CN107603241A - 一种梭形纳米胶束的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种梭形纳米胶束的制备方法，解决的技术问题是目前没有利用不同蛋白质来组装各种形貌及不同性质的自组装体。本发明括以下步骤：①制备丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液：将丝胶蛋白加入去离子水中，制备质量浓度为0.5‑1.5%的丝胶蛋白溶液；同时使用去离子水配制浓度为0.5‑1.5%的酸法明胶蛋白溶液；②将步骤①制备的丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液混合制得混合溶液，并将混合溶液的pH值调节至两种蛋白的等电点之间；③组装梭形纳米复合胶束：将步骤②制得的混合溶液搅拌均匀后在恒温下进行组装，组装时间12‑18小时得到梭形纳米复合胶束。该复合胶束呈现良好的电化学稳定性、稀释稳定性及存储稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及聚合物纳米材料领域，具体涉及一种使用丝胶蛋白及酸法明胶制备一种梭形纳米胶束的制备方法。
背景技术
聚合物自组装是指大分子在氢键及静电相互作用、疏水相互作用及范德华力等弱相互作用力推动下，自发形成热力学稳定的有序分子结构的过程。近年来自组装技术已经在科学领域引起了广泛重视，具有良好的应用前景。相关的研究对于设计结构高度有序、功能可控的高分子聚集体和新材料具有重要意义。
聚合物纳米材料的制备方法主要有共价键胶束组装、非均相聚合法、模板法、非共价键胶束自组装及微相分离-化学处理法这五种制备方法。本发明属于嵌段聚合物非共价键自组装范围，即利用导致分子缔合的静电相互作用、氢键作用、疏水相互作用及范德华力作用制备具有一定形貌的聚合物组装体，利用此种方法可以制备纳米球、纳米管、囊泡、棒状等纳米组装体，其中通过控制嵌段共聚物组成、链段比例、浓度、温度、pH值等因素可以对组装体的形貌进行控制。
目前人们可以利用PS-b-PAA、苯乙烯和马来酸酐、聚苯乙烯与4-乙烯基吡啶等合成有机物组装不同形貌的自组装体及纳米材料。蛋白质属于高分子聚合物材料，也属于嵌段共聚物，其具有一定结构的蛋白质可以在溶液中自发组装成一定形貌的组装体，而蛋白质之间的组装至今无人研究，其组装过程不仅受到蛋白质本身链段差异的影响，还受到蛋白质二三级及高级结构的影响，因此其组装规律非常复杂，目前未见到任何利用不同蛋白质来组装各种形貌及不同性质的自组装体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是目前没有利用不同蛋白质来组装各种形貌及不同性质的自组装体，提供使用一定分子量大小的丝胶蛋白与酸法明胶通过静电作用、氢键作用、疏水相互作用及范德华力通过自组装制备出梭形的纳米复合胶束的一种梭形纳米胶束的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：一种梭形纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：①制备丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液：将丝胶蛋白加入去离子水中，制备质量浓度为0.5-1.5%的丝胶蛋白溶液；同时使用去离子水配制浓度为0.5-1.5%的酸法明胶蛋白溶液；②将步骤①制备的丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液混合制得混合溶液，并将混合溶液的pH值调节至两种蛋白的等电点之间；③组装梭形纳米复合胶束：将步骤②制得的混合溶液搅拌均匀后在恒温下进行组装，组装时间12-18小时得到梭形纳米复合胶束。酸法明胶蛋白溶液是从动物的胶原质中，通过部分酸法水解提纯而获得的胶原蛋白的水溶液。
还包括步骤④梭形纳米复合胶束后的固定：将步骤③制得的梭形纳米复合胶束在30-40℃下静置4小时，加入质量浓度为0.2%的乙二醛溶液对复合胶束进行结构固定：加入的乙二醛溶液为丝胶蛋白和酸法明胶蛋白总质量的5%，加入乙二醛溶液后搅拌均匀，在25℃条件下固定12-18小时，制备出固定好的梭形纳米复合胶束。
步骤②所述的丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液混合的质量比为2:1-1:2。
步骤②所述的丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液按照质量比2:1-1:2混合，调节的混合溶液的pH为6.5。
步骤③所述混合溶液在恒温下进行组装时的组装温度为30-40℃。
所述的丝胶蛋白采用碳酸钠溶液制备：称取蚕茧，在温度90℃-100℃，pH在12-13，碳酸钠的质量浓度为5g/L-8g/L，浴比50：1，反应时间1-3小时的条件下对蚕丝进行脱胶，使用去离子水配制脱胶所使用的碳酸钠溶液。
丝胶蛋白提纯方法为：将采用碳酸钠溶液制备的丝胶蛋白溶液依次使用粗纱布、定性滤纸进行过滤；接着使用截留分子量为500Da的透析袋进行透析；将得到的丝胶蛋白溶液在转速为12000转/min的高速离心机中离心，得到重均分子量大小为1230-2122Da的丝胶蛋白。
本发明制备的纳米胶束呈现出梭形，其独特的组装机理及原理为：丝胶蛋白和明胶蛋白这两种蛋白属于天然蛋白质，其是两亲性嵌段共聚物，但不是典型的富有明显规律性的嵌段共聚物，其在溶液中发生组装时受到的影响因素较多。胶束聚集体形态控制主要由核壳的界面张力、核链的伸展及壳的排斥作用这三种力对分子聚集自由能的平衡作用而实现其独特的形貌及性能。嵌段共聚物的链段组成及比例、聚合物的分子量、溶剂的类型、浓度、溶液的pH值、溶液的离子强度及类型、温度都会通过这三种力对胶束的形态产生影响，从而影响其形态和尺寸。本发明所制备的梭形胶束可应用于光、电、磁、生物传感器、生物医用材料、药物缓释材料等领域；经检测，梭形纳米胶束呈现良好的电化学稳定性、稀释稳定性及存储稳定性。
附图说明
图1是本发明丝胶蛋白与酸法明胶通过自组装所制备的纳米胶束的扫描电镜图；
图2是本发明丝胶蛋白与酸法明胶通过自组装所制备的纳米胶束的透射电镜图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种梭形纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
1. 使用碳酸钠溶液制备丝胶蛋白：称取一定量的蚕茧，在温度95℃，pH13，碳酸钠的质量浓度大约在8g/L，浴比50：1，反应时间2小时的条件下对蚕丝进行脱胶，使用去离子水配制碳酸钠脱胶溶液。
2. 丝胶蛋白的提纯：将上述步骤制备的丝胶蛋白溶液依次使用粗纱布、定性滤纸进行过滤，以除去不溶性的杂质及没有溶解的蛋白；接着使用截留分子量为500Da的透析袋进行透析，以除去分子量过小的丝胶蛋白链段及溶液中过多的Ca2+、Na+、CO3 2+离子及其它杂离子；将得到的丝胶蛋白溶液在转速为12000转/min的高速离心机中离心，得到丝胶蛋白。
3. 使用将提纯得到的丝胶蛋白及酸法明胶蛋白用0.1M的NaNO3缓冲液配成5％的溶液，在凝胶渗透色谱仪上进行测定，以0.1M的NaNO3缓冲液为流动相，以葡聚糖为标准样。测得所制备的丝胶蛋白的重均分子量为1557Da，酸法明胶的重均分子量为18500。
4. 梭形纳米复合胶束的制备：将制备的丝胶蛋白加入去离子水中，制备质量浓度为1.5%的丝胶蛋白溶液，同时使用去离子水配制浓度也为1.5%的酸法明胶蛋白溶液，将这两种质量浓度都为1.5%的丝胶蛋白及酸法明胶溶液按照质量比1:1混合，将混合溶液的pH值调节至两种蛋白的等电点之间，即pH值为6.5。将此混合溶液搅拌后在40℃的恒温下进行组装，组装时间18小时。
5. 梭形纳米复合胶束的固定：将组装好的复合胶束在25℃下静置4小时，加入0.2%的乙二醛溶液对复合胶束进行结构固定，加入量为蛋白质量的5%的乙二醛，加入乙二醛溶液后搅拌均匀，在25℃条件下固定18小时，制备出固定好的梭形纳米复合胶束。
实施例2：
一种梭形纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
1. 使用碳酸钠溶液制备丝胶蛋白：称取一定量的蚕茧，在温度90℃，pH12，碳酸钠的质量浓度在5g/L，浴比50：1，反应时间3小时的条件下对蚕丝进行脱胶，使用去离子水配制碳酸钠脱胶溶液。
2. 丝胶蛋白的提纯：将上述步骤制备的丝胶蛋白溶液依次使用粗纱布、定性滤纸进行过滤，以除去不溶性的杂质及没有溶解的蛋白；接着使用截留分子量为500Da的透析袋进行透析，以除去分子量过小的丝胶蛋白链段及溶液中过多的Ca2+、Na+、CO3 2+离子及其它杂离子；将得到的丝胶蛋白溶液在转速为12000转/min的高速离心机中离心，得到重均分子量大小为2122Da的丝胶蛋白，丝胶蛋白重均分子量的测量方法同实施例1。
3. 梭形纳米复合胶束的制备：将制备的丝胶蛋白加入去离子水中，制备质量浓度为1.0%的丝胶蛋白溶液，同时使用去离子水配制浓度也为1.0%的酸法明胶蛋白（与实施例1所用明胶相同）溶液，将这两种质量浓度都为1.0%的丝胶蛋白及酸法明胶溶液按照质量比1:2混合，将混合溶液的pH值调节至两种蛋白的等电点之间，即pH值为6.5。将此混合溶液搅拌后在35℃的恒温下进行组装，组装时间16小时。
4. 梭形纳米复合胶束的固定：将组装好的复合胶束在25℃下静置4小时，加入0.2%的乙二醛溶液对复合胶束进行结构固定，加入量为蛋白质量的5%的乙二醛，加入乙二醛溶液后搅拌均匀，在25℃条件下固定16小时，制备出固定好的梭形纳米复合胶束。
实施例3：
一种梭形纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
1. 使用碳酸钠溶液制备丝胶蛋白：称取一定量的蚕茧，在温度90℃，pH12.5，碳酸钠的质量浓度在6g/L，浴比50：1，反应时间3小时的条件下对蚕丝进行脱胶，使用去离子水配制碳酸钠脱胶溶液。
2. 丝胶蛋白的提纯：将上述步骤制备的丝胶蛋白溶液依次使用粗纱布、定性滤纸进行过滤，以除去不溶性的杂质及没有溶解的蛋白；接着使用截留分子量为500Da的透析袋进行透析，以除去分子量过小的丝胶蛋白链段及溶液中过多的Ca2+、Na+、CO32+离子及其它杂离子；将得到的丝胶蛋白溶液在转速为12000转/min的高速离心机中离心，得到分子量大小为1955Da的丝胶蛋白，丝胶蛋白重均分子量的测量方法同实施例1。
3. 梭形纳米复合胶束的制备：将制备的丝胶蛋白加入去离子水中，制备质量浓度为0.5%的丝胶蛋白溶液，同时使用去离子水配制浓度也为0.5%的酸法明胶蛋白（与实施例1所用明胶相同）溶液，将这两种质量浓度都为0.5%的丝胶蛋白及酸法明胶溶液按照质量比2:1混合，将混合溶液的pH值调节至两种蛋白的等电点之间，即pH值为6.5。将此混合溶液搅拌后在30℃的恒温下进行组装，组装时间12小时。
4. 梭形纳米复合胶束的固定：将组装好的复合胶束在25℃下静置4小时，加入0.2%的乙二醛溶液对复合胶束进行结构固定，加入量为蛋白质量的5%的乙二醛，加入乙二醛溶液后搅拌均匀，在25℃条件下固定16小时，制备出固定好的梭形纳米复合胶束。
实施例4：
一种梭形纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
1、制备丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液：将丝胶蛋白加入去离子水中，制备质量浓度为1%的丝胶蛋白溶液；同时使用去离子水配制浓度为1%的酸法明胶蛋白溶液。丝胶蛋白采用碳酸钠溶液制备：称取蚕茧，在温度90℃℃，pH在12-13，碳酸钠的质量浓度为5g/L，浴比50：1，反应时间1小时的条件下对蚕丝进行脱胶，使用去离子水配制脱胶所使用的碳酸钠溶液。丝胶蛋白提纯方法为：将采用碳酸钠溶液制备的丝胶蛋白溶液依次使用粗纱布、定性滤纸进行过滤；接着使用截留分子量为500Da的透析袋进行透析；将得到的丝胶蛋白溶液在转速为12000转/min的高速离心机中离心，得到重均分子量大小在1230Da的丝胶蛋白。
2、步骤①制备的丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液按质量比为2:1混合制得混合溶液，并将混合溶液的pH值调节至两种蛋白的等电点之间为6.5。
3、组装梭形纳米复合胶束：将步骤②制得的混合溶液搅拌均匀后在温度为30-40℃下进行组装，组装时间12小时得到梭形纳米复合胶束。
4、梭形纳米复合胶束后的固定：将步骤③制得的梭形纳米复合胶束在25℃下静置4小时，加入质量浓度为0.2%的乙二醛溶液对复合胶束进行结构固定：加入的乙二醛溶液为丝胶蛋白和酸法明胶蛋白总质量的5%，加入乙二醛溶液后搅拌均匀，固定12小时，制备出固定好的梭形纳米复合胶束。
实施例5：
一种梭形纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
1、制备丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液：将丝胶蛋白加入去离子水中，制备质量浓度为1.5%的丝胶蛋白溶液；同时使用去离子水配制浓度为1.5%的酸法明胶蛋白溶液。丝胶蛋白采用碳酸钠溶液制备：称取蚕茧，在温度100℃，pH在12-13，碳酸钠的质量浓度为5g/L，浴比50：1，反应时间3小时的条件下对蚕丝进行脱胶，使用去离子水配制脱胶所使用的碳酸钠溶液。丝胶蛋白提纯方法为：将采用碳酸钠溶液制备的丝胶蛋白溶液依次使用粗纱布、定性滤纸进行过滤；接着使用截留分子量为500Da的透析袋进行透析；将得到的丝胶蛋白溶液在转速为12000转/min的高速离心机中离心，得到分子量大小在2000Da的丝胶蛋白。
2、步骤①制备的丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液按质量比为1:2混合制得混合溶液，并将混合溶液的pH值调节至两种蛋白的等电点之间为6.5。
3、组装梭形纳米复合胶束：将步骤②制得的混合溶液搅拌均匀后在温度为30-40℃下进行组装，组装时间18小时得到梭形纳米复合胶束。
4、梭形纳米复合胶束后的固定：将步骤③制得的梭形纳米复合胶束在25℃下静置4小时，加入质量浓度为0.2%的乙二醛溶液对复合胶束进行结构固定：加入的乙二醛溶液为丝胶蛋白和酸法明胶蛋白总质量的5%，加入乙二醛溶液后搅拌均匀，固定18小时，制备出固定好的梭形纳米复合胶束。
实施例6：
一种梭形纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：
1、制备丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液：将丝胶蛋白加入去离子水中，制备质量浓度为0.5%的丝胶蛋白溶液；同时使用去离子水配制浓度为0.5 %的酸法明胶蛋白溶液。丝胶蛋白采用碳酸钠溶液制备：称取蚕茧，在温度95℃，pH在12-13，碳酸钠的质量浓度为6g/L，浴比50：1，反应时间2小时的条件下对蚕丝进行脱胶，使用去离子水配制脱胶所使用的碳酸钠溶液。丝胶蛋白提纯方法为：将采用碳酸钠溶液制备的丝胶蛋白溶液依次使用粗纱布、定性滤纸进行过滤；接着使用截留分子量为500Da的透析袋进行透析；将得到的丝胶蛋白溶液在转速为12000转/min的高速离心机中离心，得到分子量大小在1800Da的丝胶蛋白。
2、步骤①制备的丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液按质量比为1:1混合制得混合溶液，并将混合溶液的pH值调节至两种蛋白的等电点之间为6.5。
3、组装梭形纳米复合胶束：将步骤②制得的混合溶液搅拌均匀后在温度为30-40℃下进行组装，组装时间15小时得到梭形纳米复合胶束。
4、梭形纳米复合胶束后的固定：将步骤③制得的梭形纳米复合胶束在25℃下静置4小时，加入质量浓度为0.2%的乙二醛溶液对复合胶束进行结构固定：加入的乙二醛溶液为丝胶蛋白和酸法明胶蛋白总质量的5%，加入乙二醛溶液后搅拌均匀，固定15小时，制备出固定好的梭形纳米复合胶束。
对实施例1-6制备出的梭形纳米复合胶束后对其形态及性能进行检测，以实施例1所得梭形纳米复合胶束为例：
1. 复合胶束的形貌观测：使用日立S-4800场发射扫描电子显微镜及美国FEI透射电子显微镜（FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN）对该纳米复合胶束的形貌进行观测，发现其呈现特定的梭形，如图1和图2所示。
2. 梭形纳米胶束的电化学稳定性检测（ZETA-电位）：使用英国马尔文公司Zetasizer Nano ZS90激光粒度仪对复合胶束进行的ZETA-电位进行检测。检测梭形纳米胶束在不同pH值、不同温度下的ZETA-电位值，ZETA-电位绝对值越大代表所形成的胶束越稳定。所测值见表1、2。
表1.梭形复合胶束在不同温度下的ZETA-电位值
表2.梭形复合胶束在不同pH条件下的ZETA-电位值
3. 梭形纳米胶束的稀释稳定性检测：使用英国马尔文公司Zetasizer Nano ZS90激光粒度仪在25℃下对复合胶束进行的平均粒径及多分散系数值进行检测。将载药胶束使用与样品pH值相同的蒸馏水进行稀释，初始浓度为1.5mg/mL，稀释至1倍，10倍，50倍，200倍，500倍。用马尔文激光粒度仪测定不同稀释倍数下复合胶束的粒度大小及分布情况。所测值见表3。
表3.梭形复合胶束在不同稀释倍数下的粒径及PDI值
4. 梭形纳米胶束的存储稳定性检测：使用英国马尔文公司Zetasizer Nano ZS90激光粒度仪在25℃下对复合胶束在存储1天、10天、20天、30天、40天后的平均粒径及多分散系数值进行检测。检测样品的浓度为1.5mg/mL，所测值见表4。
表4.梭形复合胶束在一定存储时间内的的粒径及PDI值
。
Claims (7)
1.一种梭形纳米胶束的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：①制备丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液：将丝胶蛋白加入去离子水中，制备质量浓度为0.5-1.5%的丝胶蛋白溶液；同时使用去离子水配制浓度为0.5-1.5%的酸法明胶蛋白溶液；②将步骤①制备的丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液混合制得混合溶液，并将混合溶液的pH值调节至两种蛋白的等电点之间；③组装梭形纳米复合胶束：将步骤②制得的混合溶液搅拌均匀后在恒温下进行组装，组装时间12-18小时得到梭形纳米复合胶束。
2.根据权利要求1所述的梭形纳米胶束的制备方法，其特征在于：还包括步骤④梭形纳米复合胶束后的固定：将步骤③制得的梭形纳米复合胶束在25℃下静置4小时，加入质量浓度为0.2%的乙二醛溶液对复合胶束进行结构固定：加入的乙二醛溶液为丝胶蛋白和酸法明胶蛋白总质量的5%，加入乙二醛溶液后搅拌均匀，固定12-18小时，制备出固定好的梭形纳米复合胶束。
3.根据权利要求1所述的梭形纳米胶束的制备方法，其特征在于：步骤②所述的丝胶蛋白溶液和酸法明胶蛋白溶液混合的质量比为2:1-1:2。
4.根据权利要求1所述的梭形纳米胶束的制备方法，其特征在于：步骤②所述混合溶液的pH值调节为6.5。
5.根据权利要求1所述的梭形纳米胶束的制备方法，其特征在于：步骤③所述混合溶液在恒温下进行组装时的组装温度为30-40℃。
6.根据权利要求1所述的梭形纳米胶束的制备方法，其特征在于：所述的丝胶蛋白采用碳酸钠溶液制备：称取蚕茧，在温度90℃-100℃，pH在12-13，碳酸钠的质量浓度为5g/L-8g/L，浴比50：1，反应时间1-3小时的条件下对蚕丝进行脱胶，使用去离子水配制脱胶所使用的碳酸钠溶液。
7.根据权利要求6所述的梭形纳米胶束的制备方法，其特征在于：丝胶蛋白提纯方法为：将采用碳酸钠溶液制备的丝胶蛋白溶液依次使用粗纱布、定性滤纸进行过滤；接着使用截留分子量为500Da的透析袋进行透析；将得到的丝胶蛋白溶液在转速为12000转/min的高速离心机中离心，得到重均分子量大小在1230-2122Da的丝胶蛋白。
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