JPH0757760B2 - 生体由来物質の固定化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、タンパク質、糖タンパク質及びこれらの誘導
体などの生体由来物質を変性させることなく担体に固定
化することができる生体由来物質の固定化方法に関す
る。

［従来技術］ 一般に、タンパク質、糖タンパク質など生体由来物質を
高分子材料に固定化する方法としては、生体由来物質が
荷電を有するものであれば、反対の荷電を高分子材料に
導入してイオン相互作用により固定化する方法を適用す
ることができ、生体由来物質が疎水性ドメインを有する
ものであれば、疎水性高分子材料に疎水性相互作用によ
り固定化する方法を適用することができ；生体由来物質
の存在下で網目状高分子を生成させることにより、形成
される網目の中に封じ込む方法を適用することができ
る。さらに、これらの方法以外に、生体由来物質を確実
に高分子材料に固定化する方法としては、化学的に結合
せしめることにより固定化する共有結合法がある。この
共有結合法により高分子材料に生体由来物質を固定化す
る方法としては、下記のものを例示することができる。
なお、ここでは高分子材料（担体）を表し、は生体
由来物質を表す。

１）担体にアミノ基を導入したのち、ジアゾ化し、生体
由来物質が有するアミノ基とカップリングを行う方法。

２）BrCNによる活性化法。

３）スクシンイミド基を導入する方法。

４）塩化シアヌルによる固定化法。

５）ハロゲン化アセチル化による固定化法。

６）担体をアミノ化したのち、グルタルアルデヒドなど
の二官能性試薬を反応させる方法。

７）トレシルクロリドで処理する方法。

８）過ヨウ素酸による酸化によってアルデヒド基を導入
する方法。

−CHO＋−NH₂ →−CH＝Ｎ− ９）担体にカルボキシル基を導入したのち、カルボジイ
ミドで処理する方法。

上記した生体由来物質の固定化法の中でも、確実性、特
に血液適合性材料として担体に固定化した生体由来物質
を用いる場合には、異種の生体由来物質の流出の危険性
を考慮すると、共有結合による固定化法は有用である。

［発明が解決しようとする問題点］ タンパク質、糖タンパク質等の生体由来物質を高分子材
料に固定化する際に最も注意しなければならない点は、
固定化処理において、生体由来物質の変性を最小にする
ことである。生体由来物質はその機能発現において、高
次構造が深く関与していることは既知の通りであり、固
定化処理条件は、固定化後の生体由来物質の機能発現に
際し、その性能の大小に大きな影響を与えるものであ
る。

生体由来物質の担体への固定化方法として、共有結合法
を適用する場合には、生体由来物質が他の固定化方法と
比べて、より厳しい環境におかれる場合が多い。例え
ば、線溶系賦活化酵素であるウロキナーゼ、ストレプト
キナーゼ又はプラスミンを高分子材料へ共有結合法によ
り固定化する場合は、例えば、カルボジイミド試薬また
はウッドワード試薬を用いることができるが、カルボジ
イミドを使用する場合、酸性領域（pH6以下）で１夜攪
拌反応させなければならない（特公昭53-15913号公報及
び特公昭55-15224号公報参照）。

また、特開昭58-118761号公報には、「材料表面に固定
化されたアルブミン上に抗凝固性物質及び／又は線溶系
賦活化酵素が固定化されていることを特徴とする抗血栓
性材料」に係る技術が開示されているが、活性化したポ
リアミドへのアルブミンの固定化及びそれに続く、ウロ
キナーゼの固定化に際し、カルボジイミドをカップリン
グ剤として使用しているために、pH4.8で１夜攪拌し目
的物を得ている。この場合、高分子材料とウロキナーゼ
を直接結合したものより、アルブミンを介して結合させ
た方が、線溶活性は高いことが示されている。理由とし
て、アルブミンを介することによる担持量の増加として
説明されている。

更に前記公報によれば、アルブミンは抗凝血物質及び／
又は線溶系賦活化酵素を固定化するための二次的な担体
を形成し、それ自体は何ら抗凝血活性を有するものでは
ないから、固定化方法及び条件は任意であるとしてい
る。しかし、M.S.Manroら（Trans.Am.Soc.Artif.Int.Ro
gans,27,499（1981））によれば、アルブミンを安定に
吸着した表面においては、十分な抗凝血栓性を示すこと
が報告されている。即ち、積極的な抗凝血活性を示さな
いアルブミンも、変性を著しく抑制して表面に導入可能
であれば、抗血栓性材料としては、十分に機能すること
を意味している。

しかしながら、かかる方法においても、第１に固定化す
るアルブミン、第２に固定化するウロキナーゼにおい
て、タンパク質の安定性に好ましくない反応条件である
ことは言うまでもない。

また、血液適合性材料の開発において、ミクロ相分離構
造の有用性が指摘されているが、これは、血中のタンパ
ク質をできるだけ変性を小さくして高分子材料表面に吸
着させて、血球成分、特に血小板の活性化を抑制しよう
というものである。このように、一般に高分子材料にタ
ンパク質が直接吸着する際、高次構造の変化に伴う、性
質変化は、大小はともあれ免れない。生体由来物質を導
入する際にも、これと同様なことが言える。即ち、高分
子表面にカップリング試薬を用いて、直接、共有結合に
より導入した生体由来物質は、変性を免れ得ない。特公
昭59-50339号公報に開示されているセルロース又はその
誘導体を担体とし、表面にウロキナーゼが固定化された
抗血栓性医療材料においても、担体が親水性であるセル
ロースであるため、担体が疎水性材料である場合よりは
変性は軽度であるが、変性による活性低下を免れること
はできない。

したがって、本発明は、上記の問題点を解決し、担体に
生体由来物質を固定化する場合において、該生体由来物
質が変性することなく、固定化後においてそれが有して
いる機能を充分に発現できる生体由来物質の固定化法を
提供することを目的とする。

［問題点を解決するための手段］ 上記のとおり、生体由来物質を担体に固定化する場合に
は、固定化に際してのpH、温度及び溶媒などの条件によ
り該生体由来物質が変性されてしまい、それが本来的に
有している優れた機能を有効に発現できなくなる。した
がって、本発明者らは、かかる問題点を解決するべく鋭
意研究を行った結果、固定化による生体由来物質の変
性を防ぐためには生理的条件下で固定化を行えばよいこ
と及びそのためには担体と生体由来物質との間に適当
な緩衝域（スペーサー）を設け、担体と生体由来物質と
の直接的な相互作用を制限すること、により生体由来物
質の変性を防止できることを見出し、本発明を完成する
に至った。

すなわち、本発明の生体由来物質の固定化方法は、担体
に生体由来物質を固定化する方法において、該生体由来
物質が有する第１級アミノ基と、予め担体に結合させた
前記第１級アミノ基と結合可能な官能基として次式： を有するポリエチレングリコールとを、生理的条件下で
反応させることを特徴とする。

本発明で用いる担体は、特に制限されるものではなく、
水不溶性の高分子材料又は無機材料を用いることができ
る。水不溶性の高分子材料としては、例えば、セルロー
ス、アミノエチルセルロース、エチレンと酢酸ビニルの
共重合体の加水分解物、ポリウレタン、ポリビニルアル
コール、ポリエステル、ポリアミドなどを用いることが
でき、無機材料としては、例えばガラス板などを用いる
ことができる。

本発明で用いるポリエチレングリコールは、担体に生体
由来物質を結合させる場合にスペーサーの役目をするも
のである。

本発明においては、上記の担体にポリエチレングリコー
ルを生体由来物質の固定化に先立って予め結合・固定す
る。

この場合に、担体として水不溶性の高分子材料を用いる
場合には、適当な溶媒中で高分子材料とポリエチレング
リコールを反応させることにより両者を結合させること
ができる。担体として無機材料を用いる場合には、予め
無機材料表面をポリエチレングリコールの官能基と結合
可能な官能基を有する化合物、例えばシランカップリン
グ剤で処理したものを、同様にポリエチレングリコール
と反応させることにより両者を結合させることができ
る。

また、担体にポリエチレングリコールを結合させる場合
には、ポリエチレングリコールに生体由来物質の第１級
アミノ基と生理的条件下で結合可能な官能基を導入した
のち行うか又は担体にポリエチレングリコールを結合さ
せたのち官能基を導入することができる。

ここで導入可能な官能基としては、生体由来物質の第１
級アミノ基と生理的条件下で反応可能なものであり、次
式 で示されるものが好適に用いられる。この場合、生体由
来物質の有する第１級アミノ基と生理的条件下で速やか
に反応し、アミド結合により化学的に結合する。

導入方法は特に制限されないが、例えば、末端にカルボ
キシル基を有するポリエチレングリコールとＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドとをカルボジイミドの存在下で縮合
反応させる方法が、簡便で、かつ、高い収率で目的とす
る官能基を導入できることから好ましい。

このように、官能基を有するポリエチレングリコールを
担体に結合・固定したのち、生理的条件下で担体にポリ
エチレングリコールを介して生体由来物質を固定化す
る。

なお、本発明の固定化法においては、担体とスペーサー
となるポリエチレングリコールとを結合せしめたのち、
該スペーサーを介して生体由来物質を結合・固定化させ
るが、スペーサーとなるポリエチレングリコールと生体
由来物質を結合させたものを担体に結合・固定化させる
ことも可能である。

本発明の固定化法を適用可能な生体由来物質としては、
生体から得られるタンパク質、糖タンパク質及びアミノ
酸などの生体由来物質又は生体由来の誘導体であれば如
何なるものであってもよいが、その有用性から例えばア
ルブミン、グロブリンなどの血しょうタンパク質、線溶
系賦活化酵素、ヘパリノイド、細胞接着因子及びアミノ
酸などを用いることができ、これら以外にも生体由来物
質の誘導体として、例えば、生理的に活性なペプチドな
ども用いることができる。

ここでいう生理的条件とは、固定化処理により生体由来
物質を変性させることがない条件であり、例えば通常い
うところの中性付近の電解質を含む水溶液中で、室温〜
37℃付近の条件である。

本発明の固定化法により担体に固定化した生体由来物質
は、診断用ディバイス、バイオセンサー、バイオリアク
ター、血液適合性材料及び細胞培養用基材などに適用す
ることができる。

［実施例］ 実施例１ 内径35mmガラス製シャーレにアミノエチルセルロースの
ジメチルホルムアミド溶液を注ぎ、減圧下、40℃で加熱
して溶媒を留去し、キャスト膜を得た。ここに、分子量
1000のポリエチレングリコールジカルボン酸のジスクシ
ンイミドエステル（濃度0.1g/ml）水溶液を注ぎ、40℃
で３時間放置した。その後、水溶液を捨て、十分に水洗
したのち、血しょうフィブロネクチンを20μg/mlの濃度
になるように溶解させた0.1モルのリン酸緩衝液（pH7.
4）を注ぎ、１時間放置した。次いで、溶液を捨て、十
分にリン酸緩衝液でリンスしたのち、アミノエチルセル
ロースにポリエチレングリコールを介して固定化された
血しょうフィブロネクチンの活性を肝実質細胞の接着活
性及び伸展活性の測定より求めた。

すなわち、ラット肝臓より、Seglen（Seglen,P.O.;Meth
ods in Cell Biology,13,29〜83（1976））らの方法に
準じ、肝実質細胞を分離し、Williams'E培地（無血清）
に懸濁させた。この懸濁液をシャーレに細胞数が約45万
個／皿となるように注入し、一定時間インキュベートし
たのち、非接着細胞をカウントすることにより接着率を
算出した。また位相差顕微鏡観察による形態変化で伸展
活性を測定した。

この結果、上述した血しょうフィブロネクチンをポリエ
チレングリコールを介して、アミノエチルセルロースに
固定化した材料について、接着活性はインキュベーショ
ン30分で90％と高い接着率が得られ、しかも伸展活性に
ついても形態変化が１時間後に観察された。

実施例２ 実施例１において血しょうフィブロネクチンの代わりに
オリゴペプタイド（アルギニン−グリシン−アスパラギ
ン酸−セリン）を用いて、これを固定化させた。

このものの接着活性は、インキュベーション15分で90％
と高い接着率であり、伸展活性についても実施例１の場
合より優れていた。

比較例１ 実施例１と同様にアミノエチルセルロースのキャスト膜
をシャーレ上に作製した。ここに、血しょうフィブロネ
クチン溶液（20μg/ml、0.1モルのリン酸緩衝液、pH＝
7.4）を注ぎ、30分間、室温で放置したのち、溶液を捨
て、冷所で風乾した。風乾後、シャーレに１％−グリタ
ールアルデヒドリン酸緩衝液（pH＝7.4）を注ぎ、10℃
で一晩放置した。その後、生理食塩水で十分に洗浄した
のち、実施例１と同様にして肝実質細胞の接着活性及び
伸展活性を測定した。

その結果、接着活性はインキュベーション３時間におい
て接着率が50％と低く、伸展活性も観察されなかった。

実施例３ 両末端にカルボキシル基を有するポリエチレングリコー
ルを脱水した有機溶媒中において、カルボジイミドの存
在下Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、ポリ
エチレングリコールの両末端をスクシンイミド化した。
次いで、アミノエチル化セルロース又はジイソシアネー
トでウレタン化したセルロースを水で処理したアミノ化
セルロースとスクシンイミド化したポリエチレングリコ
ールを反応させた。この反応によりスクシンイミド化し
たポリエチレングリコールをアミノ化セルロース表面に
固定した。固定化されたことはＸ線光電子分析解析によ
ってN/C比の減少およびO/C比の増大により確認した。

次いで、このアミノ化セルロースをアルブミンのリン酸
緩衝液（濃度0.1、pH7.4）中に浸漬し、37℃で一昼夜放
置した。放置後に取り出し、リン酸緩衝液で洗浄したの
ちＸ線光電分析を行ったところ、アルブミンの導入が確
認された（N/C比の増大及びO/C比の減少）。また、イソ
プロパノール／水の混合溶媒で洗浄を行ったが、N/C比
及びO/C比には変化がなく、アルブミンはアミノ化セル
ロースに化学的に結合されたものといえる。なお、この
ものは、緩衝液中に長時間放置した場合にも何ら変化は
なかった。

比較例２ スクシンイミド化したポリエチレングリコールを結合さ
せていないアミノ化セルロースとアルブミンを用い、実
施例２と同様に処理したのち、Ｘ線光電分析を行ったと
ころ、アルブミンの吸着は認められたが、イソプロパノ
ール／水の混合溶媒で洗浄を行った場合においてイソプ
ロパノール濃度を上げて行った場合には、アルブミンは
アミノ化セルロース表面から容易に脱着されてしまっ
た。したがって、この場合にはアルブミンは単に物理的
に吸着していたものと認められる。

実施例４及び比較例３ 実施例３に準じて、アミノ化セルロース表面に強力な線
溶酵素である組織プラスミノーゲンアクチベーター（TP
A）の固定化を行った。ただし、比較例２に準じてTPAの
固定化を行ったものを比較例３とする。

このものについて、プラスミノーゲンの活性化を、合成
蛍光基質により評価したところ、実施例３の場合の方
（すなわち、化学的な固定化を行ったもの）が大きかっ
た。また、スペーサーとして用いたポリエチレングリコ
ールの分子量を表に示すとおりに増加させたところ、分
子量が大きくなるほどプラスミノーゲン活性化の効果は
顕著であった。この事実から、ポリエチレングリコール
鎖の末端に化学的に固定化されたTPAは依然として高い
酵素活性を保持していると共に、立体的にもプラスミノ
ーゲンが接近し易い配位であるものと認められる。

実施例５ まず、ガラス板表面をアミノ基を含むシランカップリン
グ剤で処理してアミノアルキル基をガラス板表面に導入
した。次いで、実施例１と同様にして得た両末端スクシ
ンイミド化ポリエチレングリコールと該ガラス板を接触
させ、スクシンイミド化ポリエチレングリコールで表面
修飾されたガラス板を得た。その後、この表面修飾され
たガラス板を実施例１に準じてインシュリン抗体と接触
させて、該ガラス板の表面にインシュリン抗体を固定化
させた。

［発明の効果］ 本発明の固定化法によれば、 生体由来物質の固定化収率を増大させることができ
ること、 固定化反応操作が簡便であること、 固定化された生体由来物質の安定性が非常に高いこ
と、 生理的条件下で固定化を行っているために、固定化
された生体由来物質が、酵素活性および抗原抗体反応に
おける結合性などの優れた機能を有していること、 などの優れた効果が得られる。

また、本発明の固定化法を適用してインシュリン抗体を
固定化させた担体は、血中インシュリン濃度を測定でい
る診断用キットとして応用できる。とりわけ、この場合
には、従来のグルタルアルデヒドなどを用いる測定方法
に比べて、 担体とスペーサー、スペーサーと抗体が、それぞれ
アミド結合により結合していることから極めて安定であ
ること、 スペーサーを介しての抗原抗体反応であるので固定
化されるタンパク質（抗原）の抗体の影響による変性が
大幅に抑制される、 という優れた効果も有している。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】担体に生体由来物質を固定化する方法にお
   いて、該生体由来物質が有する第１級アミノ基と、予め
   担体に結合させた前記第１級アミノ基と結合可能な官能
   基として次式： を有するポリエチレングリコールとを、生理的条件下で
   反応させることを特徴とする生体由来物質の固定化方
   法。
2. 【請求項２】生体由来物質が、血清タンパク、線溶系賦
   活化酵素、ヘパリノイド、細胞接着因子、生理的に活性
   なペプチドである、特許請求の範囲第１項記載の固定化
   方法。