JPH08332087A - ケラチン蛋白質を担体とする固定化生理活性物質およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 繊維集合体の表面にケラチン蛋白質の薄膜が
形成されており、該薄膜中には、生理活性物質、例えば
酵素が包括されている、ケラチン蛋白質を担体とする固
定化生理活性物質。 【効果】 固定化生理活性物質の活性が低下せず、基質
水溶液、血清、全血等に対する濡れ状態が良好である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バイオセンサー、バイ
オリアクター等に利用できる、酵素等の生理活性物質を
固定化した固定化生理活性物質に関する。詳細には、繊
維集合体を構成する繊維表面にケラチン蛋白質の薄膜が
形成されており、該薄膜に生理活性物質が包括されてい
る固定化生理活性物質に関する。

【０００２】

【従来の技術及び問題点】バイオセンサーは２１世紀の
バイオテクノロジーを支える重要な技術として関心が寄
せられている。特定の化学物質に対して特異的に作用す
る酵素を高分子のゲルの膜に固定し、それを酸素電極や
過酸化水素電極等の下地電極の表面に被覆して基質を含
む溶液を点着すると低分子の基質が酵素固定化担体に拡
散し、酵素固定化担体に包括されている酵素と化学的に
反応し、電極からの化学反応量に見会った出力電流値の
変化が起こる。これがバイオセンサーの構築原理であ
る。バイオセンサーは醗酵食品工業、臨床検査での化学
分析、工業プロセス、環境計測、食品、医療、薬学等の
分野で幅広く利用されている。

【０００３】生体触媒である酵素を固定するための担体
として、生体高分子の蛋白質が利用できる。昆虫に由来
する生体高分子の絹フィブロイン繊維を塩化カルシウ
ム、炭酸カルシウム、臭化リチウム、チオシアン酸リチ
ウムなどの濃厚な中性塩水溶液に溶解した後、無機物や
カルシウム、塩素、リチウム等のイオンを透析により除
去して得られる再生絹フィブロインを担体として酵素を
物理的に包括固定しようとする発明が特開昭６１−１８
７７９０号公報に開示されている。絹フィブロインのゲ
ル層を親水性繊維集合体の構成表面に被覆させ、該ゲル
層に生理活性物質が包括される固定化生理活性物質及び
その製造方法が開示されている(特開平２−２４５１８
９号公報）。この発明によると固定化用担体に再生絹フ
ィブロインを用いており、親水性の繊維集合体を生理活
性物質を含む絹フィブロイン水溶液に浸漬してから、取
り出して乾燥させた後、固定化担体を不溶化処理するた
め、未不溶化処理絹フィブロインで被覆した繊維集合体
を例えば８０％のアルコールに３０秒浸漬する工程を経
る必要があった。また該公報で用いられる繊維材料は親
水性繊維に限定されおり、疎水性繊維素材は繊維集合体
の対象ではなかった。このように繊維集合体の素材が親
水性に限定されること、浸漬処理、不溶化処理、乾燥処
理の３つの工程を繰り返す必要があるため固定化生理活
性物質を調製するための工程が繁雑であり、また有機溶
媒を用いた不溶化処理の際に固定化せいろ物質の活性が
低下する等の問題点があった。固定化担体にケラチンを
用いた固定化酵素が特開昭５２−５７３９１号に開示さ
れている。この固定化酵素は羽毛をチオグリコール酸ナ
トリウムで溶解、透析して調製したケラチン水溶液に酵
素（アシッドホスファターゼ）を添加した後、アクリル
板上で製膜して得られる。この膜は水溶解性であるの
で、ホルムアルデヒド水溶液中にケラチン膜を浸漬して
分子間架橋結合を形成させることで水不溶化している。
この方法では平板上で製膜するので膜の表面積は限定さ
れる。従って被検液などの基質を含む液と酵素との接触
が十分に行われず酵素反応の速度を早くすることができ
ない。また製膜後のホルムアルデヒド等による架橋水不
溶化処理により酵素活性が低下する（比較例５参照）と
いう問題もある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は活性の高い固
定化生理活性物質を提供することを目的とする。本発明
はまた該固定化生理活性物質を簡易な方法で製造する方
法を提供することをも目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、本発明者がケ
ラチン蛋白質の化学構造、溶解特性、理化学特性を解明
しつつ、非衣料分野における新たな利用開発を展開する
一環として、バイオセンサー用の固定化用担体の選択、
生理活性物質の固定化方法、羊毛の溶解方法、被検物質
の検出精度等について鋭意研究を重ね、羊毛に代表され
るケラチン繊維を溶解してなるケラテイン水溶液、Ｓ−
カルボキシメチルケラテイン水溶液、ケラトース水溶液
等を生理活性物質の固定化用担体の原料として用いるこ
とにより生理活性物質の包括性、低濃度領域の被検物質
の検知特性に優れた固定化生理活性物質を調製できるこ
とを見出し、この発明を完成させたのである。

【０００６】すなわち本発明は、繊維集合体の構成繊維
表面に、ケラチン蛋白質の薄膜が形成されており、該薄
膜に生理活性物質が包括されていることを特徴とする、
ケラチン蛋白質を担体とする固定化生理活性物質を要旨
とする。

【０００７】本発明において生理活性物質には、酵素、
菌体、オルガネラ、細胞、組織を含む。本発明で用いる
ことのできる繊維集合体は、有機または無機の、合成ま
たは天然の繊維よりなる繊維集合体である。連続繊維で
平面上に敷きつめた繊維集合体であってもよく、また、
織物、編物、不織布等の形の繊維集合体であってもよ
い。素材としてはナイロン、テトロン、アクリロニトリ
ルなどの合成素材でもよいし、セルロース系の天然素
材、羊毛、絹繊維などの蛋白繊維であっても同様に利用
できる。あるいは、合成繊維や天然繊維集合体であって
もよく、素材としては、ポリプロピレン、ポリエチレン
テレフタレート、ポリアミド、ポリオレフィン素材が例
示できる。さらに、ポリアミド／ポリオレフィン、ポリ
エステル／ナイロン等のように複数の混合素材から成る
繊維集合体であってもよい。繊維集合体を構成する素材
として特に優れたものは親水性天然素材のセルロース系
素材が挙げられる。レーヨン３５％とその他ポリアクリ
ルニトリルを含む高機能工業用ワイパー（サンバクト
（商品名)、旭化成工業株式会社製）が例示できる。更
に、ポリエステル素材を主要成分とする超極細繊維の繊
維集合体、トレシーミラクルクロス（商品名、東レ株式
会社製）はサンバクトと同様に利用することができる。
あるいは、微細なガラス繊維等の無機物質の繊維素材で
も利用できる点が特徴である。基質と生理活性物質との
反応性を向上させるには、できる限り微細で有効表面積
が大きい繊維集合体が望ましい。

【０００８】本発明の固定化生理活性物質においては繊
維集合体の表面にケラチン蛋白質の薄膜を形成し、該薄
膜中に生理活性物質を包括固定化する。ここにケラチン
蛋白質には、ケラチンを還元剤で処理してそのジスルス
ルフィド結合−Ｓ−Ｓ−を切断してチオール基−ＳＨと
したケラテイン；ケラテインのチオール基の水素原子を
官能基を有する有機基によって置換したケラテイン誘導
体；およびケラチンを酸化剤で処理してジスルフィド結
合を切断して水溶化したケラトースを含む。上記官能基
を有する有機基としては、メチル基、エチル基、プロピ
ル基等のアルキル基、ベンジル基、フェニルエチル基等
のアルアルキル基、カルボキシメチル基、カルボキシル
エチル基、アミノエチル基等の置換アルキル基が例示さ
れる。これ等の基のうち親水性の官能基を有する有機基
が好ましく、カルボキシメチル基が特に好ましい。 包括に用いるケラチン蛋白質の原料としては、羊毛、ア
ルパカ、カシミア、モヘア、アンゴラなどの獣毛繊維が
例示できる。羊毛が好ましく、羊毛であれば、日本コー
デル種であっても、オーストラリア系のメリノ、ボルウ
ォース、コリデール種であってもよい。また、角、ひず
め、毛髪、羽毛などのケラチン蛋白質であっても同様に
利用できる。ケラチン蛋白質には、塩基性アミノ酸、酸
性アミノ酸など極性基に富み親水性のアミノ酸残基が多
く含まれている。極性の強いアミノ酸からなる蛋白質は
吸水性や保水性が優れており、さらに生体触媒や生体細
胞との親和性が良好である。そのため、本発明のケラチ
ン蛋白質を酵素の固定化担体に用いると生理活性物質の
包括性が向上する特徴がある。ケラチン蛋白質のアミノ
酸分析によると５.４モル％のシスチン(Ｃys)を含み、
リジン(Ｌys)、アルギニン(Ａrg)、ヒスチジン(Ｈis)な
どの塩基性アミノ酸残基を１０モル％以上も含み、アス
パラギン酸(Ａsp)、グルタミン酸(Ｇlu)などの酸性アミ
ノ酸を１８モル％含む。これに対して、家蚕絹フィブロ
インでは、Ｃysは０、Ｌys、Ａrg、Ｈis等の合計含量は
０.７６モル％、Ａsp、Ｇluの合計含量は２.４９モル％
であり、ケラチン蛋白質のアミノ酸組成とは著しく異な
っている。

【０００９】次に、本発明の固定化生理活性物質の製造
方法について説明する。先ず、ケラチンの水溶液を調製
する方法について説明する。上述のようにケラチン蛋白
質にはＣysが５.４mol％含まれるが絹フィブロインには
全く含まれない。アミノ酸残基であるＣysはケラチンの
分子間で架橋結合を形成している。Ｃysによる分子間架
橋結合は、絹フィブロイン分子には見られない特徴であ
る。羊毛等の獣毛繊維にはシスチンによる分子間架橋結
合があるので、絹フィブロインの場合とは違って中性塩
溶液ではケラチン繊維は溶解しない。ケラチン繊維を溶
解するには、まず分子間のＣys結合を窒素雰囲気下、メ
ルカプトエタノールあるいはチオグリコール酸等の還元
剤を用いて切断してケラチン分子を還元して可溶化とす
る必要がある。メルカプトエタノールを用いる場合には
尿素溶液中で還元処理を行うと良い。尿素の濃度は７.
５〜８.８Ｍが、好ましくは７.８〜８Ｍが最適である。
チオグリコール酸を用いる場合には、１〜４％のＮaＣl
を添加すると良い。例えば還元剤としてメルカプトエタ
ノールを用いる場合、ケラチン繊維を上記濃度の尿素水
溶液に浸漬し、脱気後、窒素雰囲気下、４５℃以下、望
ましくは２０〜２５℃の温度でメルカプトエタノールを
１０ｇの羊毛に対し３〜５ｍl加え、２〜３時間撹拌す
る。その後ｐＨを約１０.５に調整し、さらに約３時間
撹拌する。こうしてケラチン分子が還元されて、分子間
の−Ｓ−Ｓ−結合が切断されＳＨとなったケラテインが
得られる。純水を用いて透析し、尿素、過剰のメルカプ
トエタノールを除去するとケラテイン水溶液が得られ
る。

【００１０】このようにして還元された、ＳＨ基を有す
るケラテインをさらにアルキル化剤、例えば(置換)アル
キルハライドと反応させてＳ−(置換)アルキルケラテイ
ンとしても利用することができる。アルキル化は公知の
方法に従って行えばよい。一例としてアルキル化剤とし
てヨード酢酸を用いた場合について説明する。上記の還
元ケラテインに、窒素雰囲気下２０〜２５℃の温度で、
撹拌しながら１０ｇの羊毛に対して１０〜１７ｇのヨー
ド酢酸（分子量１８５.９５）を加え反応させる。１〜
２時間後、ｐＨを８.５に調整し、純水に対して透析す
ることによって過剰のヨード酢酸を除いて、Ｓ−カルボ
キシメチルケラテイン水溶液を得る。

【００１１】ケラチン繊維を酸化剤で処理して得られる
ケラトースを用いることもできる。この反応は以下のよ
うにして行う。まず、９.５ｍlの蟻酸(HCOOH)を３０％
過酸化水素水溶液（市販品、Ｈ₂Ｏ₂）０.５ｍlと混合し
た後、２５℃、２時間静置させ、−１０℃に冷却し、こ
れをＡ液とする。次に５ｍlの蟻酸と１ｍlのメタノール
を混合して−１０℃に冷却し、これをＢ液とする。Ａ液
とＢ液とを混合し、−１０℃に保持し、この混合溶液中
で約２００ｍgの羊毛を４時間処理することにより羊毛
を完全に溶解させる。得られた溶液をセルロース透析膜
を用い、純水で透析した後、０℃の水で３５０ｍlに希
釈してから凍結乾燥すると水溶性でかつ粉末状のケラト
ースが調製できる。一定量の粉末ケラトースを蒸留水に
溶解することにより簡単にケラトース水溶液が調製でき
る。（以下においてはケラテイン水溶液、Ｓ−アルキル
化ケラテイン水溶液およびケラトース水溶液を単にケラ
チン水溶液或いはケラチン蛋白質水溶液と呼ぶことがあ
る）。ケラチン水溶液の濃度は、乾燥重量法による測定
で３％以下の希薄溶液が望ましい。最も好ましくは０.
３〜０.８％のケラチン蛋白質水溶液である。

【００１２】該ケラチン蛋白質水溶液に、重量濃度で１
〜４０％、好ましくは５〜２０％の生理活性物質を添加
して２５℃で静かに攪拌して溶解し２時間程静置して、
生理活性物質を含むケラチン水溶液を得る。

【００１３】ケラチン蛋白質を固定化用担体にして、例
えば生理活性物質としてコレステロールオキシダーゼ、
コレステロールエステラーゼを固定化して、コレステロ
ールを測定するための、効率が良く、精度の良いバイオ
センサーを構築するには、被検溶液が反応する際に生成
する水不溶性のコレステロールを水に良好に分散させる
ことが決め手となる。そのためには界面活性剤を、生理
活性物質を含んだケラチン蛋白質水溶液に添加しておく
と、出力を向上させることができ、測定実験の測定値の
ばらつきを減少させることができる。界面活性剤として
は、トリトン（Triton）Ｘ−１００（商品名、和光純
薬）、トゥイーン（Tween）−８０、あるいはクレモホ
ール（Cremophor）(商品名、アルドリッチ）が例示でき
る。界面活性剤の添加量としては、重量濃度で０.００
１〜０.１％が好ましく、特に好ましい濃度は０.００１
〜０.０１％である。

【００１４】次に上記の生理活性物質を含むケラチン水
溶液を繊維集合体に、含浸、塗布、滴下等の適当な方法
で適用する。例えば、微量用の安全ピペッターでその
０.８μlを、ポリエチレン膜上に置いた所定の大きさの
繊維集合体に滴下して室温で１０分間放置する。次に、
繊維集合体を３０〜６０℃、特に望ましくは４５〜５０
℃で６０分軽く乾燥するとよい。測定データーのバラツ
キを減少させて、繊維集合体にできるだけ多くの生理活
性物質を固定化するには、生理活性物質濃度の高いケラ
テイン水溶液を繊維集合体に１度に滴下するかわりに、
上記のように一旦軽く乾燥した繊維集合体に更に生理活
性物質溶液を滴下することを繰り返す方法が望ましい。
生理活性物質の包括状態は、生理活性物質濃度、ケラチ
ン水溶液濃度、繊維集合体へのケラチン水溶液の滴下量
などにより変化させることができ、濃度,滴下量等の組
み合わせにより、生理活性物質の浸透速度を制御させる
ことができる。 このようにして、ケラテチン担体中に生理活性物質を含
む薄膜が繊維集合体表面に形成される。本発明において
薄膜について、アルデヒドなどの試薬を用いた化学反応
で水不溶化処理を一切行う必要がないため固定化生理活
性物質の活性は実質的には低下しない。

【００１５】本発明の固定化生理活性物質はバイオセン
サー、バイオリアクターに好適に使用できる。例えばグ
ルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、
ウリカーゼ等の生理活性物質を固定した、本発明の固定
化生理活性物質を過酸化水素電極の下地表面に被覆する
とグルコース、コレステロール、尿酸等の濃度が測定で
きる。

【００１６】

【作用】本発明の固定化生理活性物質は、親水性が良好
で生理活性物質包括性に優れたケラチン蛋白質を固定化
担体として繊維集合体の構成繊維表面に被覆されてお
り、かつ不溶化処理を施さない未変性のケラチン蛋白質
の状態でゲル層を形成している。そのため平面的な膜に
比べて大きい膜面積が得られ、また繊維集合体の構成繊
維素材が疎水性であっても、親水性を示すものであって
も同様に利用できる。例えば基質が作用した際には、測
定値にバラツキが少なくなり、高い出力応答性と、高い
活性を持つ固定化生理物質が製造できる。本発明による
固定化生理活性物質は、ケラチン蛋白質を主成分とする
担体に生理活性物質を固定化しており、かつ生理活性物
質は担体に物理的に固定化されており、化学処理による
不溶化処理を全く加えてないので、活性の低下が軽微で
ある。さらに測定対象物質が低濃度であっても検知可能
な性能を備えた固定化酵素膜を提供できる。

【００１７】

【実施例】以下、本発明を実施例によってさらに詳細に
説明する。 実施例１〜３ メリノ種羊毛(６４'Ｓ)に含まれる色素、脂肪分は、ベ
ンゼン−エタノール５０／５０／容積％の混合溶液を用
い、ソックスレー抽出器で２.５時間処理することで除
去した。三つ口フラスコの一つの口には三方コックを介
して乾燥窒素ボンベからのゴム管を接続した。反応系の
pＨ調節のためpＨ電極は別の口に常時挿入し、もう一方
の口は必要な薬剤投入用として利用する。繊維長が約１
cmとなるように細断した８.１８gの羊毛繊維を１ｌの三
つ口フラスコに投入し、これに４５０ｍlの８Ｍ尿素溶
液を加えた。窒素ガスをパージさせ、アスピレーターで
１５分間三つ口フラスコ内を４５mmＨg程度に減圧させ
急激に大気圧に戻す操作を３〜４回繰り返した。このよ
うにすると、三つ口フラスコ内のケラチン繊維間に含ま
れる空気が完全に除去でき、尿素水溶液とケラチン分子
との反応が効率的となる。窒素置換が完了した後、三つ
口フラスコ内に還元剤として４.８mlのメルカプトエタ
ノールを加えて、８Ｍ尿素水溶液中で２〜３時間放置し
た。更に、約１００mlの５Ｎ ＫＯＨ溶液を微量づつ加
えて三つ口フラスコの混合溶液のpＨを１０.５に調節し
た。室温で３時間かけて羊毛繊維が完全に溶解するのを
待った。繊維状の羊毛繊維が溶解したものがケラテイン
水溶液である。セルロース透析膜を用いケラテイン水溶
液を純水で２日間透析した。送風乾燥させながら、ある
いは純水を加えることにより濃度の異なる３種類のケラ
テイン水溶液を調製した。

【００１８】このようにして調製した異なる濃度（０.
０７％、０.１％、０.７％）のケラテイン水溶液のそれ
ぞれに、グルコースオキシダーゼ（以下ＧＯＤと言う。
東洋紡績(株)製）を濃度が１０％となるよう溶解させて
ＧＯＤを含むケラテイン水溶液を得た。この水溶液０.
８μlを、微量用の安全ピペッターで、ポリエチレン膜
上に置いた大きさ５×３mmサイズのトレシー（商品名、
東レ(株)製）の繊維集合体に滴下して室温で１０分間放
置した。次に、繊維集合体を軽く乾燥するため５０℃で
６０分乾燥させて固定化グルコースオキシダーゼを得
た。

【００１９】実施例４〜６ 実施例１で得た濃度０.０１％のケラテイン水溶液４５
０ｍｌに、室温で９.５ｇのヨード酢酸を加えてケラテ
インのＳ−カルボキシメチル化反応を１時間行った。５
Ｎ ＫＯＨ水溶液でケラチン溶液のpＨを８.５に調節し
た。反応中三つ口フラスコに光などの刺激が入らないよ
うにアルミフォイルで遮光した。このようにしてＳ−カ
ルボキシメチルケラテイン水溶液を得た。セルロース浸
透膜を用いＳ−カルボキシメチルケラテイン水溶液を純
水で２日間透析した。送風乾燥させながら、あるいは純
水を加えることにより濃度の異なる３種類のＳ−カルボ
キシメチルケラテイン水溶液（０.０７％、０.１％、
０.７％）を調製した。以下実施例１と同様にして、繊
維集合体上のケラチン膜中にグルコースオキシダーゼが
固定された固定化グルコースオキシダーゼを得た。

【００２０】比較例１〜２ ケラテイン水溶液およびＳ−カルボキシメチルケラテイ
ン水溶液を用いず、１０％のＧＯＤを含む溶液（比較例
１）０.８μl、あるいは０.０１％の界面活性剤（トリ
トンＸ １００、商品名、和光純薬）と１０％のＧＯＤ
を含む水溶液（比較例２）０.８μlを実施例１と同様の
方法でトレシーに含浸させて固定化グルコースオキシダ
ーゼを調製した。

【００２１】比較例３〜４ 家蚕繭糸をエタノール／ベンゼン系の混合溶液を用い
て、ソックスレー抽出器で試料に含まれるワックス,色
素を除去した試料をマルセル石鹸０.２％、炭酸ナトリ
ウム０.０５％の混合溶液で９８℃で３０分処理するこ
とで繭糸の外層のセリシンを除去した。６０℃で完全に
乾燥させた後、８Ｍの臭化リチウムで５５℃で３０分処
理した。溶解した液をセルロース製の透析膜を用いて５
℃で４日間純水に対して透析した。送風乾燥して濃度
０.０７％、０.４％の再生絹フィブロイン溶液を調製し
た。以下実施例１と同様に１０％のＧＯＤを含む絹フィ
ブロイン溶液をトレシーに含浸、乾燥させて固定化グル
コースオキシダーゼを調製した。

【００２２】実施例７〜１２ 実施例１で用いた、色素,脂肪を除去したメリノ種羊毛
（６４'Ｓ）を次のようにしてチオグリコール酸で可溶
化した。三つ口フラスコへの窒素接続、pＨ電極の接続
は実施例１で述べたのと同様であった。細断した３.２g
の羊毛繊維を５００ｍl容量の三つ口フラスコに投入
し、これに１５０ｍlの３％ＮaＣl溶液を入れた。窒素
ガスをパージさせ、アスピレーターで１５分間三つ口フ
ラスコ内を４５mmＨg程度に減圧させ急激に大気圧に戻
す操作を３〜４回繰り返した。窒素ガス置換を２０分間
行った。羊毛を溶解する系に０.２Ｍチオグリコール酸
を入れ、さらにアンモニア水を加えてpＨ１０に調整
し、スタラーを用いて窒素置換環境下で３時間反応させ
て羊毛を溶解させた。窒素ガス下で濾過して、未反応羊
毛を除去することでケラテイン水溶液を調製した。ケラ
テイン水溶液をセルロース透析膜に入れ１５℃の環境下
で２日間透析処理を行った。送風乾燥して所定濃度に濃
縮してケラテイン水溶液を得た。

【００２３】また、これとは別に、送風乾燥する前の羊
毛ケラテイン水溶液にアンモニア水溶液を加えて溶液の
pＨを８に調整し、さらに窒素ガス下で０.２Ｍのヨード
酢酸を加えて１５分スタラーで攪拌した。このようにし
てケラテインをＳ−カルボキシメチル化することでＳ−
カルボキシメチルケラテイン水溶液を調製した。Ｓ−カ
ルボキシメチルケラテイン水溶液をセルロース透析膜を
用い、未反応物を除去するため１５℃の環境下で純水に
対して２日間透析処理を行った。送風乾燥して所定濃度
に濃縮して実験用のＳ−カルボキシメチルケラテイン水
溶液を得た。このようにして調製し、送風乾燥で濃度を
調製した濃度の異なる３種類のケラテイン水溶液、また
はＳ−カルボキシメチルケラテイン水溶液（それぞれ
０.０７％、０.４％、０.７％）にそれぞれ、実施例１
と同様にしてグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ、東洋紡
製）を１０％溶解させて、１０％のＧＯＤを含むケラテ
イン水溶液またはＳ−カルボキシメチルケラテイン水溶
液を得た。微量安全ピペッターでトレシーにこの水溶液
０.８μｌを滴下した後、５０℃で６０分乾燥させて固
定化グルコースオキシダーゼを調製した。

【００２４】比較例５ 実施例３と同様にＧＯＤ濃度が１０％となるように調製
した０.７％のケラテイン水溶液０.８μlを実施例３と
同様の方法でトレシーに滴下し、これを室温で１時間放
置し、さらに４０℃の恒温乾燥器で１時間乾燥した。こ
のように調製した水溶解性ケラテインの薄膜が形成され
たトレーシーを０.５％クルタルアルデヒド水溶液に２
０℃で１５分間浸漬した後、さらに室温で３時間乾燥す
ることで固定化グルコースオキシダーゼを含むケラテイ
ンの水不溶化処理を行った。

【００２５】性能評価 （１）グルコース水溶液を用いた評価 実施例１〜６および比較例１〜５で得た固定化グルコー
スオキシダーゼを過酸化水素電極の表面に装着し、その
上に、所定濃度のグルコース水溶液０.８μlを滴下させ
た時の出力特性として、過酸化水素電極からの出力電流
（μＡ），出力電流が最大となる時間（以下ピーク時間
と言う）および変動係数（ＣＶ％）を求めた。なお、測
定回数は８回で、結果を平均して表１に示す。変動係数
は次式により求めた。 ＣＶ(％)＝δ_n-1／Ｘ×１００ ただし、ｎはデータ数(８)、δ_n-1はｎ−１個の標準偏
差、Ｘは測定データの平均値である。ＣＶ値はデータの
バラツキ状態がどのようであるかを表す指標（ＣＶ値が
大きいほどバラツキ状態が大きいこと示す。）となる。
また、所定濃度のグルコース被検液を点着させたときの
グルコース溶液の浸透程度は目測により次のようにして
判定した。判定結果を表１に併せて示す。表１において
示した記号は次のことを意味する。固定化グルコースオ
キシダーゼへのグルコース水溶液の浸透性（４段階で評
価）： ＋ グルコース水溶液が少し浸透する。 ＋＋ グルコース水溶液が普通に浸透する。 ＋＋＋ グルコース水溶液がよく浸透する。 ＋＋＋＋ グルコース水溶液が非常によく浸透する。

【００２６】

【表１】

【００２７】表１の結果は次の様に総括できる。水溶解
性のＳ−カルボキシメチルケラテインを固定化酵素担体
として用いたときには、水不溶性Ｓ−カルボキシメチル
ケラテインや、従来用いられている絹フィブロインを用
いたときよりも高い出力電流値が得られ、測定値のバラ
ツキが少なく、かつピーク時間が短いためバイオセンサ
ーとして優れた応答性を示す。固定化生理活性物質の担
体としての本発明のケラチン蛋白質が優れた効果を発揮
する事が確認される。Ｓ−カルボキシメチルケラテイン
を担体に用いた固定化グルコオキシダーゼの浸透性(親
水性)は極めて良好であった。またグルコース濃度が１
００mg/dlから３００、６００mg/dlと増加すると過酸化
水素電極からの出力電流値は下記の式で見るとおりほぼ
直線的に増加し、両者には比例関係が認められた。この
ことは、本発明によるケラチン蛋白質を担体とする固定
化グルコースオキシダーゼで基質のグルコースを定量す
るにあたっては、基質が低濃度であっても、グルコース
濃度に比例した出力電流が精度良く検出できることを意
味している。 グルコース濃度（mg/dl；Ｘ）液と出力電流値（μＡ；
Ｙ）との相関関係： ０.０７％担体水溶液： Ｙ＝０.４５１１Ｘ＋０.０４１５ Ｒ＝０.９９００２ ０.４％担体水溶液： Ｙ＝０.６６３３３Ｘ＋０.０１２２５ Ｒ＝０.９９
４１６ ０.７％担体水溶液： Ｙ＝０.７３０５６Ｘ＋０.０１４０９４ Ｒ＝０.９９
０２２ 上式においてＲは相関係数を示す。水不溶化処理を行っ
ていない実施例３の固定化グルコースオキシダーゼは、
水不溶化処置を行った比較例５のものに比べて、出力値
が優れ、バラツキ状態が少なく、かつピーク時間が短
い。このことから固体化担体は水不溶化処理を施さない
ことにより、被検溶液のグルコースが拡散し易く、固定
化された生理活性物質と良好に反応することがわかる。
また表には示さなかったが実施例７〜１２で得た固定化
酵素についても表１と同様の優れた出力特性が得られ、
被検液の浸透状態も良好であった。

【００２８】（２）血清を用いた評価 実施例１〜６および比較例１〜２で得た固定化グルコオ
キシダーゼを過酸化水素電極の表面に装着し、その上に
液状コントロール血清（和光純薬、グルコース濃度８０
mg／dl）を用いて所定濃度のグルコースを含有するよう
に調製した血清０.８μlを滴下させた時の過酸化電極か
らの出力電流（μＡ），出力電流が最大となる時間（以
下ピーク時間）および変動係数（ＣＶ％）を求めた。ま
た血清を滴下した時のトレシー繊維内部に浸透する血清
の浸透程度を評価した。測定回数は８回で、得られた結
果を平均して表２に示す。浸透性を示す表２における表
示は（１）と同様に４段階で評価した。

【００２９】

【表２】

【００３０】絹フィブロイン等の従来の担体による固定
化生理活性物質に血清を滴下すると一般に電流のピーク
値はばらついてしまい定状の波形を得ることは困難であ
ったが、ケラチン蛋白質を担体にした本発明の固定化生
理活性物質では、出力電流のバラツキが軽減でき、ノイ
ズが少なく明瞭な波形を得ることが可能であった。また
上記の従来法によると、一般にグルコース濃度の低い血
清を滴下しても出力波形は計測できなかったが、本発明
では、グルコース濃度１００mg/dl程度の血清であって
も血清中のグルコースは十分計測が可能であり、全測定
でピークが現れた。また表には示さなかったが実施例７
〜１２で得た固定化酵素についても表２と同様の優れた
出力特性が得られ、被検液の浸透状態も良好であった。

【００３１】

【発明の効果】本発明は、上記のような構成からなるた
め以下に示す効果を発揮する。 １） 元然生体高分子である絹フィブロインを生理活性
物質の固定化担体に用いるような従来法とは違い、固定
化生理活性物質に不溶化処理を施す必要がないので、生
理活性物質の活性が失活する恐れが全く無い。 ２） 本発明の固定化生理活性物質の親水性が大きく、
従って基質溶液、血清、血漿、全血に対する濡れ状態が
従来のものより著しく良好であり、浸透状態も良好であ
る。 ３） 凹凸のある繊維基合体の構成繊維表面にケラチン
膜が形成されるので、十分大きい正味の膜面積を確保す
ることができる。従って生理活性物質の基質を含む被検
液との接触が十分に行われ大きい反応速度が得られる。 ４） 生理活性物質、例えば基質が低濃度であっても検
知可能である。 ５） 繊維集合体の構成表面が疎水性であっても、親水
性であっても同様に利用できる。従って巾広い繊維集合
体を利用できる。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 繊維集合体の表面に、ケラチン蛋白質の
   薄膜が形成されており、該薄膜中に生理活性物質が包括
   されていることを特徴とする、ケラチン蛋白質を担体と
   する固定化生理活性物質。
2. 【請求項２】 ケラチン蛋白質がケラテインまたはケラ
   トースであることを特徴とする請求項１に記載の固定化
   生理活性物質。
3. 【請求項３】 ケラテインが、そのＳＨ結合のＨ原子の
   少なくとも１部が官能基をもつ有機基で置換されたケラ
   テイン誘導体であることを特徴とする請求項２に記載の
   固定化生理活性物質。
4. 【請求項４】 有機基がカルボキシメチル基、アミノエ
   チル基またはフェニルエチル基であることを特徴とする
   請求項３に記載の固定化生理活性物質。
5. 【請求項５】 生理活性物質を含むケラテイン若しくは
   その誘導体、またはケラトースの水溶液を繊維集合体の
   表面に処理し、当該表面にケラテイン若しくはその誘導
   体、またはケラトースの薄膜を形成することを特徴とす
   る固定化生理活性物質の製造方法。
6. 【請求項６】 処理が滴下、塗布または含浸、および乾
   燥の工程からなる請求項５の製造方法。