备组装体原料，主要利用这两种天然高分子物质的等电点差异，即ε-聚赖氨酸（pI9.0）及高甘氨酸/酪氨酸角蛋白（pI5.5-6.0）等电点差异，将溶液的pH值即组装环境调节至6.0至9.0之间，使ε-聚赖氨酸在溶液中呈正电性，而高甘氨酸/酪氨酸角蛋白呈负电性，从而使这两种天然高分子发生静电结合，并加入固定剂将其形貌固定下来，制备出具有纳米孔径的自组装膜，在人工皮肤，医学领域，生物滤膜，药物缓释领域有着广泛的应用前景，并且完全无毒可降解，也是一种绿色无污染无毒害的纳米孔径膜制备方法。
实现本发明的技术方案是：一种蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，步骤如下：
（1）高甘氨酸/酪氨酸角蛋白的制备
a. 将硫脲溶液、尿素溶液和β–巯基乙醇溶液加入到超纯水中搅拌均匀，制备等电聚焦溶解液；将角蛋白粉末加入到等电聚焦溶解液中，搅拌均匀得到角蛋白等电聚焦上样溶液；
b. 将角蛋白等电聚焦上样溶液利用等电聚焦法制备得到等电点在5.5-6.0的角蛋白等电聚焦溶液，角蛋白等电聚焦溶液利用切向流超滤系统超滤，超滤后利用透析袋在无氧水中透析，真空烘干得到高甘氨酸/酪氨酸角蛋白；
（2）ε-聚赖氨酸溶液与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液的制备
将ε-聚赖氨酸溶于去离子水中，配制成浓度为0.25-0.5%的ε-聚赖氨酸溶液；
将高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶于去离子水中，利用NaOH将溶液的pH值调整到6.0-9.0之间，持续搅拌直至高甘氨酸/酪氨酸角蛋白完全溶解，制备出浓度为0.25-0.5%的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液；
（3）自组装纳米孔径膜的组装与制备
将步骤（2）得到的ε-聚赖氨酸溶液与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液混合均匀，利用滤膜过滤后注入到反应器中，搅拌混合2-4h，调整pH值至6.0-9.0，组装6-12h，最后加入乙二醛固定液固定8-12h，晾干后得到自组装纳米孔径膜。
所述步骤a中角蛋白粉末的制备方法如下：将动物毛发与硫化钠加入密闭的玻璃容器中，加入蒸馏水，在室温下避光放置7-10d，过滤得到角蛋白溶液；将角蛋白溶液pH值调整为1.0-4.0，使角蛋白迅速沉淀，继续沉淀1-3h，弃去上层液体，在室温下离心，收集下层的角蛋白沉淀，烘干得到角蛋白粉末。
所述动物毛发、硫化钠和蒸馏水的质量比为1:0.75：（20-30），离心转速为4000-6000转/min。
所述步骤a中硫脲溶液、尿素溶液和β–巯基乙醇溶液的浓度分别为4M，3M和5%，硫脲溶液、尿素溶液、β–巯基乙醇溶液的质量比为（1-2）：（1-2）:1，角蛋白等电聚焦上样溶液的浓度为1mg/mL。
所述步骤b中将收集到的电点在5.5-6.0的角蛋白等电聚焦溶液依次用截留分子量为30KD及1KD的膜包进行超滤，超滤完毕后利用截留分子量为1KD的透析袋在无氧水中进行透析。
所述步骤（2）中ε-聚赖氨酸的聚合度DP在25-30，分子量范围在3600-4300Da。
所述步骤（3）中ε-聚赖氨酸溶液与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液的浓度相同，ε-聚赖氨酸溶液与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液的质量比为（2-8）：1，滤膜的孔径为0.22μm。
所述步骤（3）中反应器的温度为25-40℃，转速为30-50rpm，乙二醛固定液的浓度为0.1-0.3%。
本发明的有益效果是：本发明利用聚氨基酸和蛋白质这两种天然高分子聚合物通过自组装的方法，首次制备了纳米孔径膜，在自组装领域尚属首次发现。本发明制备纳米孔径膜的方法，是一种绿色无毒害无污染的方法，具有良好的生物可降解性，在药物缓释，生物膜制备及生物开关等高新领域具有较高的科研价值及应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1的扫描电镜图。
图2为实施例2的扫描电镜图。
图3为实施例3的扫描电镜图。
图4为实施例4的扫描电镜图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，包括以下步骤：
1）高甘氨酸/酪氨酸角蛋白的制备
使用等电聚焦法制备等电点在5.5的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白，制备步骤具体如下：取去脂洗净的牛毛与Na2S按照质量比4:3加入密闭的玻璃容器中，加入牛毛质量20倍的蒸馏水。在室温下避光放置7d，过滤得到角蛋白溶液。
将角蛋白溶液置于密闭的玻璃容器中，快速加入浓盐酸使体系pH值在较短时间内达到3.0，使角蛋白迅速沉淀，继续沉淀1h，弃去上层液体，在室温下离心（转速为4000转/min），收集下层的角蛋白沉淀。
将4M的硫脲溶液、3M的尿素溶液和5%的β–巯基乙醇溶液按质量比为1:1:1加入超纯水中搅拌均匀，制备角蛋白等电聚焦溶解液。将1.0g角蛋白粉末加入到1000mL等电聚焦溶解液中，磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为1mg/mL角蛋白等电聚焦上样溶液。
用50mL注射器把样品注入聚焦槽腔体，样品注入量为50mL。设定体系温度为15℃。平衡10min。聚焦功率设定为15W，开始聚焦，持续聚焦5h。当仪表显示电压及电流持续不变时，再持续聚焦30min，关闭电源，收集等电聚焦样品。将收集到的等电点为5.5的角蛋白等电聚焦溶液使用切向流超滤系统超滤。依次用截留分子量为30KD及1KD的膜包进行超滤。超滤完毕后再用截留分子量为1KD的透析袋在无氧水中进行透析，将得到的角蛋白在真空干燥箱内晾干，低温密封保存。
2）ε-聚赖氨酸与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白自组装体溶液的制备
取聚合度DP在25-30，分子量范围在3600-4300Da的ε-聚赖氨酸溶解于去离子水中，配制成浓度为0.25%的溶液。将第一步制备的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白置于去离子水中，使用0.1MNaOH的将溶液的pH值调整到9.0，持续搅拌直至角蛋白完全溶解，制备出0.25%的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液。
3）自组装纳米孔径膜的组装与制备：
将相同浓度的上述步骤制备的浓度为0.25%的ε-聚赖氨酸与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液按照质量比8:1的比例混合，使用孔径0.22μm孔径的滤膜过滤去除不溶性物质以及杂质，在组装温度为25℃的条件下，注入到EYELA有机合成装置（型号：PPM-5512）的反应器中，设定转速为30rpm，低速混合2小时。使用0.1mol/L的稀盐酸将体系的pH值调节至7.0，在此条件下持续组装12小时，最后加入0.2%的乙二醛固定液对胶组装体结构进行持续固定8小时，将其硅片上自然晾干，制备出自组装纳米孔径膜。
实施例2
一种蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，包括以下步骤：
1）高甘氨酸/酪氨酸角蛋白的制备
使用等电聚焦法制备等电点在6.0的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白，制备步骤具体如下：取去脂洗净的牛毛与Na2S按照质量比4:3加入密闭的玻璃容器中，加入牛毛质量25倍的蒸馏水。在室温下避光放置8d，过滤得到角蛋白溶液。
将角蛋白溶液置于密闭的玻璃容器中，快速加入浓盐酸使体系pH值在较短时间内达到2.0，使角蛋白迅速沉淀，继续沉淀1.5h，弃去上层液体，在室温下离心（转速为4500转/min），收集下层的角蛋白沉淀。
将4M的硫脲溶液、3M的尿素溶液和5%的β–巯基乙醇溶液按质量比为2:1:1加入超纯水中搅拌均匀，制备角蛋白等电聚焦溶解液。将1.5g角蛋白粉末加入到1000mL等电聚焦溶解液中，磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为1.5mg/mL角蛋白等电聚焦上样溶液。
用50mL注射器把样品注入聚焦槽腔体，样品注入量为50mL。设定体系温度为15℃。平衡10min。聚焦功率设定为15W，开始聚焦，持续聚焦6h。当仪表显示电压及电流持续不变时，再持续聚焦30min，关闭电源，收集等电聚焦样品。将收集到的等电点为6.0的角蛋白等电聚焦溶液使用切向流超滤系统超滤。依次用截留分子量为30KD及1KD的膜包进行超滤。超滤完毕后再用截留分子量为1KD的透析袋在无氧水中进行透析，将得到的角蛋白在真空干燥箱内晾干，低温密封保存。
2）ε-聚赖氨酸与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白自组装体溶液的制备
取聚合度DP在25-30，分子量范围在3600-4300Da的ε-聚赖氨酸溶解于去离子水中，配制成浓度为0.3%的溶液。将第一步制备的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白置于去离子水中，使用0.1MNaOH的将溶液的pH值调整到8.5，持续搅拌直至角蛋白完全溶解，制备出0.3%的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液。
3）自组装纳米孔径膜的组装与制备
将相同浓度的上述步骤制备的浓度为0.3%的ε-聚赖氨酸与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液按照质量比4:1的比例混合，使用孔径0.22μm孔径的滤膜过滤去除不溶性物质以及杂质，在组装温度为30℃的条件下，注入到EYELA有机合成装置（型号：PPM-5512）的反应器中，设定转速为35rpm，低速混合2.5小时。使用0.1mol/L的稀盐酸将体系的pH值调节至8.0的范围，在此条件下持续组装10小时，最后加入0.1%的乙二醛固定液对胶组装体结构进行持续固定10小时，将其硅片上自然晾干，制备出自组装纳米孔径膜。
实施例3
一种蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，包括以下步骤：
1）高甘氨酸/酪氨酸角蛋白的制备
使用等电聚焦法制备等电点在5.5的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白，制备步骤具体如下：取取去脂洗净的鸡毛，与Na2S按照质量比4:3加入密闭的玻璃容器中，加入鸡毛质量25倍的蒸馏水。在室温下避光放置9d，过滤得到角蛋白溶液。
将角蛋白溶液置于密闭的玻璃容器中，快速加入浓盐酸使体系pH值在较短时间内达到1.0，使角蛋白迅速沉淀，继续沉淀2h，弃去上层液体，在室温下离心（转速为5000转/min），收集下层的角蛋白沉淀。
将4M的硫脲溶液、3M的尿素溶液和5%的β–巯基乙醇溶液按质量比为1:2:1加入超纯水中搅拌均匀，制备角蛋白等电聚焦溶解液。将0.5g角蛋白粉末加入到1000mL等电聚焦溶解液中，磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为0.5mg/mL角蛋白等电聚焦上样溶液。
用50mL注射器把样品注入聚焦槽腔体，样品注入量为50mL。设定体系温度为15℃。平衡10min。聚焦功率设定为15W，开始聚焦，持续聚焦4h。当仪表显示电压及电流持续不变时，再持续聚焦30min，关闭电源，收集等电聚焦样品。将收集到的等电点为5.5的角蛋白等电聚焦溶液使用切向流超滤系统超滤。依次用截留分子量为30KD及1KD的膜包进行超滤。超滤完毕后再用截留分子量为1KD的透析袋在无氧水中进行透析，将得到的角蛋白在真空干燥箱内晾干，低温密封保存。
2）ε-聚赖氨酸与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白自组装体溶液的制备
取聚合度DP在25-30，分子量范围在3600-4300Da的ε-聚赖氨酸溶解于去离子水中，配制成浓度为0.4%的溶液。将第一步制备的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白置于去离子水中，使用0.1MNaOH的将溶液的pH值调整到9.0，持续搅拌直至角蛋白完全溶解，制备出0.4%的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液。
3）自组装纳米孔径膜的组装与制备
将相同浓度的上述步骤制备的浓度为0.4 %的ε-聚赖氨酸与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液按照质量比2:1的比例混合，使用孔径0.22μm孔径的滤膜过滤去除不溶性物质以及杂质，在组装温度为40℃的条件下，注入到EYELA有机合成装置（型号：PPM-5512）的反应器中，设定转速为50rpm，低速混合4小时。使用0.1mol/L的稀盐酸将体系的pH值调节至7.5，在此条件下持续组装11小时，最后加入0.25%的乙二醛固定液对胶组装体结构进行持续固定11小时，将其硅片上自然晾干，制备出自组装纳米孔径膜。
实施例4
一种蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，包括以下步骤：
1）高甘氨酸/酪氨酸角蛋白的制备
使用等电聚焦法制备等电点在6.0的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白，制备步骤具体如下：取脱脂洗净的鸡毛，与Na2S按照质量比4:3加入密闭的玻璃容器中，加入鸡毛质量25倍的蒸馏水。在室温下避光放置10d，过滤得到角蛋白溶液。
将角蛋白溶液置于密闭的玻璃容器中，快速加入浓盐酸使体系pH值在较短时间内达到1.5，使角蛋白迅速沉淀，继续沉淀2.5h，弃去上层液体，在室温下离心（转速为6000转/min），收集下层的角蛋白沉淀。
将4M的硫脲溶液、3M的尿素溶液和5%的β–巯基乙醇溶液加入超纯水中搅拌均匀，制备角蛋白等电聚焦溶解液。将1.2 g角蛋白粉末加入到1000mL等电聚焦溶解液中，磁力搅拌至完全溶解，得到浓度为1.2mg/mL角蛋白等电聚焦上样溶液。
用50mL注射器把样品注入聚焦槽腔体，样品注入量为50mL。设定体系温度为15℃。平衡10min。聚焦功率设定为15W，开始聚焦，持续聚焦4.5h。当仪表显示电压及电流持续不变时，再持续聚焦30min，关闭电源，收集等电聚焦样品。将收集到的等电点为5.5-6.0的角蛋白等电聚焦溶液使用切向流超滤系统超滤。依次用截留分子量为30KD及1KD的膜包进行超滤。超滤完毕后再用截留分子量为1KD的透析袋在无氧水中进行透析，将得到的角蛋白在真空干燥箱内晾干，低温密封保存。
2）ε-聚赖氨酸与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白自组装体溶液的制备
取聚合度DP在25-30，分子量范围在3600-4300Da的ε-聚赖氨酸溶解于去离子水中，配制成浓度为0.45%的溶液。将第一步制备的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白置于去离子水中，使用0.1MNaOH的将溶液的pH值调整到8.5，持续搅拌直至角蛋白完全溶解，制备出0.45%的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液。
3）自组装纳米孔径膜的组装与制备
将相同浓度的上述步骤制备的浓度为0.45%的ε-聚赖氨酸与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液按照质量比6:1的比例混合，使用孔径0.22μm孔径的滤膜过滤去除不溶性物质以及杂质，在组装温度为35℃的条件下，注入到EYELA有机合成装置（型号：PPM-5512）的反应器中，设定转速为40rpm，低速混合3小时。使用0.1mol/L的稀盐酸将体系的pH值调节至7.0的范围，在此条件下持续组装8小时，最后加入0.25%的乙二醛固定液对胶组装体结构进行持续固定10小时，将其硅片上自然晾干，制备出自组装纳米孔径膜。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1. 一种蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）高甘氨酸/酪氨酸角蛋白的制备
a. 将硫脲溶液、尿素溶液和β–巯基乙醇溶液加入到超纯水中搅拌均匀，制备等电聚焦溶解液；将角蛋白粉末加入到等电聚焦溶解液中，搅拌均匀得到角蛋白等电聚焦上样溶液；
b. 将角蛋白等电聚焦上样溶液利用等电聚焦法制备得到等电点在5.5-6.0的角蛋白等电聚焦溶液，角蛋白等电聚焦溶液利用切向流超滤系统超滤，超滤后利用透析袋在无氧水中透析，真空烘干得到高甘氨酸/酪氨酸角蛋白；
（2）ε-聚赖氨酸溶液与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液的制备
将ε-聚赖氨酸溶于去离子水中，配制成浓度为0.25-0.5%的ε-聚赖氨酸溶液；
将高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶于去离子水中，利用NaOH将溶液的pH值调整到6.0-9.0之间，持续搅拌直至高甘氨酸/酪氨酸角蛋白完全溶解，制备出浓度为0.25-0.5%的高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液；
（3）自组装纳米孔径膜的组装与制备
将步骤（2）得到的ε-聚赖氨酸溶液与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液混合均匀，利用滤膜过滤后注入到反应器中，搅拌混合2-4h，调整pH值至6.0-9.0，组装6-12h，最后加入乙二醛固定液固定8-12h，晾干后得到自组装纳米孔径膜。
2.根据权利要求1所述的蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，其特征在于，所述步骤a中角蛋白粉末的制备方法如下：将动物毛发与硫化钠加入到密闭的玻璃容器中，加入蒸馏水，在室温下避光放置7-10d，过滤得到角蛋白溶液；将角蛋白溶液pH值调整为1.0-4.0，使角蛋白迅速沉淀，继续沉淀1-3h，弃去上层液体，在室温下离心，收集下层的角蛋白沉淀，烘干得到角蛋白粉末。
3.根据权利要求2所述的蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，其特征在于：所述动物毛发、硫化钠和蒸馏水的质量比为1:0.75：（20-30），离心转速为4000-6000转/min。
4.根据权利要求1所述的蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，其特征在于：所述步骤a中硫脲溶液、尿素溶液和β–巯基乙醇溶液的浓度分别为4M，3M和5%，硫脲溶液、尿素溶液、β–巯基乙醇溶液的质量比为（1-2）：（1-2）:1，角蛋白等电聚焦上样溶液的浓度为1mg/mL。
5.根据权利要求1所述的蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，其特征在于：所述步骤b中将收集到的等电点在5.5-6.0的角蛋白等电聚焦溶液依次用截留分子量为30KD及1KD的膜包进行超滤，超滤完毕后利用截留分子量为1KD的透析袋在无氧水中进行透析。
6.根据权利要求1所述的蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中ε-聚赖氨酸的聚合度DP在25-30，分子量范围在3600-4300Da。
7.根据权利要求1所述的蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中ε-聚赖氨酸溶液与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液的浓度相同，ε-聚赖氨酸溶液与高甘氨酸/酪氨酸角蛋白溶液的质量比为（2-8）：1，滤膜的孔径为0.22μm。
8.根据权利要求1所述的蛋白自组装纳米孔径膜的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中反应器的温度为25-40℃，转速为30-50rpm，乙二醛固定液的浓度为0.1-0.3%。
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