JPS63252252A - Ｂリンパ球分離材、分離方法および分離器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、Ｂ−リンパ球分離材、分離方法および分離器
に関するものである。詳しく述べると、本発明は末梢血
あるいは生体組織から得られるリンパ球分画を浮遊させ
た細胞懸濁液あるいは白血球分画などのＢリンパ球含有
液から８リンパ球を処理液中の細胞成分の機能的損傷を
最小限にとどめ、Ｒｎ便かつ安価に高収率、高Ｍ！度で
分離するＢリンパ球分離材、分離方法および分離器を示
すものである。

リンパ球は、血球系の幹細胞から分化した免疫機能を担
う細胞であり、機能あるいは細胞膜形質等の点からいく
つかの亜群に分けられる。それらは、抗体を産生じ体液
性免疫を担うＢリンパ球、免疫調節性リンホカインや炎
症性リンホカイン等を産生し細胞性免疫を担うＴリンパ
球、およびヌル細胞等のリンパ球サブクラスであり、ざ
らに、Ｔ、Ｂリンパ球は、機能的に異なるサブセットが
存在する。近年、このような免疫学的特性の異なるＴ、
Ｂリンパ球等のサブクラスを、機能的損傷を最小限にと
どめ純粋に分離、精製、濃縮する技術が、広範囲にわた
る社会的分野で強く望まれている。例えば細胞学、免疫
学などの基礎研究においては１体内免疫系の生体外（ｉ
ｎ　ＶｉｔｒＯ）での解析において、少なくともＴ、Ｂ
リンパ球群までの分離が必要であり、臨床医学における
診断、治療等では、機能低下あるいは昂進した特定分画
の移入あるいは除去が必要であり、またリンパ系の生理
活性物質の取得においては、産生細胞分画の分離、濃縮
が重要である。

（従来の技術） Ｔリンパ球と８リンパ球の分離方法としては、まずソデ
イウムメトリゾエイトフイコール混液などの高密度等張
渡を用いた比重遠心法により末梢血あるいは生体組織等
からリンパ球分画を得、続いてこれを分離処理してＴリ
ンパ球とＢリンパ球に分離するのが従来一般的である。

この後続する分離処理方法としては、大きく（１）細胞
膜表面の特異抗原、レセプター、免疫グロブリンを指標
とするもの、（２）物理的細胞分離および（３）吸着ク
ロマトグラフィーの３つに分けられる。

（１）の方法としては、ロゼツト形成法、（抗体や免疫
複合体を結合させた）アフィニティークロマトグラフィ
ー、抗体、補体による細胞融解法、マイトジェン活性化
リンパ球の除去、フルオレセインアクチベイテツドセル
ソータ−（Ｆ、Δ、Ｃ０Ｓ、〉などが知られているが、
これらの方法では、生物学的に特異性の高い強固な結合
や刺激を受けるため、インラクトな状態でＴリンパ球も
しくはＢリンパ球を回収するのが難しく、かつ大量処理
に向かない手法も多い。また、（２）の方。法としては
、密度勾配遠心法、細胞電気泳動法などが知られている
が、Ｔリンパ球とＢリンパ球との間ｔこ比重、密度等の
物理的諸物性に際だった差がないため、分離回収された
細胞の収率あるいは純度に高い精度が要求できない。さ
らに（３）の方法としては、ナイロン、テトロン、綿繊
維等の異物に対するＴリンパ球と８リンパ球の非特異的
接着能力の差を利用するものが知られているが、高精度
に分離細胞を得るためには、吸着担体の牛脂兄血清（Ｆ
ｅ２）等による処理が必要であることや流速などの実施
条件の設定が難しく、マクロファージ等の不純物の混入
も多い。加えて、これらの従来の方法は、全般に、繁雑
な操作、あるいは準備がともない、分離操作を行う場合
の経験的技術的円熟が必須であるという大きな課題も存
在しているものであった。

（発明が解決しようとする問題点） 従って、本発明は、新規なりリンパ球分離材、分離方法
および分離器を提供することを目的とする。本発明はま
た、細胞の諸活性に影響を与えることなく、簡便かつ安
価に高収率、高純度で分離するＢリンパ球分離材、分離
方法および分離器を示すものである。本発明はさらに、
大量処理に適したＢリンパ球分離材、分離方法および分
離器を提供することを目的とする。

（問題点を解決するための手段） 上記諸口的は、水不溶性固体物質表面に、免疫グロブリ
ンと高い親和性を有する有機合成されたリガンドを固定
化したことを特徴とするＢリンパ球分離材によって達成
される。

本発明はまた、有機合成されたリガンドが、複素環式化
合物類、ペプチド類およびアミノ酸類からなる群から選
ばれたものであるＢリンパ球分離材を示すものである。

本発明はざらに、複素環式化合物類が、化学療法剤およ
びその誘導体、ピリミジン関連化合物、ピリジン関連化
合物ならびにピラジン関連化合物からなる群から選ばれ
たものであるＢリンパ球分離材を示すものである。本発
明はざらに複素環式化合物類が、サルファ剤、サルファ
剤とｐＫ４．０〜９０．０の色素との化合物、２−チオ
ウラシル、イソニコチン酸ヒドラジドおよびルミノール
からなる群から選ばれたものであるＢリンパ球分離材を
示すものである。本発明はまた、ペプチド類が、アミノ
酸数２〜１０程度のオリゴペプチドであるＢリンパ球分
離材を示すものである。本発明はさらに、オリゴペプチ
ドが、リジン、チロシンによるオリゴペプチドあるいは
アスパチルフェニルアラニンアルキルエステルであるＢ
リンパ球分離材を示すものである。本発明はまた、アミ
ノ酸類が、バリン、ロイシン、チロシン、フェニルアラ
ニン、イソロイシン、トリフｉ・ファン、リジン、アル
ギニン、プロリンおよびアスパラギン酸ないしその誘導
体からなる群から選ばれたアミノ酸を単独あるいは複数
組合せたものであるＢリンパ球分離材を示すものである
。本発明はざらにまた、有機合成されたリガンドが、ア
ルギニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、プロリ
ンとスルフ１チアゾールを組合せてなるものであるＢリ
ンパ球分離材を示すものである。本発明はまた、水不溶
性固体物質が、合成有機高分子、天然有機高分子または
無機物からなる粒子体であるＢリンパ球分離材を示すも
のである。本発明はまた、水不溶性固体物質が、平均粒
径０．０５〜５ｍの粒子体であるＢリンパ球分離材を示
すものでおる。本発明はまた、有機合成されたリガンド
が、水不溶性固体表面に共有結合により固定化されてい
るものであるＢリンパ球分離材を示すものである。

上記開目的はまた、水不溶性固体物質表面に免疫グロブ
リンと高い親和性を有する有機合成されたリガンドを固
定化してなる分離材に、Ｂリンパ球含有液を接触させ、
膜表面に免疫グロブリン分子（Ｓ−Ｉｇ＞を有するＢリ
ンパ球を選択的に捕捉せしめることを特徴とするＢリン
パ球の分離方法により達成される。

本発明はまた、分離材に固定化されたリガンドが、複素
環式化合物類、ペプチド類およびアミノ酸類からなる群
から選ばれたものであるＢリンパ球の分離方法を示すも
のでおる。本発明はざらに、複素環式化合物類が、化学
療法剤およびその誘導体、ピリミジン関連化合物、ピリ
ジン関連化合物ならびにピラジン関連化合物からなる群
から選ばれたものであるＢリンパ球の分離方法を示すも
のである。本発明はざらに複素環式化合物類が、サルフ
ァ剤、サルファ剤とｐＫ４．０〜９．０の色素との化合
物、２−チオウラシル、イソニコチン酸ヒドラジドおよ
びルミノールからなる群から選ばれたものであるＢリン
パ球の分離方法を示すものである。本発明はまたペプチ
ド類が、アミノ酸数２〜１０程度のオリゴペプチドであ
るＢリンパ球の分離方法を示すものである。本発明はさ
らに、オリゴペプチドが、リジン、チロシンによるオリ
ゴペプチドあるいはアスパチルフェニルアラニンアルキ
ルエステルであるＢリンパ球の分離方法を示すものであ
る。本発明はまた、アミノ酸類が、バリン、ロイシン、
チロシン、フェニルアラニン、イソロイシン、トリプト
ファン、リジン、アルギニン、プロリンおよびアスパラ
ギン酸ないしその誘導体からなる群から選ばれたアミノ
酸を単独あるいは複数組合せたものであるＢリンパ球の
分離方法を示すものである。本発明はさらに、分離材に
固定されたされたリガンドが、アルギニン、アスパラギ
ン酸、フェニルアラニン、プロリンとスルファチアゾー
ルを組合せてなるものであるＢリンパ球の分離方法を示
すものである。本発明はざらに、水不溶性固体物質が、
合成有機高分子、天然有機高分子または無機物からなる
ものでめるＢリンパ球の分離方法を示すものである。本
発明はまた洗浄液として等張緩衝液を用いるものである
Ｂリンパ球の分離方法を示すものである。本発明はざら
に分離材をウシ血清アルブミンで処理した後、リンパ球
懸濁液と接触させるものであるＢリンパ球の分離方法を
示すものである。

上記開目的はざらに、粒子状の水不溶性固体物質表面に
免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成されたリ
ガンドを固定化してなる分離材を充填したカラムを有す
ることを特徴とするＢリンパ球の分離器により達成され
る。

本発明はまたカラムがポリプロピレンまたはポリカーボ
ネートからなるものであるＢリンパ球の分離器を示すも
のである。本発明はざらにカラムの出入口と分離材層と
の間には、Ｂリンパ球含有液中の細胞成分は通過するが
分離材は通過できない網目を有するフィルターを備えて
なるものであるＢリンパ球の分離器を示すものである。

本発明はざらにフィルターがポリエステルまたはポリア
ミドからなるものであるＢリンパ球の分離器を示すもの
である。

上記開目的はさらに、水不溶性固体物質表面にスペーサ
ーを介して、免疫グロブリンと高い親和性を有する有機
合成されたリガンドが固定化されていることを特徴とす
るＢリンパ球分離材ににって達成される。

本発明はまた、スペーサーが少なくとも２個以上の炭素
原子を有する炭化水素鎖ないしは特性基を含む炭化水素
鎖を骨格とするものであるＢリンパ球分離材を示すもの
である。本発明はさらに、スペーサーのメチレンの繰返
しが４個以上の直鎖アルキルを骨格とするものであるＢ
リンパ球分離材を示すものである。本発明はまた、スペ
ーサーが重合度１〜５０のエチレンオキサイド骨格を有
するものであるＢリンパ球分離材を示すものである。本
発明はまた、有機合成されたリガンドが、複素環式化合
物類、ペプチド類およびアミノ酸類からなる群から選ば
れたものであるＢリンパ球分離材を示すものである。本
発明はざらに、複素環式化合物類が、化学療法剤および
その誘導体、ピリミジン関連化合物、ピリジン関連化合
物ならびにピラジン関連化合物からなる群から選ばれた
ものであるＢリンパ球分離材を示すものである。本発明
はざらに複素環式化合物類が、サルファ剤、サルファ剤
と１）Ｋ４．０〜９．０の色素との化合物、２−チオウ
ラシル、イソニコチン酸ヒドラジドおよびルミノールか
らなる群から選ばれたものであるＢリンパ球分離材を示
すものである。本発明はまた、ペプチド類が、アミノ酸
数２〜１０程度のオリゴペプチドであるＢリンパ球分離
材を示すものである。本発明はさらに、オリゴペプチド
が、リジン、チロシンによるオリゴペプチドあるいはア
スパチルフェニルアラニンアルキルエステルであるＢリ
ンパ球分離材を示すものである。本発明はまた、アミノ
酸類が、バリン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニ
ン、イソロイシン、トリプトファン よびアスパラギン酸ないしその誘導体からなる詳から選
ばれたアミノ酸を単独あるいは複数組合せたものである
Ｂリンパ球分離材を示すものである。

本発明はざらにまた、有機合成されたりカントが、アル
ギニン、アスパラキン酸、フェニルアラニン、プロリン
とスルファチアゾールを組合せてなるものであるＢリン
パ球分離材を示すものである。本発明はまた、水不溶性
固体物質が、合成有機高分子、天然有機高分子または無
機物からなる粒子体であるＢリンパ球分離材を示すもの
である。本発明はまた、水不溶性固体物質が、平均粒径
０．０５〜５ｍｍの粒子体であるＢリンパ球分離材を示
すものである。

上記開目的はまた、水不溶性固体物質表面にスペーサー
を介して免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成
されたリガンドを固定化してなる分離材に、Ｂリンパ球
含有液を接触させ、膜表面に免疫グロブリン分子（Ｓ−
１ｇ＞を有するＢリンパ球を選択的に捕捉せしめること
を特徴とするＢリンパ球の分離方法により達成される。

本発明はまた分離材におけるスペーサーが少なくとも２
個以上の炭素原子を有する炭化水素鎖ないしは特性基を
含む炭化水素鎖を骨格とするものであるＢリンパ球の分
離方法を示すものである。

本発明はざらに分離材におけるスペーサーのメチレンの
繰返しが４個以上の直鎖アルキルを骨格とするものであ
るＢリンパ球の分離方法を示すものである。本発明はま
た、分離材におけるスペーサーが弔合痕１〜５０のエチ
レンオキサイド骨格を有するものであるＢリンパ球の分
離方法を示すものである。本発明はまた、分離材に固定
化されたリガンドが、複素環式化合物類、ペプチド類お
よびアミノ酸類からなる群から選ばれたものであるＢリ
ンパ球の分離方法を示すものである。本発明はざらに、
複素環式化合物類が、化学療法剤およびその誘導体、ピ
リミジン関連化合物、ピリジン関連化合物ならびにピラ
ジン関連化合物からなる群から選ばれたもので必るＢリ
ンパ球の分離方法を示すものである。本発明はざらに複
素環式化合物類が、サルファ剤、サルファ剤とｐＫ４．
０〜９、０の色素との化合物、２−チオウラシル、イソ
ニコチン酸ヒドラジドおよびルミノールからなる群から
選ばれたものである日リンパ球の分離方法を示すもので
ある。本発明はまたペプチド類が、アミノ酸数２〜１０
程度のオリゴペプチドであるリンパ球の分離方法を示す
ものである。本発明はざらに、オリゴペプチドが、リジ
ン、チロシンによるオリゴペプチドあるいはアスパチル
フェニルアラニンアルキルエステルであるＢリンパ球の
分離方法を示すものである。本発明はまた、アミノ酸類
が、バリン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、
イソロイシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、
プロリンおよびアスパラギン酸ないしその誘導体からな
る群から選ばれたアミノ酸を単独あるいは複数組合せた
ものであるＢリンパ球の分離方法を示すものである。本
発明はさらに、分離材に固定化されたリガンドが、アル
ギニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、プロリン
とスルファチアゾールを組合せてなるものであるＢリン
パ球の分離方法を示すものである。本発明はざら【こ、
水不溶性固体物質が、合成有機高分子、天然有機高分子
または無機物からなるものであるＢリンパ球の分離方法
を示すものである。本発明はまた洗浄液として等張緩衝
液を用いるものであるＢリンパ球の分離方法を示ずもの
である。

上記諸口的はざらに、粒子状の水不溶性固体物質表面に
スペーサーを介して免疫グロブリンと高い親和性を有す
る有機合成されたリガンドを固定化してなる分離材を充
填したカラムを有することをＢリンパ球の分離器により
達成される。

本発明はまたカラムがポリプロピレンまたはポリカーボ
ネートからなるものであるＢリンパ球の分離器を示すも
のである。本発明はざらにカラムの出入口と分離材層と
の間には、Ｂリンパ球含有液中の細胞成分は通過するが
分離材は通過できない網目を有するフィルターを備えて
なるものであるＢリンパ球の分離器を示ずものである。

本発明はざらにフィルターがポリエステルまたはポリア
ミドからなるものであるＢリンパ球の分離器を示すもの
である。なお、本明細書において「リガンド」とは張白
質に特異的に結合する物質をいう。

（作用） 公知のごとくＢリンパ球の細胞膜表面には、その分化の
度合などにより、ＩＯＧ、ＩＯＭ、ＩＣＪＡなどそのク
ラスの異なるが、いずれも免疫グロブリンが存在してお
り、一方丁リンパ球の細胞膜表面には、実質的にこのよ
うな免疫グロブリンが存在しないことが知られている。

しかして、本発明に係るＢリンパ球分離材は、水不溶性
固体物質表面に、免疫グロブリンと＾い親和性を有する
有機合成されたリガンドを固定化したことを特徴と、す
るものであるので、該Ｂリンパ球分離材を例えばリンパ
球懸濁液等のＢリンパ球含有液と接触させた際、細胞膜
表面に免疫グロブリンを有するＢリンパ球と極めて高い
親和力を示し、Ｂリンパ球はＢリンパ球分離材に極めて
高い確率で捕捉される。一方、細胞膜表面に免疫グロブ
リンを有しないＴリンパ球に対しては、親和力を示さず
、■リンパ球はＢリンパ球分離材に捕捉されない。従っ
て、分離材吸着分画と分離材非吸着分画とを分離するこ
とによってＢリンパ球とＴリンパ球を高純度、高収率で
得ることができるものである。

ざらに、本発明に係る別のＢリンパ球分離材は、水不溶
性固体物質表面にスペーサーを介して、免疫グロブリン
と高い親和性を有する有機合成されたリガンドを固定化
したことを特徴とするものであるので、該Ｂリンパ球分
離材を例えばリンパ球懸濁液と接触させた際、Ｂリンパ
球分離材は細胞膜表面に免疫グロブリンを有するＢリン
パ球に対して極めて高い親和力を示し、Ｂリンパ球はＢ
リンパ球分１ｉ１ｔ、ｉに極めて高い確率で捕捉される
。一方、細胞膜表面に免疫グロブリンを有しないＴリン
パ球に対しては、Ｂリンパ球分離材は親和力を示さず、
ざらに水不溶性固体物質表面と免疫グロブリンと高い親
和性を有する有機合成されたリガンドとの間に介在する
スペーサーが、その流動性や排除体積効果によって細胞
が分離材表面に接近して相互作用することを妨げるため
に、上記のようにＢリンパ球分離材との相互作用力の弱
いＴリンパ球の非特異的接着を抑制するために、■リン
パ球はＢリンパ球分離材に実質的に捕捉されない。

従って、分離材吸着分画と分離材非吸着分画とを分離す
ることによってＢリンパ球とＴリンパ球をより高純度、
高収率で得ることができるものである。

このため、例えば該Ｂリンパ球分離材を充填した液の出
入口を有するカラムにリンパ球懸濁液を一定速磨で注入
し、直ちに等張緩衝液などの洗浄液によってカラム内の
非吸着分画を洗い流すことで−「リンパ球が簡便、迅速
かつ大量に高純度、高収率で１ｑることかできる。この
ように本発明は、一種の吸着クロマトグラフィー的手法
を適用するものであるが、本発明のＢリンパ球分離材の
場合、従来のアフィニティークロマトグラフィーのごと
く、担体に抗体や免疫複合体を固定化した場合とは異な
り、Ｂリンパ球に対しては明確な親和性を有するが、生
物学的に特異性の高い刺激等はいっさい与えないという
特性を有するため、分離されたＴリンパ球およびＢリン
パ球はインタクトな状態を保持しているものである。ざ
らに、本発明のＢリンパ球分離材のこの様な親和性は、
動物種の由来に影響しないことも確められ、分離操作も
数分で完了し、また、リンパ球懸濁液の組成も単純等張
塩溶液でよくウシ胎児血清等の異種動物由来の濃厚血清
も必要がないというように、応用上における利点を数多
く有するものである。　以下、本発明を実施態様に基づ
きより詳細に説明する。

本発明のＢリンパ球分離材は、水不溶性固体物質表面に
、免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成された
リガンドを固定化したことを特徴とするものである。こ
のように免疫グロブリンと高い親和性を有するリガンド
としては、複素環式化合物類、ペプチド類およびアミノ
酸類などが挙げられ、これらはリガンドとして単独であ
るいは複数組合せて用いられる。

本発明において用いられる複素環式化合物類としては、
具体的には、五員複素環式化合物ではフランとその誘導
体、チオフェンとその誘導体およびジチオラン誘導体、
アゾール類など、また六員複素環式化合物ではピリジン
および関連化合物、キノリンおよび関連化合物、アクリ
ジンおよび関連化合物、ピリミジンおよび関連化合物、
ピランおよびピロンおよび関連化合物、また綜合環系複
素化合物では、フェノキサジン、フェノチアジン、プテ
リンおよびアロキサジン化合物など、ざらにポルフィリ
ン環系複素化合物では、プリン塩基、核酸、ヘミン、ク
ロロフィル、ビタミン８１２およびフタロシアニンなど
、その他アルカロイドなどが挙げられる。これらの複素
環式化合物のうちでは、化学療法剤およびその誘導体、
ピリミジン関連化合物、ピリジン関連化合物ならびにピ
ラジン関連化合物などが特に好ましい結果を与え、ざら
にサルファ剤、サルファ剤とＩ）Ｋ４．０〜９．０の色
素との化合物、２−チオウラシル、イソニコチン酸ヒド
ラジドおよびルミノールなどがより好ましい結果を与え
る。なおｐＫ４．０〜９．０の色素とは、エイチ、ジエ
イ、コーンズ　バイオロジカル　ステインズ、アール、
ディー、リトル。

ザ　ウイリアンス　アンド　ゥイルキンス　カンパニー
、バルチモア、　１９７７　［Ｈ，Ｊ、　Ｃ０ｎｎ’Ｓ
　ＢｉＯＩＯｇｉｃａｌ　　５ｔａｉｎｓ、　　Ｒ，Ｄ
、　　Ｌｉｔｔｌｅ、　　■ｈｅ　　ＷｉｌｌｉａｎＳ
　　＆　　Ｗｉｔｋｉｎｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｂａｌ
ｔｉｍｏｒｅ、１９７７］に記載されている各種指示薬
、組織化学用色素の内でｐＫ値が４゜０〜９．０のもの
をいう。色素はｐＫ値が免疫グロブリンＧの等電点にほ
ぼ等しいものが好ましく、ｐＫ値４．０〜９．０の範囲
がこれにあたる。さらにサルファ剤またはサルファ剤と
ｐＫ４．０〜９．０の色素との化合物の中では、サルフ
ァ剤がスルファチアゾール、スルファメチゾール、スル
フィツメゾールであり、ｐＫ４．０〜９．０の色素がラ
クモイド、ブリリアントイエロー、あるいはフェノール
レッドである場合が特に好ましい結果を与える。これら
のサルファ剤は、Ｎ１−異項環系化合物であり、複素環
がアゾール類に属し、それぞれチアゾール、２−メチル
チアゾール、２−メチルイソオキサゾールである。

本発明のＢリンパ球分離材において、免疫グロブリンと
高い親和性を有するリガンドとして好適に用いられる複
素環式化合物のピリジン、ピリミジン、アゾール類のへ
テロ原子は孤立電子対を有し、プロトンアクセプターと
して働く。また解離基の少ない複素環は疎水性を示す。

ざらにサルファ剤のスルフォンアミド部分、２−チオウ
ラシルのチオール基あるいは水酸基、イソニコチン酸ヒ
ドラジドの酸アミド部分、ルミノールのカルボニル基と
イミノ基は水素結合性を有している。この様に、Ｂリン
パ球細胞膜表面の免疫グロブリンと該化合物との相互作
用において、該化合物の主要部分の疎水性、ヘテロ原子
による静電特性、主要部分付近の水素結合性が、免疫グ
ロブリン分子鎖中の吸着サイトのアミノ酸残基とそれぞ
れ相互作用力を発揮し、加えて、該化合物の立体構造が
細胞膜表面の免疫グロブリン分子内ポケットに適度に当
てはまったために、非抗原／抗体系の高い親相性が得ら
れたものと考えられる。

また、本発明において用いられるペプチド類は、少なく
とも２個以上のアミノ酸がペプチド結合を介して得られ
る合成化合物であり、アミノ酸数２〜１０程度のオリゴ
ペプチドが好ましい結果を与える。ざらにこれらのオリ
ゴペプチドの中でも、免疫グロブリン分子と特異的な結
合性を有するプロティンＡ等の公知の天然物質の７フイ
ニテイーサイトを模倣したものが好ましく、特にリジン
、チロシンによるオリゴペプチド、あるいはアスパチル
フェニルアラニンメチルエステルなどのアスパチルフェ
ニルアラニンアルキルエステル等の化合物が極めて良好
な結果を与える。

これらのペプチド類に関しても、免疫グロブリン分子鎖
中の特定な疎水性サイトや荷電サイトとの相互作用によ
って非抗原／抗体系の高い親和性か得られたものと考え
られる。

また本発明において用いられるアミノ酸類は、単種のア
ミノ酸、あるいは２種以上のアミノ酸を同時に用いたも
のであり、疎水性のバリン、ロイシン、チロシン、フェ
ニルアラニン、イソロイシン、トリプトファンや、塩基
性のリシン、アルギニン、あるいは酸性のプロリンおよ
びアスパラギン酸およびその誘導体を単独あるいは複数
組合せて用いたものが特に良好な結果を与える。なおこ
れらの物質のり、１体の如何は問われない。

これらのアミノ酸類に関しても、先に述べたペプチド類
と同時に、免疫グロブリン分子鎖中の特定な疎水性サイ
トや荷電サイトとの相互作用によって、免疫グロブリン
を有するＢリンパ球と非抗原／抗体系の高い親和性が得
られたものと考えられる。

ざらに、以上述べたような有機合成されたリガンドは、
単独で用いてもＢリンパ球に対する親和性を十分に発揮
できるが、特に、アルギニン、アスパラギン酸、フェニ
ルアラニン、プロリン等のアミノ酸と複素環式化合物で
あるスルファチアゾールを同時にリガンドとして用いた
場合には、極めて良好な結果が得られる。また、上記に
列記したこのようなリガンドは、ヒト、ウシ、ラット由
来の免疫グロブリンに対して高い親和性を持つことから
、対象とする細胞の動物種の如何を問わないものである
可能性が高いものとなる。

本発明の−Ｔ＝８リンパ球分離相分離材て、このような
有機合成されたリガンドを固定化させる担体としての水
不溶性固体物質としては、アガロース系、デキストラン
系、セルロース系、ポリアクリルアミド系、ポリビニル
アルコール系、ポリビニルピロリドン系、ポリアクリロ
ニトリル系、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポ
リスチレン系、アクリル酸エステル系、メタクリル酸エ
ステル系、ポリエチレン系、ポリプロピレン系、ポリ４
−フッ化エチレン系、エチレン−酢酸ビニル共重合体系
、ボ、リアミド系、ポリカーボネート系、ポリフッ化ご
ニリデン系、ポリビニルホルマール系、ボリアリレート
系、ポリエーテルスルフォン系などの有機高分子、ガラ
ス系、アルミナ系、チタン系、活性炭系、セラミックス
系などの無機物などが挙げられるが、特に細胞接着性の
高すぎないもの、すなわち、細胞−担体間の相互作用が
比較的穏やかなものが好まれ、特に好ましくはアクリル
酸エステル系などが用いられる。また、生体由来の天然
有機高分子であるコラーゲン、キトサン等も用いられ得
る。このような水不溶性固体物質の形態としては、特に
限定されず、平板上のものも用いることができるが、好
ましくは、粒子状、特に平均粒径が０．０５〜５Ｉｒｙ
Ｊの粒子状のものが望ましい。なお平均粒径はＪ　ｌ５
−Ｚ−８８０１に規定されるフルイを用いて分級した後
、各板の上限粒径と下限粒径の中間値を各板の粒径とし
、その重量平均として搾出したものである。ざらに粒子
形状は細胞に物理的な損傷を与えにくいことや均一な粒
子を得やすい等の点から球形のものが好ましい。

本発明のＢリンパ球分離材において、上記のごとき水不
溶性固体物質表面に有機合成されたリガンドを固定化す
る方法としては、共有結合、イオン結合、物理的吸着、
包理あるいは担体表面への沈澱不溶化などあらゆる公知
の方法用いることができるが、固定化されたリガンドの
溶出性からみて、共有結合により固定、不溶化して用い
るのが好ましい。そのため一般に、固定化酵素、アフィ
ニティークロマトグラフィーの分野で用いられる公知の
不溶性担体の活性化法およびリガンドの固定化方法が、
好ましく用いられ得る。

本発明の別のＢリンパ球分離材は、水不溶性固体物質表
面にスペーサーを介して、免疫グロブリンと高い親和性
盆有する有機合成されたリガンドが固定化されているこ
とを特徴とするものである。

このＢリンパ球において用いられる免疫グロブリンと高
い親和性を有するリガンドとしては、上記に挙げたもの
と同様なものが用いられ、その作用も同様であり、また
このような有機合成されたリガンドを固定化させる担体
としての水不溶性固体物質としても、上記に挙げたちの
同様なものが用いられる。

本発明のこの別のＢリンパ球分離材において用いられる
スペーサーとは、分子状をなし、水不溶性固体物質表面
とリガンドとの間に介在して任意の長さを設けることが
できるものであればよく、水不溶性固体物質表面とリガ
ンドとの結合を立体的に阻害しない限り、どのような骨
格栴造をもつものでもよい。水不溶性固体物質表面とリ
ガンドとの間にこのようなスペーサーが介在していると
、スペーサーの流動性や排除体積効果によって、細胞が
分離材表面に接近して相互作用することが妨げられ、こ
の結果、分離材との相互作用力の弱いＴリンパ球の接着
が優先的に抑制されるものと考えられ、Ｔリンパ球の非
特異的接着を抑制する効果が生まれる。

このようなスペーサーは、少なくとも２個以上の炭素原
子を有する、疎水性の炭化水素鎖ないしは分子鎖に水酸
基、カルボキシル基等やエーテル　　′酸素などの特性
基を含む親水性の炭化水素鎖を骨格とするものであり、
またその分子鎖の両端に有していたエポキシ基やイソチ
オシアネート塁等の公知の反応性官能基を、水不溶性物
質表面およびリガンドのアミノ基やカルボキシル基にそ
れぞれ反応させて分子鎖の一端において水不溶性物質表
面に、他端においてリガンドに共有結合しているもので
ある。

スペーサー骨格としての疎水性の炭化水素鎖としては、
単純なメチレンの繰返しからなるアルキル鎖、このアル
キル鎖中に一部炭素二重結合やベンゼン環等の種々の環
式置換基が含まれるもの、ざらにはこのような分子鎖に
分岐があるものなどがあるが、好ましくはメチレンの繰
返しが４個以上、より好ましくはメチレンの繰返しが４
〜１０個の直鎖アルキル鎖が特にＴリンパ球の非特異的
接着を抑制するスペーサーとしての効果の高いものであ
る。またスペーサー骨格としての特性基を含む親水性の
炭化水素鎖としては、上記のアルキル鎖中に水Ｍ基、カ
ルボキシル基、あるいはアミノ基等の解離性の官能基を
有するものや、エーテル酸素を有するものなどがあり、
同様に炭素二重結合や環式置換基あるいは分子鎖の分岐
があっても構わないが、好ましくは重合度１〜５０、よ
り好ましくは重合度４〜３０のエヂレンオキサイド骨格
が、特にＴリンパ球の非特異的接着を抑制するスペーサ
ーとしての効果の高いものである。

なお水不溶性固体物質表面およびリガンドに共有結合し
て本発明のＢリンパ球分離材におけるスペーサーとなり
得る化合物の好ましい例としては、次に示すような構造
を有するものがあるが、もちろんこれらに限定されるも
のではない。

ＣＨ２−ＣＨＣＨ２０Ｒ’　０ＣＨ２ＣＨ−ＣＨ２Ｘ　
／　　　　　　　　　　　　　＼　／（■）［式中Ｒ１
は炭素数２〜２０個、好ましくはメチレンの繰返しが４
〜１０個の直鎖アルキルある。］Ｒ２Ｒ３ ＋　　　　　１　　　　　（ＩＩ） ［式中、Ｒ２、Ｒ３はそれぞれ水素または炭素数１〜４
個のアルキル基であり、またｎは０〜４９、より好まし
くは３〜２９の数である。］本発明のこの別のＢリンパ
球分離材を得るには、例えば、固定化酵素、アフィニテ
ィークロマトグラフィーの分野で用いられる公知の方法
に基づき、上記構造式（Ｉ）または（１１）で表わされ
るビスエポキシドのような両端に反応性官能基を有し、
スペーサーとして適度な鎖長の分子骨格を有する化合物
の該反応性官能基を、それぞれ水不溶性固体物質表面お
よびリガンドのアミノ基ヤカルボキシル基に反応させて
共有結合させればよく、免疫グロブリンに高い親和性を
有するリガンドはスペーサーを介して水不溶性固体物質
表面に共有結合により強固に結合されることとなる。

本発明のＢリンパ球の分離方法は、上記のごとき水不溶
性固体物質表面に免疫グロブリンＧと高い親和性を有す
る有機合成されたリガンドを固定化してなる分離材、ま
たは上記のごとき水不溶性固体物質表面にスペーサーを
介して免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成さ
せたリガンドを固定してなる分離材に、Ｂリンパ球含有
液を接触ざぜ、膜表面に免疫グロブリン分子（Ｓ−Ｉｏ
）を有するＢリンパ球を選択的に捕捉せしめることによ
り、Ｂリンパ球を効率よく分離するものである。

本発明のＢリンパ球の分離方法において処理対象として
用いられるＢリンパ球含有液としては、全血、全血を遠
心処理する等により得られた白血球分画、およびリンパ
球懸濁液などが含まれる。

リンパ球懸濁液は、末梢血あるいは組織液などのリンパ
球を含む細胞浮遊液から、血漿分離器あるいは遠心分離
装置等を用いてリンパ球分画を伯の血球成分から精製し
、このリンパ球分画を適当な溶液中に浮遊させることに
より調製される。リンパ球分画を浮遊させる溶液は、単
純な等張塩溶液であっても、また自己血清等を含むもの
であっても溝ねない。

本発明のＢリンパ球の分離方法において、リンパ球１濁
液等のＢリンパ球含有液とのＢリンパ球分離材との接触
は、平板状のＢリンパ球分子ｊｉ＋ＡにＢリンパ球含有
液を接触させて行なうことも可能であるが、水不溶性固
体物質表面上の有機合成されたリガンドの絶対母や十分
な細胞吸着スペースを獲得するという点から、粒子状の
Ｂリンパ球分離材を充填してなるカラムを有するＢリン
パ球分離器を用い、これにＢリンパ球含有液を通液する
ことにより好適に行なわれる。

この粒子状のＢリンパ球分離材を充填してなるカラムを
有するＢリンパ球分離器において、カラム容器を構成す
る材質としては、ポリプロピレン、ポリカーボネート、
ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の合成樹脂
、ガラスおよびステンレス等の金属などが使用できるが
、オートクレーブ滅菌が可能で取り扱いやすいポリプロ
ピレンやポリカーボネート等が特に好ましい。またこの
Ｂリンパ球分離器のカラムの出入口とＢリンパ球分離材
を充填した分離材層との間には、Ｂリンパ球含有液中の
細胞成分は通過するが分離材は通過できない網目を有す
るフィルターを備えていることが好ましく、このフィル
ターを構成する材質としては、生理学的に不活性で強度
の高いものであればよいが、特にポリエステル、ポリア
ミドであることが好まれる。

第１図は、本発明に係るＢリンパ球分離器の一実施例の
使用態様を示す模式図である。第１図に示すようにＢリ
ンパ球含有液としてのリンパ球を浮遊させたリンパ球懸
濁液１はＢリンパ球分離器の導入口９から、Ｂリンパ球
分離材５を充填されたカラム６内にポンプ２によって注
入される。なおりリンパ球分離材５は、フィルター４ａ
、４ｂによりカラム６内に保持されている。リンパ球懸
濁液１を注入後、洗浄液８をポンプ３でカラム６内に注
入し、カラム内に残留している非捕捉細胞をリンスし、
導出口１０より流出してくる処理液７を回収する。この
処理液７は、分離材非吸着分画であり、高純度、高収率
でＴリンパ球を含むものである。

Ｂリンパ球分離材５に捕捉された細胞（Ｂリンパ球）を
溶離することなく、捕捉されなかった細胞（Ｔリンパ球
）を洗い落とすために用いられる洗浄液８としては、等
張緩衝液、細胞培拾液等が用いられ、好ましくは２価カ
チオンフリーの等張Ｍｌｉ液、特に好ましくはハンクス
緩衝液（Ｈａｎｋ’５ｂａｌａｎｃｅｄ　５ａｔｔ　５
ＯＩＬｌｔｉＯｎ　：ＨＢＳＳ）などが用いられる。ま
たリンパ球懸濁液１の通液方法は、必要に応じて連続あ
るいは非連続にしてもよく、さらには一定時間のインキ
ュベーションを加えても構わない。

ざらにＢリンパ球分離材５に捕捉された細胞を回収する
場合には、洗浄′＆８により非捕捉細胞を洗浄除去した
後、Ｂリンパ球分離材５に捕捉された細胞とＢリンパ球
分離材５表面のリガンドとの結合力を適当な手段で弱め
てやればよく、例えば、アミノ酸、糖類あるいはアルブ
ミンを含む等張緩耐液等を溶離剤として用い、ざらにカ
ラム６に物理的振動を与えるなどして溶離剤を流し捕捉
細胞を溶離回収すればよい。

また、本発明のＢリンパ球の分離方法において、Ｂリン
パ球分離材に対するＴリンパ球の非特異的付着性を低下
させ、収率を向上させるために、公知のごとく、分離材
にウシ血清アルブミン等により処理を行なった後、Ｂリ
ンパ球分離操作を行なうことも可能である。

（実施例） 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。

実施例１ 水不溶性固体物質として、オキシラン基を有するアクリ
ルビーズ（オイパーキッドＣ（ＥＣ）。

レーム　ファル？　［Ｒ６ｈｍ　Ｐｈａｒｍａ　］社製
］（平均粒径０．１５ｏｎ）を用い、リガンドとして複
素環式化合物のスルファデアゾール（ＳＴ）を固定化し
たＢリンパ球選択捕捉型分離材を作成した。

まず、０．２Ｍの炭酸緩衝液（ｐ　Ｈ１０＞とジメチル
ホルムアミドの混合液（容旦比２：３）１００ｄ中に、
ｃ度ｏ、１ｖとなるようにスルファチアゾールを溶解し
た。該溶液中にオキシラン−アクリルビーズ（架橋性モ
ノマーの比率３０ｆｆｌｆｆｉ％）を０．１〜０．２Ｗ
Ｊ／ｄの割合で投入し脱気した。これを８０℃の水浴中
で３時間加温した後に、ブラッドミキサー（萱垣医理科
工業製、　ＢＭ−１０１＞を使用して室温で一晩撹拌し
た。次いで、未反応のオキシラン基を除去するために１
Ｍ（ｐＨ８＞のエタノールアミン溶液を添加し一晩撹拌
した。その後、蒸密水、塩化ナトリウム００５Ｍを含有
する０、０２Ｍ　（ｐＨ４＞の酢酸緩衝液、０．２Ｍ　
（ｐＨ１０）の炭酸緩衝液、で順次洗浄しスルファチア
ゾール固定化アクリルビーズ（ＥＣ−８Ｔ）を得た。

このようにして得られた分離材を、内径３．ｓ、外径４
ｍのテフロンチューブからなるカラムに充填し、該チュ
ーブの両端にポリエステル製フィルター（１５０メツシ
ユ）を有する端子を接続し、カラム内に吸着材を保持さ
せた。この吸着剤を充填したカラム内をハンクス緩衝液
（１−ＩＢｓｓ　：　Ｉ）Ｈ７，２，０ａ２”、Ｍｑ２
＋フリー）で置換し、続＜Ｔ、Ｂリンパ球分離操作に供
した。

一方リンパ球懸濁液は、ウィスター系ラットの腸間膜リ
ンパ節から単離されたリンパ球分画を、ＨＢＳＳを用い
て８００Ｘ１０４細胞／ｄに懸濁・希釈することによっ
て調製され、このリンパ球、懸濁液は水冷下で保存され
、希釈後１時間以内に使用された。

上記のごとき調製されたリンパ球懸濁液ｌｌｌ１１をデ
イスポーサブルシリンジとシリンジポンプ（ともにテル
モ株式会社製）によって、１〜３ｄ／分の流速で、分離
材を充填した上記カラムに注入し、直ちにＨＢＢＳを用
いて２ｍ／分の流速で同様にカラムに注入してカラム内
を洗浄し、分離操作を完了した。同数した処理液は自動
血球計数装置（オルソ　インスツルメンツ［ＯＲ丁ＨＯ
ＩＮＳ丁ＲＵＭＥＮ丁Ｓ］社製、ＥＬＴ−８＞を用いて
細胞密度を計測され、続いて処理液中のＢリンパ球のみ
をラットＩＱＧに対する抗体を結合させたＦＩＴＣ（マ
イルズ［ＨＩＬＥＳ　］社製）を用いて蛍光染色し、蛍
光顕微鏡によって処理液中のＢリンパ球をカウントし、
処理液中のＴ、Ｂリンパ球比を算出した。以上の操作に
よって、処理液中のＴリンパ球の収率（ｙ）と純度（ｐ
）、およびＢリンパ球に対する特異性を表す指標として
捕捉性（Ｓ　Ｒ）を得た。

結果を第１表に示す。

実施例２ 水不溶性固体物質として、オキシラン基を有するアクリ
ルビーズ（オイパーキッドＣ，レームフフルマ社Ｈにス
ルファチアゾールとアルギニン、アスパラギン酸、フェ
ニルアラニン、プロリンを１６：１：１：１の割合で混
合した混合液を用いて、実施例１と同様にして、スルフ
ァチアゾール、アルギニン、アスパラギン酸、フェニル
アラニン、プロリン固定化アクリルビーズ（ＥＣ−３Ｔ
Δ）を作成した。

このＥＣ−８ＴＡを用いて実施例１と同様にしてＴ、Ｂ
リンパ球分離操作を行なった。収率（ｙ）と純度（ｐ）
、および捕捉性（ＳＲ）に関して得られた結果を第１表
に示す。

実施例３ 水不溶性固体物質として架橋タイプのキトサンビーズ（
ｃｈｉｔｏｐｅａｒｌ　（ＣＩ−１）　、富士紡績■製
）（平均粒径０．２５Ｍ）を用いてスルファチアゾール
を固定化したＢリンパ球選択捕捉型分離材を作成した。

まず、水酸化ナトリウムでｐＨ７，０に調整した５ｗ／
ｖ％グルタルアルデヒド（ＧΔ）水溶液にキトサンビー
ズを浸して脱気した後、ブラッドミキサー（萱垣医理科
工業製、ＢＭ−１０１＞を用いて室温で一晩撹拌した。

蒸溜水で洗浄したこの反応物を、ジメチルホルムアミド
と１０ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐＨ８）の混液（容量
化２：３〉に溶解させた０、１Ｍスルファチアゾール溶
液に加えて脱気し、ブラッドミキサーで一晩撹拌した後
、ジメチルホルムアミドおよび蒸溜水でキトサンビーズ
を洗浄した。次に、未反応のアルデヒド基をブロッキン
グするために、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８＞溶液中
で脱気した後、ブラッドミキサーで一晩撹拌した。これ
を再び蒸留水で洗浄し、１　ｗ／ｖ％の水素化ホウ素ナ
トリウムを含む１０ｍＭ塩化カルシウム溶液（ｐＨ８＞
に加えて４°Ｃで反応させ、グルタルアルデヒドのアル
デヒド基とキトサンおよびスルファチアゾールのアミノ
基との反応によって生じたアゾメチン基を還元させて安
定化した。最後に蒸留水、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含
有する０、０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）、および０．２
Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨＩＯ）で数回洗浄して、スルフ１チ
アゾール固定化キトサンビーズ（ＣＨ−ＧＡＳＴ）を得
た。

このＣＨ−ＧＡＳＴを用いて、実施例１と同様にしてＴ
、Ｂリンパ球分離操作を行なった。収率（Ｖ）とＮ！度
（ｐ）、および捕捉性（ＳＲ）に関して得られた結果を
第１表に示す。

比較例１ 比較のためにリガンドを結合させていないアクリルビー
ズ（ＥＣ）を用いて、実施例１の手順に従い、Ｔ、Ｂリ
ンパ球分離操作を行なった。結果を第１表に示す。

比較例２ 比較のためにリガンドを結合させていないキトサンビー
ズ（ＣＨ）を用いて、実施例１の手順に従い、Ｔ、Ｂリ
ンパ球分離操作を行なった。結末を第１表に示ず。

これらの結果から明らかなように、免疫グロブリンに高
い親和性を有するリガンドを導入することによって８リ
ンパ球の捕捉性が著しく向上すること、それにともない
回収された細胞懸濁液中のＴリンパ球温度が高まること
がｖｌ認された。

実施例４ 実施例１と同様にして得られたスルファチアゾール固定
化アクリルビーズをカラム内に充填した後、カラム内に
０．５％ウシ血清アルブミンを注入し、１６時間放置後
、カラム内の遊離アルブミンを除去した。このようにし
てウシ血清アルブミンで処理したスルファチアゾール固
定化アクリルビーズ（ＡＥＣ−８Ｔ＞を用いて、実施例
１の手順に従いＴ、Ｂリンパ球分離操作を行なった。収
率（ｙ）、純度（ｐ）および捕捉性（ＳＲ）に関して得
られた結果を第１表に示す。

第１表に示す結果から明らかように、アルブミン処理を
施さなかったＥＣ−８Ｔ　（実施例１）と比較して、分
離効率において純度を低下させることなく２０％以上の
収率の向上が観察された。このことは吸着したアルブミ
ンがＢリンパ球−リガント間の親和性を低下させること
なく、Ｔリンパ球の非特異的付着性を抑制する界面活性
剤的効果を発揮したためと考えられる。

なお、収率（ｙ）、純度（ｐ＞および捕捉性（ＳＲ）は
以下のようにして算出された。

さらに、本発明に係るＴ、Ｂリンパ球分離材（実施例１
〜４）においては、分離材１ｇ当り少なくとも１．０Ｘ
１０７〜６．０Ｘ１０７個程度のリンパ球を処理するこ
とが可能で、それに要する処理時間が約２分／カラムで
あり、しかも生存性、接着形態の而からみても際だった
細胞損傷も一切ないものであった。

実施例５ ｐｆ−１７，４のリン酸緩衝生理食塩水で１０（８希釈
して調製した５　ｗ／ｖ％グルタルアルデヒド溶液を用
いる以外は、実施例３と同様にして架橋タイプのキトサ
ンビーズにスルファチアゾールをグルタルアルデヒドを
用いて結合・固定化したスルファチアゾール固定化キト
サンビーズ（ＣＨ−Ｇ　ＡＳＴ）を得た。

このようにして得られた分離材を、内径３Ｍ、外径４ｍ
のテフロンチューブからなるカラムに充填し、該チュー
ブの両端にポリエステル製フィルター（１５０メツシユ
）を有する端子を接続し、カラム内に分離材を保持させ
た。この分＃ｉ材を充填したカラム内をハンクス緩衝液
（ＨＢＳＳ：　ｐ２十 Ｈ７，２，Ｃａ　　、ＩＶｔＱ２＋Ｖｔ−）で置換し、
続く王、Ｂリンパ球分離操作に供した。

一方、対象とするリンパ球を、ヒト末梢血からフィコー
ルパック（比重１，０７７、ファルマシア社製）を用い
た比重遠心分離によって採取し、ＨＢＢＳを用いて８０
０Ｘ１０４細胞／ｄに懸濁・希釈することによってリン
パ球懸濁液を調製した。

上記のごとく調製されたリンパ球懸濁液１ｄをディスポ
ーサブルシリンジとシリンジポンプ（ともにテルモ株式
会社製）によって、第２表に示す一定流速で、分離材を
充填した上記カラムに注入し、直ちにＨＢＢＳを用いて
第２表に示す一定流速で同様にカラムに注入してカラム
内を洗浄し、分離操作を完了した。回収されたリンパ球
懸濁液の細胞数を自動血球計数装置（オルソ　インスツ
ルメンツ［０ＲＴＨＯｌＮ５ＴＲ聞ＥＮＴ’Ｓコ社製、
ＥＬＴ−８）で測定し、続いて回収液中のＢリンパ球の
みを、ヒト免疫グロブリンに対する抗体を結合させたＦ
ＩＴＣ（マイルズ［ＭＩＬＥＳ］社製）で螢光染色を施
し、螢光顕微鏡によって回収液中のＦＩＴＣ陽性細胞を
カウントし、ＦＩＴＣ染色細胞（ＦＩＴＣ（＋））とＦ
ＩＴＣ非染色細胞（ＦＩＴＣ（−）　）がカラム中に捕
捉される割合を求めた。結果を第２表に示す。

実施例６ 水不溶性担体としての架橋タイプのキトサンビーズ（Ｃ
Ｈ）にリガンドとしてアスパラギン酸とフェニルアラニ
ンからなるジペプチドであるα−し一アスパチルフェニ
ルアラニンメチルエステル（Ａ　Ｔ、味の素（株）製）
をグルタルアルデヒドを用いて結合・固定化したＢリン
パ球分離材を作成した。なおこのＢリンパ相分１ｄｌ＋
ＪはＣ）ｌ　−Ｇ　ＡＡＴと呼称した。

まず、ＤＨ７，４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で
１０倍希釈して調製した５ｗ／ｖ％グルタルアルデヒド
溶液に、キトサンビーズを浸して脱気した後、ブラッド
ミキサー（萱垣医理科工業装：ＢＭ−１０１）を用いて
室温で撹拌した。＠留水で洗浄したこの反応物を、α−
Ｌ−アスパナルフェニルアラニンメチルエステルをリン
酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）　、ｐＨ７，４に溶解させ
た０゜１Ｍα−Ｌ−７スパチルフエニルアラニンメチル
エステル溶液に加えて脱気し、ブラッドミキサーで一晩
撹拌した。

次に、このキトサンビーズを洗浄した後、未反応のアル
デヒド基をブロッキングするために、１Ｍエタノールア
ミン（ｐＨ８＞溶液中で１８２気した後、ブラッドミキ
υ−で一晩撹拌した。これを再び蒸留水で洗浄し、１　
ｗ／ｖ％の水素化ホウ素ナトリウムを含む１０ｍ〜１塩
化カルシウム溶液に加えて４°Ｃで反応させ、グルタル
アルデヒドのアルデヒド基とキトサンおよびα−し一ア
スパチルフェニルアラニンメチルエステルのアミノ基と
の反応によって生じたアゾメチン基を）！元ざぜて安定
化した。最後に、蒸留水、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含
む０．０２酢酸緩衝液（ｐＨ４＞、および０゜２Ｍ炭酸
緩衝液（ｐＨ１０＞で数回洗浄してグルタルアルデヒド
を用いてα−Ｌ−アスパチルフェニルアラニンメチルエ
ステルを固定化したキトサンビーズ（ＣＨ−ＧＡＡＴ）
を得た。

このようにして得られた分離材ＣＨ−ＧＡＡＴを用いて
実施例５と同様にしてＴ、Ｂリンパ球分離操作を行なっ
た。結果を第２表に示す。

実施例７〜８ 不溶性担体としての架橋タイプのキト１ノ゛ンビーズ（
Ｃ’Ｈ”）にリガンドとしてスルファチアゾール（ＳＴ
）またはα−し一アスパチルフェニルアラニンメチルエ
ステル（ＡＴ＞をエピクロルヒドリン（ＥＨ）を用いて
結合・固定化したＢリンパ球分離材を作成した。なおこ
のＢリンパ球分離材はそれぞれＣｌ−１−Ｅｌ−１３Ｔ
（実施例７）およびＣＨ−Ｅｌ−ＩＡＴ（実施例８）と
呼称した。

まず、２ＭのＮａＯＨとエピクロルヒドリンを４：１の
割合で混合し、蒸留水で５１８に希釈した溶液にキトサ
ンビーズを加え、ブラッドミキサー°−を用いて４０〜
４５℃で２時間撹拌した。蒸留水で洗浄したこの反応物
を、ＤＭＦと１０ｎ　Ｍ塩化カルシウム溶液の混液（２
：３）に溶解させた００１Ｍスルファチアゾール溶液ま
たはＰＢＳ　（ｐＨ７，４）に溶解させた０、ＩＭα−
Ｌ−７スパチルフエニルアラニンメチルエステル溶液に
０．１〜０．７Ｑ／ｌｄの割合で加えて脱気し、ブラッ
ドミキサーを用いて室温で一晩撹拌した。

次に、未反応のオキシラン基を７０ツキングするために
濃度ＩＭ　（ｐＨ８＞のエタノールアミン溶液を添加し
、−晩撹拌した。その後、蒸留水、塩化ナトリウム０．
５Ｍを含む濃度０．０２Ｍ（ｐＨ４）の酢酸緩衝液、濃
度０．２Ｍ（ｐＨ１０）の炭酸緩衝液で順次洗浄しスル
ファチアゾール固定化キトサンビーズ（Ｃ：Ｈ−ＥＨ３
Ｔ＞およびα−Ｌ−アスパチルフェニルアラニンメチル
エステル固定化キトサンビーズ（ＣＨ−Ｅ）−ＩＡＴ）
を得た。

このようにして得られた分離材ＣＨ−Ｅ　）−１Ｓ　Ｔ
およびＣＨ−ＥＨ３Ｔを用いて、リンパ球懸濁液注入速
磨および洗浄速度を第２表に示ず以外は実施例５と同様
にしてＴ、Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第２
表に示す。

比較例３〜４ 比較のために架橋タイプのキトサンビーズ（Ｃ１」）を
そのまま分離材として用いて、第２表に示づリンパ球懸
濁液注入速磨および洗浄速庶にて実施例５と同様にして
Ｔ、Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第２表に示
す。

第２表 実施例５　Ｃ３−ＧＡＳＴ　　　１５０　１２０　　８
５　　５８ＩＩ　　６　ＣＨ−ＧＡ＾Ｔ　　１５０　１
２０　６４　　８比較例３　　ＣＨ１５０１２０３７２
０実施例７　ＣＨ−ＥＨ１１４０１２０７８３６ＩＩ　
　　　Ｂ　　ＣＩ−ＥＨ八へ　　　　　４０　　　１２
０　　　　７７　　　　１Ｂ比較例４　　ＣＨ４０１２
０６１３９ 第２表に示す結果から明らかなように、本発明に係るＢ
リンパ球分離材（実施例５〜８）は、第１表に示す結果
と同様に８リンパ球を優先的に捕捉する分離材として有
効であることがわかった。

また、実施例５〜８に係るＢリンパ球分離材においても
、生存性、接着形態の面からみても際だった細胞損傷の
一切ないものであった。

実施例９ ポリエチレンオキサイド鎖を有するビスエポキシド（Ｅ
Ｇ２２．ナガセ化成工業（Ｉｎ！＞（エチレンオキサイ
ド繰返し度２２）をスペーサーとして用い、オキシラン
基を有するアクリルビーズ（オイパーギッドＣ（ＥＣ）
　、レーム　ファルマ［Ｒ６ｈｍ　Ｐｈａｒｍａ　］社
製）　（平均粒径０．１５ｍ＞　に’）ガントとして複
素環式化合物であるスルファチアゾール（ＳＴ）を結合
・固定化してＢリンパ球分離材を作成した。なおこのＢ
リンパ球分離材はＥＣ−ＥＧ２２ＳＴと呼称した。

まず、炭酸緩衝液（ｐＨ１０＞に溶解した０゜２Ｍの１
，３−プロパンジアミン溶液に、蒸溜水で予め洗浄した
ＥＣ３０９を加え脱気した後、８０℃の水浴中で３時間
反応させた。そしてブラッドミキサー（萱垣医理科工業
Ｒ製、ＢＭ−１０１）を用いて室温にて一晩撹拌し、蒸
留水で洗浄した。

次に、このようにしてアミノ基を導入したＥＣ１８９（
湿ｆＡ重量）を、炭酸緩衝液（ｐＨ１０）を用いて作成
した１０％（ｗ／ｖ）ＥＧ２２溶液に加え、全醋を１０
０ｄとし、ブラッドミキサーで一晩回転混合した後、８
０℃の水浴中で１時間反応させ、蒸留水で洗浄した。こ
れを再び炭酸緩衝液（ｐＨ１０＞とジメチルホルムアミ
ドの混合液（容量比２：３）−を用いたＯ、１Ｍスルフ
ァチアゾール溶液１０〇−中に加え、８０℃の水浴中で
３時間反応させ、ブラッドミキサーで一晩回転混合した
。さらに、未反応のオキシラン基をブロッキングするた
めに、ｍ度ＩＭ　（ｐＨ８）のエタノールアミン１００
ＩＩｄｌを添加し、−晩撹拌した。その後、蒸留水、塩
化ナトリウム０．５Ｍを含む濃度０．０２Ｍ　（ｐＨ４
＞の酢酸緩衝液、ａ度０゜２Ｍ（１１１０）の炭酸緩衝
液で順次洗浄し、ポリエチレンオキサイド鎮を介してス
ルファチアゾールを固定化したアクリルビーズ（ＥＣ−
ＥＧ２２ＳＴ）を得た。

このようにして得られた分離材を、内径３＃ｌ１１１１
外径４Ｈのテフロンチューブからなるカラムに充填し、
該チューブの両端にポリエステル製フィルター（１５０
メツシユ）を有する端子を接続し、カラム内に分離材を
保持させた。この分離材を充填したカラム内をハンクス
緩衝液（ｔ−ＩＢｓｓ：Ｃ２十 Ｈ７，２，Ｃａ　　、ＭＱ２”７リー）で置換し、続＜
Ｔ、Ｂリンパ球分離操作に供した。

一方、対象とするリンパ球を、ヒト末梢血からフィコー
ルパック（比重１，０７７、ファルマシア社製）を用い
た比重遠心分離によって採取し、トＩＢＢｓを用いて８
００Ｘ１０４細胞／ｎ認にＩＩ、濁・希釈すること、に
よってリンパ球！Ｊ！濁液を調製した。

上記のごとく調製されたリンパ球懸濁液１ｄをディスポ
ーサブルシリンジとシリンジポンプ（ともにテルモ株式
会社製）によって、第３表に示す一定流速で、分離材を
充填した上記カラムに注入し、直ちにＨＢＢＳを用いて
第３表に示す一定流速で同様にカラムに注入してカラム
内を洗浄し、分離操作を完了した。回収されたリンパ球
懸濁液の細胞数を自動血球計数装置（オルソ　インスツ
ルメンツ［０ＲｒＨＯＩＮＳ丁ＲＵ）ＩＥＮＴｓ　］］
社製、ＥＬＴ−８で測定し、続いて回収液中のＢリンパ
球のみを、ヒト免疫グロブリンに対する抗体を結合させ
たＦＩＴＣ（マイルズ［ＭｉＬＥＳ１社製）で螢光染色
を施し、螢光顕微鏡によって回収液中のＦＩＴＣＩ性細
胞をカウントシ、ＦＩＴＣＩ色細胞（ＦＩＴＣ（十））
とＦＩ丁丁卯非染色細胞ＦＩＴＣ（−）　）がカラム中
に捕捉される割合を求めた。結果を第３表に示す。

比較例５ 比較のために、オキシラン基を有するアクリルビーズ（
オイパーギットＣ（ＥＣ）、’Ｌ−−ム　ファルマ社製
）をそのまま分離材として用いて、実施例９の手順に従
い、Ｔ、Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第３表
に示す。

実施例１０ ポリエチレンオキサイド鎖を右するヒスエポキシド（Ｅ
Ｇ２２．ナガセ化成工業■製）をスペーサーとして用い
、架橋タイプのキトサンビーズ（ｃｈｉｔｏｐｅａｒｌ
　（ＣＨ）　、富士紡績（４勾礼装）（平均粒径０．３
ｍ）にリガンドとしてスルフ７ヂアゾール（ＳＴ）を結
合・固定化してＢリンパ球分離材を作成した。なおこの
Ｂリンパ球分離材はＣＨ−ＥＧ２２ＳＴと呼称した。

まず、予め蒸留水で洗浄した３０ｇ（湿潤重儀）のキト
サンビーズを、炭酸緩衝液（ｐＨ１０＞を用いて調製し
た１０％（ｗ／ｖ）ＥＧ２２溶液に１１口え、全問を１
００ｍとし、ブラッドミキサーで一晩回転混合２合した
後、８０’Ｃの水浴中で１時間反応させ、蒸留水で洗浄
した。これを再び炭Ｖ綴衝液（ｐＨ１０）とジメチルホ
ルムアミドの混合液（容は比２：３）を用いた０、１Ｍ
スルファチアゾール溶１１００ｍｌ中に加え、８０’Ｃ
の水浴中で３時間反応させ、ブラッドミキサーで一晩回
転混合した。さらに、未反応のオキシラン基をブロッキ
ングするために濃度ＩＭ　（ｐＨ８＞のエタノールアミ
ン１００＆！を添加し一晩撹拌した。その後、蒸留水、
塩化すトリウム０．５Ｍを含む濃度０゜０２Ｍ（ｐＨ４
）の酢酸緩衝液、濃度０．２Ｍ（ｐＨ１０）の炭酸緩衝
液で順次洗浄し、スルファチアゾールを固定化したキト
サンビーズ（ＣＨ−ＥＧ２２ＳＴ）を得た。

このようにして得られた分離材ＣＨ−ＥＧ２２ＳＴを用
いて、実施例９と同様にしてＴ、Ｂリンパ球分離操作を
行なった。結果を第３表に示す。

比較例６ 比較のために架橋タイプのキトサンビーズ（ｃｈｉｔｏ
ｐｅａｌ、　（ＣＨ）富士紡績■社製）をそのまま分離
材として用いて、実施例９の手順に従い、Ｔ。

Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第３表に示す。

第１り 流速（ｄ／ｈ）捕捉率（′ｇ） ＦＩＴＣＦＩＴＣ 分離材ム肚皿ヨ 実施例９　　ＥＣ−ＥＧ２２ＳＴ　　　２０　　６０　
　６６　　　Ｂ比較例５　　ＥＣ２０６０９２８Ｂ 実施例１０　　ＣＨ−ＥＧ２２ＳＴ　　　２０　　６０
　　７５　　７比較例６　　ＣＨ２０６０６７５２ 第３表に示す結果から明らかなように、各分離条件にお
いて、スペーサーを介してスルファチアゾールを結合し
た分離材（実施例９〜１０）は、リンパ球そのものの接
着性を著しく低下させるとともに、Ｂリンパ球に対する
高い親和性を損なうことなくＴリンパ球の非特異的接着
を抑制し、高精度なＴ、Ｂリンパ球選択性を有するもの
であった。さらにこのような高度の選択性の発現は、水
不溶性固体物質がアクリルビーズ（ＥＣ）である場合で
もキトサンビーズ（ＣＨ）である場合でも観察され、Ｔ
、Ｂリンパ球選択性は水不溶性固体物質の種類に依存し
ないことが確認された。

実施例１１〜１２ スペーサーとしてエチレンオキサイドの繰返し麿が１の
エチレンオキサイド鎖を有するビスエポキシド（ＥＧｌ
、ナガセ化成工業■製）（実施例１１）または繰返し度
が９のヒスエポキシド（ＥＣ９，ナガセ化成工業（ｌ’
ｌ製＞（実施例１２）を用いる以外は実施例９と同様に
してエチレンオキサイド鎖を介してスルファチアゾール
を固定化したアクリルビーズを作成した。なお得られた
Ｂリンパ球分離材はそれぞれＥＣ−ＥＧＩＳＴ、（実施
例１１　＞、Ｉ：Ｃ−ＥＣ９ＳＴ　（実施例１２）と呼
称した。　この分離材ＥＣ−ＥＧＩＳＴまたはＥＣ−Ｅ
Ｃ９ＳＴを用いてリンパ球懸濁液注入速度および洗浄速
度を第４表に示す速度とする以外は実施例９と同様にし
て、Ｔ、Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第４表
に示す。

実施例１３ 実施例９と同様にしてＥＣ−ＥＧ２２ＳＴを作成し、こ
の分離材を用いてリンパ球Ｕ！濁液注入速度および洗浄
速度を第４表に示す速度とする以外は実施例９と同様に
して、Ｔ、Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第４
表に示す。

実施例１４〜１５ スペーサーとしてメチレンの繰返し度が４の１．４−ブ
タンジオールジグリシジルエーテル（ＭＥ４　、東京化
成＠製）　（実施例１４）またはメチレンの繰返し度が
６の１．６−ヘキザンジオールジグリシジルエーテル（
ＭＥ６．東京化成■装）（実施例１５）を用い、その溶
液として炭酸緩衝液（ｐＨ１０＞とジメチルホルムアミ
ドの混合液（容」比９：１）を用いて調製した１　０　
（ｗ／ｖ　）％　Ｍ　Ｅ　４溶液、炭ｒｔｉ緩衝液（ｐ
Ｈ１０）、ジメチルホルムアミドおよび蒸菌水の混液（
容旦比２：２：１）を用いて調製した１０（ｗ／ｖ）％
ＭＥ６溶液とする以外は実施例９と同様にしてポリエチ
レン鎖を介してスルファチアゾールを固定化したアクリ
ルビーズを作成した。なお得られたＢリンパ球分離材は
それぞれＥＣ−ＭＥ４ＳＴ　（実施例１４）、ＥＣ−Ｍ
Ｅ６ＳＴ　（実施例１５）と呼称した。

この分離材ＥＣ−ＭＥ４ＳＴまたはＥＣ−ＭＥ６ＳＴを
用いてリンパ球懸濁液住人速度および洗浄速度を第４表
に示す速度とする以外は実施例９と同様にして、Ｔ、Ｂ
リンパ妹分ｔｄｔ操作を行なった。結果を第４表に示す
。

（以下余白） 第４表に示す結果から明らかなように、スペーサを介し
てスルファチアゾールを結合した分離材は、Ｂリンパ球
に対する高い親和性を損なうことなくＴリンパ球の非特
異的接着を抑制し、高精度なＴ、Ｂリンパ球分離能を維
持することがわかり、特にＥＧ９　（実施例１２）、Ｅ
Ｇ２２（実施例１３）およびＭＥ４　（実施例１４）を
スペーサとして用いたものは際だったＴ、Ｂ選択性を示
した。

実施例１６ スペーサーとしてエチレンオキサイドの繰返し度が１の
エチレンオキサイド鎖を有するヒスエポキシド（ＥＧｌ
、ナガセ化学工業（株）製）用い、その溶液として炭酸
緩衝液（ｐＨ１０）とジメチルホルムアミドの混液（容
旦比９：１）を用いて調製した１　０　（ｗ／ｖ）％Ｅ
Ｇ１溶液とする以外は実施例１０と同様にして、エチレ
ンオキ１ノイド鎖を介してスルファチアゾールを固定化
したキトサンビーズを作成した。なお得られたＢリンパ
球分離材はＣＨ−ＥＧＩＳＴと呼称した。

この分離材ＣＨ−ＥＧ１ＳＴを用いてリンパ球懸濁液注
入速度および洗浄速度を第５表に示す速度とする以外は
実施例１０と同様にしてＴ、Ｂリンパ球分離操作を行な
った。結果を第５表に示す。

実施例１７ スペーサーとしてエチレンオキサイド鎖を３本有する３
官能性のトリエポキシド（ＥＧ３、ナガセ化成工業（株
）製）を用いる以外は、実施例１０と同様にしてエチレ
ンオキサイド鎖を介してスルファチアゾールを固定化し
たキトサンビーズを作成した。なお得られたＢリンパ球
分離材はＣＨ−ＥＧ３ＳＴと呼称した。

この分離材ＣＨ−ＥＧ３ＳＴを用いて、リンパ球懸濁液
注入速度および洗浄速度を第５表に示す速度とする以外
は実施例１０と同様にしてＴ、　Ｂリンパ球分離操作を
行なった。結果を第５表に示す。

実施例１８ スペーサーとしてエチレンオキサイドの繰返し度が９の
ポリエチレンオキサイド鎖を有するヒスエポキシド（Ｅ
Ｇ９、ナガセ化成工業（株）製）を用いる以外は実施例
１０と同様にして、ポリエチレンオキサイド鎖を介して
スルファチアゾールを固定化したキトサンビーズを作成
した。なお得られたＢリンパ球分離材はＣＨ−ＥＧ９Ｓ
Ｔと呼称した。

この分離材ＣＨ−Ｅ　Ｇ　９　Ｓ　Ｔを用いて、リンパ
球懸濁液注入速度および洗浄速度を第５表に示す速度と
する以外は実施例１０と１ｆｆｉ１様にして、Ｔ。

Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第５表に示ず。

実施例１９ 実施例１０と同様にしてＣＨ−Ｅ　Ｇ　２２　Ｓ−ｒを
作成し、この分ｖｉ材を用いて、リンパ球懸［液注入速
度および洗浄速度を第５表に示ず速庭とする以外は実施
例１０と同様にしてＴ、Ｂリンパ球分離操作を行なった
。結果を第５表に示す。

実施例２０〜２１ スペー１）としてメチレンの繰返し度が４の１．４−ブ
タンジオールジグリシジルエーテル（ＭＥ４、東京化成
（株）製）（実施例２０）またはメチレンの繰返し度が
６の１．６−ヘキサンシオールジグリシジルエーテル（
ＭＥ６．東京化成（株）製）（実施例２１）を用い、そ
の溶液として炭Ｍ緩衝液（ｐＨ１０）を用いて調製した
１　０　（ｗ／ｖ）％ＭＥ４溶液、炭ｔｉ緩衝液（ｐＨ
１０）、ジメチルホルムアミドおよび蒸留水の混合液（
容量比２：２：１）を用いて調製した１　０　（ｗ／ｖ
　）％ＭＥ６溶液とする以外は実施例１０と同様にして
、ポリメチレン鎖を介してスルファチアゾールを固定化
したキトサンビーズを作成した。なお得られたＢリンパ
球分離材はそれぞれＣＩ−１−ＭＥ４ＳＴ（実施例２０
＞、ＣＨ−ＭＥ６ＳＴ　（実施例２１）と呼称した。

この分離材ＣＨ−ＭＥ４ＳＴまたはＣＨ−ＭＥ６ＳＴを
用いて、リンパ球懸濁液注入速度および洗浄速度を第５
表に示す速度とする以外は実施例１０と同様にして、Ｔ
、Ｂリンパ球分離操作を行なった。結果を第５表に示す
。

第５表に示す結果から明らかなように、スペーサーを介
してスルファチアゾールを結合した分離材は、第５表に
示す結果と同様に、Ｂリンパ球に対する高い親和性を損
なうことなくＴリンパ球の非特異的接着を抑制し、高精
度なＴ、Ｂリンパ球分離能を維持することがわかり、持
にＥＧ２２（実施例１９）、ＭＥ４（実施例２０＞およ
びＭＥ６（実施例２１）をスペーサとして用いたものは
、１０％に満たないＦ　ＩＴＣ（−）の捕捉率とＦ　Ｉ
ＴＣ（＋）の捕捉率が８０％という際だった選択性を示
した。

実施例２２〜２５ 比不遠心分離法によってヒト抹潤血より得られたリンパ
球分画には主としてＴリンパ球およびＢリンパ球の他、
単球あるいはヌル細胞等の不純物が存在することから、
これらの非Ｔ、Ｅ３リンパ球系細胞（Ｎ）の混入をベル
オキシダー＋ｉ染色法、イムノビーズ法によって評価し
た。すなわち、実施例９と同様にして得られたＥＣ−Ｅ
Ｇ２２ＳＴ、実施例１０と同様にして得られたＣＨ−Ｅ
Ｇ２２ＳＴ、実施例２０と同様にして得られたＣＨ−Ｍ
Ｅ４ＳＴ、または実施例２１と同様にして１ｑられたＣ
Ｈ−ＭＥ６ＳＴを用いて、リンパ球懸濁液の注入速度お
よび洗浄速度を第６表に示す速度で行なう以外は実施例
９と同様にしてＴ、Ｂリンパ球分離操作を行ない、分離
操作前後のリンパ球懸濁液中の非Ｔ、Ｂリンパ球系細胞
（Ｎ）の混入の割合を上記方法により評価し、さらに分
離操作によって回収されたＴリンパ球の収率および純度
を上記の評価方法から算出し、正確な分離精度を得た。

結果を第６表に示す。

（以下余白） 第６表に示す結果から明らかなように、本発明に係るＴ
、Ｂリンパ球分離材はいずれも極めて高いＴ、Ｂリンパ
球選択性を有し、Ｔリンパ球の収率、純度もそれぞれ８
０〜９５％、９０〜９５％という際だった値が示され、
またこの様な分離能は非Ｔ、Ｂ系細胞の混入にも影響さ
れないことが同時に確認された。

実施例２６〜２８ まず実施例１６と同様にしてＣＩ−（−ＥＧｌＳＴを、
実施例１８と同様にしてＣＨ（−ＥＧ９ＳＴを、および
実施例１０と同様にしてＣＨ−ＥＧ２２Ｓ丁を作成した
。

これらの分離材を用いて、第７表に示すリンパ球懸濁液
注入速度および洗浄速度にて実施例９における手順に従
い、ラット腸間膜リンパ節から調製されたリンパ球懸濁
液およびヒト末梢血リンパ球懸濁液に対してＴ、Ｂリン
パ球分離操作を行なった。なおラット由来のリンパ球の
蛍光染色にはラット免疫グロブリンＧに対する抗体を結
合させたＦＩＴＣを用いた。結果を第７表に示す。

第７表 ラット 実施例２６　　Ｃ１１−ＥＧＩＳＴ　　　　４０　１２
０　　６７　　１５／ｌ　２７　Ｃ１−ＥＧ９ＳＴ　　
　４０　１２０　、６２　１６／ｌ　２８　Ｃ１−ＥＧ
２２ＳＴ　　４０　１２０　６４　１３ヒ　　　　１〜 実施例２６　　ＣＨ−ＥＧｌＳＴ　　　　２０　　６０
　　８６　　２８＃　２７　Ｃ１１−ＥＧ９ＳＴ　　　
２０　６０　６３　１６／、　２８ＣＨ−ＥＧ２２ＳＴ
　　２０　６０　６９　７第７表に示ず結果から明らか
なように、米発明に係るＴ、［３リンパ球分離祠はいず
れもラットおよびヒト由来のリンパ球に対して極めて高
いＢリンパ球親和性を有することが示された。このこと
から免疫グロブリンＧに対して親和性を有するリガンド
をスペーサーを介して固定した本発明のＴ。

Ｂリンパ球分離材は、分離するリンパ球の動物種に影響
されないＢリンパ球親和性を有するでおろうことが推定
された。

さらに本発明に係るＴ、Ｂリンパ球分離材（実施例９〜
２８）においては、分離材１ｇ当り少なくとも１．０Ｘ
１０７〜６．０Ｘ１０７′個程度のリンパ球を処理する
ことが可能で、それに要する処理時間が１０分以内であ
り、しかも生存性、接着形態の面からみても際だった細
胞損傷も一切ないものであった。

（発明の効果） 以上述べたように、本発明は、水不溶性固体物質表面に
免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成されたリ
ガンドを固定化したことを特徴とするＢリンパ球分離材
であるから、仲壽４叫Ｂリンパ球のみを選択的に捕捉分
離でき、例えば末梢血あるいは生体組織から得られるリ
ンパ球分画から、■リンパ球とＢリンパ球を簡便かつ迅
速に高収率、高純度で分離することが可能であり、しか
も分離されたＴリンパ球およびＢリンパ球の機能的損傷
も少ないことから、免疫機能に関係した疾患の診断、治
療やリンパ球由来の生理活性物質を得るための基礎技術
に応用できるものである。さらに本発明のＢリンパ球分
離材において、有機合成されたリガンドが、複素環式化
合物類、ペプチド類およびアミノ酸類からなる詳から選
ばれたものである場合、より望ましくは複素環式化合物
類が、化学療法剤およびその誘導体、ピリミジン関連化
合物、ピリジン関連化合物ならびにピラジン関連化合物
からなる群から選ばれたもの、さらに望ましくは複素環
式化合物類が、サルファ剤、サルファ剤とＯＫ４．０〜
９．０の色素との化合物、２−チオウラシル、イソニコ
チン酸ヒドラジドおよびルミノールからなる群から選ば
れたものであり、また望ましくはペプチド類がアミノ酸
数２〜１０程度のオリゴペプチド、ざらに望ましくはオ
リゴペプチドが、リジン、チロシンによるオリゴペプチ
ドあるいはアスパチルフ？ニルアラニンアルキルエステ
ルであり、また望ましくはアミノ酸類がバリン、ロイシ
ン、チロシン、フェニルアラニン、イソロイシン、トリ
プトファン、リジン、アルギニン、プロリンおよびアス
パラギン酸ないしその誘導体からなる群から選ばれたア
ミノ酸を単独あるいは複数組合せたものである場合、あ
るいはまた有機合成されたリガンドが、アルギニン、ア
スパラギン酸、フェニルアラニン、プロリンとスルファ
チアゾールを組合せてなるものである場合、より高純度
、高収率で安全性高くＴリンパ球およびＢリンパ球を得
ることができるものとなり、さらに、水不溶性固体物質
が平均粒径０．０５〜５ｍｍ１Ｉ１１の粒子体であり、
有機合成されたリガンドが、水不溶性固体表面に共有結
合により固定化されているものであるとより安定化して
効率よ（Ｂリンパ球を分離することが可能となる。

また本発明は、水不溶性固体物質表面に免疫グロブリン
と高い親和性を有する有機合成されたリガンドを固定化
してなる分離材に、Ｂリンパ球含有液を接触させ、膜表
面に免疫グロブリン分子（Ｓ−Ｉｇ）を有するＢリンパ
球を選択的に捕捉せしめることを特徴とするＢリンパ球
の分離方法であるから、濃厚血清や生理活性物質を用い
ることなく、簡便に精度の高いＢリンパ球分離を行なう
ことができ、ざらに本発明のＢリンパ球の分離方法にお
いて、分離材１こ固定化されたリガンドが、複素環式化
合物類、ペプチド類およびアミノ酸類からなる群から選
ばれたものである場合、より望ましくは複素環式化合物
類が、化学療法剤およびその誘導体、ピリミジン関連化
合物、ピリジン関連化合物ならびにピラジン関連化合物
からなる群から選ばれたもの、さらに望ましくは複素環
式化合物類が、サルファ剤、サルファ剤とｐＫ４．０〜
９．０の色素との化合物、２−チオウラシル、イソニコ
チン酸ヒドラジドおよびルミノールからなる群から選ば
れたものであり、また望ましくはペプチド類が、アミノ
酸数２〜１０゛程度のオリゴペプチド、ざらに望ましく
はオリゴペプチドが、リジン、チロシンによるオリゴペ
プチドあるいはアスパチルフェニルアラニンアルキルエ
ステル、また望ましくはアミノ酸類が、バリン、ロイシ
ン、チロシン、フェニルアラニン、イソロイシン、トリ
プトファン、リジン、アルギニン、プロリンおよびアス
パラギン酸ないしそのＭＷ体からなる群から選ばれたア
ミノ酸を単独あるいは投数組合せである場合、あるいは
また有機合成されたリガンドが、アルギニン、アスパラ
ギン酸、フェニルアラニン、プロリンとスルファチアゾ
ールを組合せたものである場合、例えばリンパ球分画の
分離に用いられた際より高純度、高収率で安全性高くＴ
リンパ球みよびＢリンパ球を分離することができるもの
であり、また洗浄液として等張緩両液を用いるものであ
ると、Ｔ、Ｂリンパ球の分離はより容易にかつ好適に行
なえるものとなり、さらにまた分離材をウシ血清アルブ
ミンで処理した後、こリンパ球含有液を接触させるもの
であると、分離効率において純度を低下させることなく
収率を向上させることができ、より優れた効果が期待で
きるものである。

本発明はさらに、粒子状の水不溶性固体物質表面に免疫
グロブリンと高い親和性を有する有機合成されたリガン
ドを固定化してなる分離材を充填したカラムを有するこ
とを特徴とするＢリンパ球の分離器であるから、上記の
ごとく優れた特性を有するＢリンパ球分離材とリンパ球
懸濁液等のＢリンパ球含有液との接触をより効率よく行
なうことができ、Ｔリンパ球とＢリンパ球の分離を短時
間でかつ首尾よ〈実施することが可能となり、ざらにカ
ラムがポリプロピレンまたはポリカーボネートからなる
ものであり、またカラムの出入口と分離材層との間には
、Ｂリンパ球含有液中の細胞成分は通過するが分離材は
通過できない網目を有するフィルターを備えてなり、ざ
らに該フィルターがポリエステルまたはポリアミドから
なるものであると、滅菌処理等の操作も簡単でかつ通過
するＢリンパ球含有液中の細胞成分を損傷する虞れも少
なく、リンパ球分画の分離に用いられた際にはより高純
度、高収率でＴリンパ球と８リンパ球の分離を可能とす
るものである。

またざらに本発明は水不溶性固体物質表面にスペーサー
を介して、免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合
成されたリガンドが固定化されていることを特徴とする
Ｂリンパ球分離材であるから、Ｂリンパ球のみを選択的
に捕捉分離でき、例えば末梢血あるいは生体組織から得
られるリンパ球分画から、Ｔリンパ球とＢリンパ球を簡
便かつ迅速に極めて高収率で高純度で分離することが可
能であり、しかも分離されたＴリンパ球およびＢリンパ
球の機能的損傷も少ないことから、免疫機能に関係した
疾患の診断、治療やリンパ球由来の生理活性物質を得る
ための基礎技術に応用できるものである。さらに本発明
のＢリンパ球分離材においてスペーサーが少なくとも２
個以上の炭素原子を有する炭素水素鎖ないしは特性基を
含む炭化水素鎖を骨格とするもの、より好ましくはスペ
ーサーのメチレンの繰返しが４個以上の直鎖アルキルを
骨格とするものまたは重合度１〜５０のエチレンオキサ
イド骨格を有するものであると、Ｔリンパ球の非特異的
吸着がさらに抑制されて、分離精度はより高いものとな
り、ざらに本発明のＢリンパ球分離材において、有機合
成されたりガンドが、複素環式化合物類、ペプチド類お
よびアミノ酸類からなる群から選ばれたものである場合
、より望ましくは複素環式化合物類が、化学療法材およ
び誘導体、ピリミジン関連化合物、ピリジン関連化合物
ならびにピラジン関連化合物からなる群から選ばれたも
の、ざらに望ましくは複素環式化合物類が、サルファ剤
、サルファ剤とｐＫ４．０〜９．０の色素との化合物、
２−チオウラシル、イソニコチン酸ヒドラジドおよびル
ミノールからなる群から選ばれたものであり、また望ま
しくはオリゴペプチド、さらに望ましくはオリゴペプチ
ドが、リジン、チロシンによるオリゴペプチドあるいは
アスパチルフェニルアラニンアルキルエステルであり、
また望ましくはアミノ酸類がバリン、ロイシン、チロシ
ン、フェニルアラニン、インロイシン、トリプトファン
、リジン、アルギニン、プロリンおよびアスパラギン酸
ないしその誘導体からなる群から選ばれたアミノ酸を単
独あるいは複数組合わせたものである場合、あるいはま
た有機合成されたリガンドが、アルギニン、アスパラギ
ン酸、フェニルアラニン、プロリンとスルファチアゾー
ルを組合せてなるものである場合、゛より高純度、高収
率で安全性高くＴリンパ球およびＢリンパ球を得ること
ができるものとなり、さらに、水不溶性固体物質が平均
粒径０．０５〜５ｍの粒子体であるとより安定して効率
よくＢリンパ球を分離することが可能となる。

また、本発明は、水不溶性固体物質表面にスペーサーを
介して、免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成
されたリガンドを固定化してなる分離材に、リンパ球含
有液を接触させ、膜表面に免疫グロブリン分子（Ｓ−Ｉ
Ｑ）を有するＢリンパ球を選択的に捕捉せしめることを
特徴とするＢリンパ球の分離方法であるから、処理操作
において異種生物由来の濃厚血清や生理活性物質を用い
ることがいっさいなく簡便に精度の高いＢリンパ球分離
を行なうことができる。加えて、本発明のＢリンパ球の
分離方法において、分離材におけるスペーサーが少なく
とも２個以上の炭素原子を有する炭化水素鎖ないし特性
基を含む炭化水素鎖を骨格とするもの、より好ましくは
スペーサーのメチレンの繰返しが４個以上の直鎖アルキ
ルを骨格とするものまたは重合度１〜５０のエレレンオ
キサイド骨格を有するものであると、より高精度なりリ
ンパ球分離が期待でき、ざらに分離材に固定化されたリ
ガンドが、複素環式化合物類、ペプチド類およびアミノ
酸類からなる群から選ばれたものである場合、より望ま
しくは複素環式化合物類が、化学療法剤およびその誘導
体、ピリミジン関連化合物からなる群から選ばれたもの
、さらに望ましくは複素環式化合物類が、サルファ剤、
サルファ剤とｐＫ４．０〜９．０の色素との化合物、２
−チオウラシル、イソニコチン酸ヒドラジド６よびルミ
ノールからなる群から選ばれたものであり、また望まし
くはペプチド類が、アミノ酸数２〜１０程度のオリゴペ
プチド、ざらに望ましくはオリゴペプチドが、リジン、
チロシンによるオリゴペプチドあるいはアスパチルフェ
ニルアラニンアルキルエステル、また望ましくはアミノ
酸類が、バリン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニ
ン、イソロイシン、トリプトファン、リジン、アルギニ
ン、プロリンおよびアスパラギン酸ないしその誘導体か
らなる群から選ばれたアミノ酸を単独あるいは複数組合
せたものである場合、あるいはまた有機合成されたリガ
ンドが、アルギニン、アスパラギン酸、フェニルアラニ
ン、プロリンとスルファチアゾールを組合せたものであ
る場合、例えば、リンパ球分画の分離に用いられた際よ
り高純度、高収率で安全性高くＴリンパ球およびＢリン
パ球を分離することができるものであり、また洗浄液と
して等張緩耐液を用いるものであるとＴ。

Ｂリンパ球の分離は容易にかつ好適に行なえるものとな
り、より優れた効果が期待できるものである。

本発明はざらに、粒子状の水不溶性固体物質表面にスペ
ーサーを介して免疫グリプリンと高い親和性を有する有
機合成されたリガンドを固定化してなる分離材を充填し
たカラムを有することを特徴とするＢリンパ球の分離器
であるから、上記のごとく優れた特性を有するＢリンパ
球分離材とすンバ球懸濁液等のＢリンパ球含有液との接
触をより効率よく行なうことができ、Ｂリンパ球の分離
を短時間でかつ首尾よ〈実施することが可能となり、ざ
らにカラムがポリプロピレンまたはポリカーボネートか
らなるものであり、またカラムの出入口と分離材層との
間には、Ｂリンパ球含有液中の細胞成分は通過するが分
離材は通過できない網目を有するフィルターを備えてな
り、さらに該フィルターがポリエステルまたはポリアミ
ドからなるものであると、滅菌処理等の操作も簡単でか
つ通゛遇するＢリンパ球含有液中の細胞成分を損傷する
虞れも少なくミリンパ球分画の分離に用いられた際には
より高純度、高収率でＴリンパ球とＢリンパ球の分離を
可能とするものである。

【図面の簡単な説明】 第１図は本発明のＢリンパ球分離器の一実施例の使用態
様を示す模式図である。 １・・・リンパ球懸濁液、４ａ、４ｂ・・・フィルター
、５・・・Ｂリンパ球分離材、６・・・カラム、７・・
・処理液、８・・・洗浄液、９・・・導入口、１０・・
・導出口。

Claims (55)

【特許請求の範囲】
1. （１）水不溶性固体物質表面に、免疫グロブリンと高い
   親和性を有する有機合成されたリガンドを固定化したこ
   とを特徴とするＢリンパ球分離材。
2. （２）有機合成されたリガンドが、複素環式化合物類、
   ペプチド類およびアミノ酸類からなる群から選ばれたも
   のである特許請求の範囲第１項に記載のＢリンパ球分離
   材。
3. （３）複素環式化合物類が、化学療法剤およびその誘導
   体、ピリミジン関連化合物、ピリジン関連化合物ならび
   にピラジン関連化合物からなる群から選ばれたものであ
   る特許請求の範囲第２項に記載のＢリンパ球分離材。
4. （４）複素環式化合物類が、サルファ剤、サルファ剤と
   ｐＫ４．０〜９．０の色素との化合物、２−チオウラシ
   ル、イソニコチン酸ヒドラジドおよびルミノールからな
   る群から選ばれたものである特許請求の範囲第３項に記
   載のＢリンパ球分離材。
5. （５）ペプチド類が、アミノ酸数２〜１０程度のオリゴ
   ペプチドである特許請求の範囲第２項に記載のＢリンパ
   球分離材。
6. （６）オリゴペプチドが、リジン、チロシンによるオリ
   ゴペプチドあるいはアスパチルフェニルアラニンアルキ
   ルエステルである特許請求の範囲第５項に記載のＢリン
   パ球分離材。
7. （７）アミノ酸類が、バリン、ロイシン、チロシン、フ
   ェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファン、リジ
   ン、アルギニン、プロリンおよびアスパラギン酸ないし
   その誘導体からなる群から選ばれたアミノ酸を単独ある
   いは複数組合せたものである特許請求の範囲第２項に記
   載のＢリンパ球分離材。
8. （８）有機合成されたリガンドが、アルギニン、アスパ
   ラギン酸、フェニルアラニン、プロリンとスルファチア
   ゾールを組合せてなるものである特許請求の範囲第１項
   または第２項に記載のＢリンパ球分離材。
9. （９）水不溶性固体物質が、合成有機高分子、天然有機
   高分子または無機物からなる粒子体である特許請求の範
   囲第１項〜第８項のいずれかに記載のＢリンパ球分離材
   。
10. （１０）水不溶性固体物質が、平均粒径０．０５〜５ｍ
    ｍの粒子体である特許請求の範囲第１項〜第９項のいず
    れかに記載のＢリンパ球分離材。
11. （１１）有機合成されたリガンドが、水不溶性固体表面
    に共有結合により固定化されているものである特許請求
    の範囲第１項〜第１０項のいずれかに記載のＢリンパ球
    分離材。
12. （１２）水不溶性固体物質表面に免疫グロブリンと高い
    親和性を有する有機合成されたリガンドを固定化してな
    る分離材に、Ｂリンパ球含有液を接触させ、膜表面に免
    疫グロブリン分子（Ｓ−Ｉｇ）を有するＢリンパ球を選
    択的に捕捉せしめることを特徴とするＢリンパ球の分離
    方法。
13. （１３）分離材に固定化されたリガンドが、複素環式化
    合物類、ペプチド類およびアミノ酸類からなる群から選
    ばれたものである特許請求の範囲第１２項に記載のＢリ
    ンパ球の分離方法。
14. （１４）複素環式化合物類が、化学療法剤およびその誘
    導体、ピリミジン関連化合物、ピリジン関連化合物なら
    びにピラジン関連化合物からなる群から選ばれたもので
    ある特許請求の範囲第１３項に記載のＢリンパ球の分離
    方法。
15. （１５）複素環式化合物類が、サルファ剤、サルファ剤
    とＰＫ４．０〜９．０の色素との化合物、２−チオウラ
    シル、イソニコチン酸ヒドラジドおよびルミノールから
    なる群から選ばれたものである特許請求の範囲第１４項
    に記載のＢリンパ球の分離方法。
16. （１６）ペプチド類が、アミノ酸数２〜１０程度のオリ
    ゴペプチドである特許請求の範囲第１３項に記載のＢリ
    ンパ球の分離方法。
17. （１７）オリゴペプチドが、リジン、チロシンによるオ
    リゴペプチドあるいはアスパチルファニルアラニンアル
    キルエステルである特許請求の範囲第１６項に記載のＢ
    リンパ球の分離方法。
18. （１８）アミノ酸類が、バリン、ロイシン、チロシン、
    フェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファン、リ
    ジン、アルギニン、プロリンおよびアスパラギン酸ない
    しその誘導体からなる群から選ばれたアミノ酸を単独あ
    るいは複数組合せたものである特許請求の範囲第１３項
    に記載のＢリンパ球の分離方法。
19. （１９）分離材に固定されたされたリガンドが、アルギ
    ニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、プロリンと
    スルファチアゾールを組合せてなるものである特許請求
    の範囲第１２項に記載のＢリンパ球の分離方法。
20. （２０）水不溶性固体物質が、合成有機高分子、天然有
    機高分子または無機物からなるものである特許請求の範
    囲第１２項〜第１９項のいずれかに記載のＢリンパ球の
    分離方法。
21. （２１）洗浄液として等張緩衝液を用いるものである特
    許請求の範囲第１２項に記載のＢリンパ球の分離方法。
22. （２２）分離材をウシ血清アルブミンで処理した後、リ
    ンパ球懸濁液と接触させるものである特許請求の範囲第
    １２項に記載のＢリンパ球の分離方法。
23. （２３）粒子状の水不溶性固体物質表面に免疫グロブリ
    ンと高い親和性を有する有機合成されたリガンドを固定
    化してなる分離材を充填したカラムを有することを特徴
    とするＢリンパ球の分離器。
24. （２４）カラムがポリプロピレンまたはポリカーボネー
    トからなるものである特許請求の範囲第２２項に記載の
    Ｂリンパ球の分離器。
25. （２５）カラムの出入口と分離材層との間には、Ｂリン
    パ球含有液中の細胞成分は通過するが分離材は通過でき
    ない網目を有するフィルターを備えてなるものである特
    許請求の範囲第２３項または第２４項に記載のＢリンパ
    球の分離器。
26. （２６）フィルターがポリエステルまたはポリアミドか
    らなるものである特許請求の範囲第２５項に記載のＢリ
    ンパ球の分離器。
27. （２７）水不溶性固体物質表面にスペーサーを介して、
    免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成されたリ
    ガンドが固定化されていることを特徴とするＢリンパ球
    分離材。
28. （２８）スペーサーが少なくとも２個以上の炭素原子を
    有する炭化水素鎖ないしは特性基を含む炭化水素鎖を骨
    格とするものである特許請求の範囲第２７項に記載のＢ
    リンパ球分離材。
29. （２９）スペーサーのメチレンの繰返しが４個以上の直
    鎖アルキルを骨格とするものである特許請求の範囲第２
    ８項に記載のＢリンパ球分離材。
30. （３０）スペーサーが重合度１〜５０のエチレンオキサ
    イド骨格を有するものである特許請求の範囲第２８項に
    記載のＢリンパ球分離材。
31. （３１）有機合成されたリガンドが、複素環式化合物類
    、ペプチド類およびアミノ酸類からなる群から選ばれた
    ものである特許請求の範囲第２７項〜第３０項のいずれ
    かに記載のＢリンパ球分離材。
32. （３２）複素環式化合物類が、化学療法剤およびその誘
    導体、ピリミジン関連化合物、ピリジン関連化合物なら
    びにピラジン関連化合物からなる群から選ばれたもので
    ある特許請求の範囲第３１項に記載のＢリンパ球分離材
    。
33. （３３）複素環式化合物類が、サルファ剤、サルファ剤
    とｐＫ４．０〜９．０の色素との化合物、２−チオウラ
    シル、イソニコチン酸ヒドラジドおよびルミノールから
    なる群から選ばれたものである特許請求の範囲第３２項
    に記載のＢリンパ球分離材。
34. （３４）ペプチド類が、アミノ酸数２〜１０程度のオリ
    ゴペプチドである特許請求の範囲第３１項に記載のＢリ
    ンパ球分離材。
35. （３５）オリゴペプチドが、リジン、チロシンによるオ
    リゴペプチドあるいはアスパチルファニルアラニンアル
    キルエステルである特許請求の範囲第３４項に記載のＢ
    リンパ球分離材。 （３５）アミノ酸類が、バリン、ロイシン、チロシン、
    フェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファン、リ
    ジン、アルギニン、プロリンおよびアスパラギン酸ない
    しその誘導体からなる群から選ばれたアミノ酸を単独あ
    るいは複数組合せたものである特許請求の範囲第３１項
    に記載のＢリンパ球分離材。
36. （３６）有機合成されたリガンドが、アルギニン、アス
    パラギン酸、フェニルアラニン、プロリンとスルファチ
    アゾールを組合せてなるものである特許請求の範囲第３
    １項に記載のＢリンパ球分離材。
37. （３７）水不溶性固体物質が、合成有機高分子、天然有
    機高分子または無機物からなる粒子体である特許請求の
    範囲第２７項〜第３６項のいずれかに記載のＢリンパ球
    分離材。
38. （３８）水不溶性固体物質が、平均粒径０．０５〜５ｍ
    ｍの粒子体である特許請求の範囲第２７項〜第３７項の
    いずれかに記載のＢリンパ球分離材。
39. （３９）水不溶性固体物質表面にスペーサーを介して免
    疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成されたリガ
    ンドを固定化してなる分離材に、Ｂリンパ球含有液を接
    触させ、膜表面に免疫グロブリン分子（Ｓ−Ｉｇ）を有
    するＢリンパ球を選択的に捕捉せしめることを特徴とす
    るＢリンパ球の分離方法。
40. （４０）分離材におけるスペーサーが少なくとも２個以
    上の炭素原子を有する炭化水素鎖ないしは特性基を含む
    炭化水素鎖を骨格とするものである特許請求の範囲第１
    ４項または第１５項に記載のＢリンパ球の分離方法。
41. （４１）分離材におけるスペーサーのメチレンの繰返し
    が４個以上の直鎖アルキルを骨格とするものである特許
    請求の範囲第４０項に記載のＢリンパ球の分離方法。
42. （４２）分離材におけるスペーサーが重合度１〜５０の
    エチレンオキサイド骨格を有するものである特許請求の
    範囲第４０項に記載のＢリンパ球の分離方法。
43. （４３）分離材に固定化されたリガンドが、複素環式化
    合物類、ペプチド類およびアミノ酸類からなる群から選
    ばれたものである特許請求の範囲第３９項〜第４２項の
    いずれかに記載のＢリンパ球の分離方法。
44. （４４）複素環式化合物類が、化学療法剤およびその誘
    導体、ピリミジン関連化合物、ピリジン関連化合物なら
    びにピラジン関連化合物からなる群から選ばれたもので
    ある特許請求の範囲第４３項に記載のＢリンパ球の分離
    方法。
45. （４５）複素環式化合物類が、サルファ剤、サルファ剤
    とＰＫ４．０〜９．０の色素との化合物、２−チオウラ
    シル、イソニコチン酸ヒドラジドおよびルミノールから
    なる群から選ばれたものである特許請求の範囲第４４項
    に記載のＢリンパ球の分離方法。
46. （４６）ペプチド類が、アミノ酸数２〜１０程度のオリ
    ゴペプチドである特許請求の範囲第４３項に記載のＢリ
    ンパ球の分離方法。
47. （４７）オリゴペプチドが、リジン、チロシンによるオ
    リゴペプチドあるいはアスパチルフェニルアラニンアル
    キルエステルである特許請求の範囲第４６項に記載のＢ
    リンパ球の分離方法。
48. （４８）アミノ酸類が、バリン、ロイシン、チロシン、
    フェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファン、リ
    ジン、アルギニン、プロリンおよびアスパラギン酸ない
    しその誘導体からなる群から選ばれたアミノ酸を単独あ
    るいは複数組合せたものである特許請求の範囲第４３項
    に記載のＢリンパ球の分離方法。
49. （４９）分離材に固定されたされたリガンドが、アルギ
    ニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、プロリンと
    スルファチアゾールを組合せてなるものである特許請求
    の範囲第４３項に記載のＢリンパ球の分離方法。
50. （５０）水不溶性固体物質が、合成有機高分子、天然有
    機高分子または無機物からなるものである特許請求の範
    囲第３９項〜第４９項のいずれかに記載のＢリンパ球の
    分離方法。
51. （５１）洗浄液として等張緩衝液を用いるものである特
    許請求の範囲第３９項に記載のＢリンパ球の分離方法。
52. （５２）粒子状の水不溶性固体物質表面にスペーサーを
    介して免疫グロブリンと高い親和性を有する有機合成さ
    れたリガンドを固定化してなる分離材を充填したカラム
    を有することを特徴とするＢリンパ球の分離器。
53. （５３）カラムがポリプロピレンまたはポリカーボネー
    トからなるものである特許請求の範囲第５２項に記載の
    Ｂリンパ球の分離器。
54. （５４）カラムの出入口と分離材層との間には、Ｂリン
    パ球含有液中の細胞成分は通過するが分離材は通過でき
    ない網目を有するフィルターを備えてなるものである特
    許請求の範囲第５２項または第５３項に記載のＢリンパ
    球の分離器。
55. （５５）フィルターがポリエステルまたはポリアミドか
    らなるものである特許請求の範囲第５４項に記載のＢリ
    ンパ球の分離器。