CN101273996B - 净化血液及血液制品的方法 - Google Patents
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Abstract
一种净化血液及血液制品的方法，其以吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒作为反应和分离的固相载体，按每1升待处理血液或血液制品中加入5～50mg吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的比例加入这种磁球并混合均匀，则病毒被吸附于吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒上，用波长600～800nm的光照射，激活键合在吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒表面的吩噻嗪类染料，所产生单线态氧及氢氧自由基将病毒杀灭，用外加磁场将吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒与被杀灭病毒的血液或血液制品的混合物进行分离，得到净化血液或血液制品。本发明解决了背景技术中吩噻嗪类染料在灭活病毒后难于去除的问题。本发明特异性强，无染料残留，操作简便。
Description
技术领域
本发明涉及一种净化血液及血液制品的方法，具体涉及一种用吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒杀灭血液及血液制品中病毒的方法。
背景技术
输血是治病救人的有效治疗手段，但输血也伴随着艾滋病、乙型肝炎以及丙型肝炎等病毒性疾病传播的危险。据统计，目前全世界被艾滋病毒(HIV)感染的人数大于三千万，被乙肝病毒(HBV)感染的人数大约3.7亿，被丙肝病毒(HCV)感染的人数大约1.8亿，而被HIV感染总数的5-10％源于不安全的输血！
目前，血液及血液制品中所含病毒的处理主要有灭活和去除两种形式。
灭活方法中：巴斯德消毒法，对一些耐热病毒的灭活效果不佳。有机溶剂结合表面活性剂(S/D)法，对非脂包膜病毒无效，且工艺复杂，成本高。干热灭活法，虽安全有效，但仅适用于冻干制剂的病毒灭活。光化学灭活法，是目前被视为颇有前景的血液净化的热点研究方向，不仅可以灭活血浆中游离的病毒，而且可以灭活细胞内整合的病毒，故可用于全血、血浆及血细胞等各种血液成分及血液制品的消毒。已使用的化学光敏剂主要有血卟啉衍生物、补骨脂素衍生物及吩噻嗪类染料亚甲蓝等。
亚甲蓝光化学法具有效率高、成本低、起效快、操作简单的优点，灭活后的血浆副作用小，血浆蛋白的免疫原性无变异，主要用于血浆中HIV、HBV及HCV的灭活；且亚甲蓝是FDA批准的临床用药，毒副作用较小。对亚甲蓝光化学法作用机理的研究表明，亚甲蓝既可与病毒脂包膜上的脂质和蛋白质结合，又可与核酸，尤其是富含GC碱基区域结合，经一定波长的光照后，光敏剂形成单态氧和氢氧自由基，破坏了病毒脂包膜，使得鸟嘌呤发生氧化，核酸发生断裂，从而可阻止病毒的复制。该方法目前主要用于新鲜冰冻血浆中病毒的净化，而其它的一些对核酸具有更高亲和力并可杀灭细胞内病毒的亚甲蓝衍生物已用于全血及红细胞悬液中病毒的灭活研究。1993年起在欧洲一些国家的红十字会输血中心开始使用该方法灭活新鲜冷冻血浆中的病毒，至今未发现明显的负面反应。我国近年来也将采用该法灭活的血浆用于临床治疗，取得了良好的效果。但该法主要的缺点是：亚甲蓝残留在血液中，导致血液颜色变化，会使受血者产生心理抗拒。尤其是残留的亚甲蓝在人体内会积累，存在潜在的致突变的危险。虽然可以用吸附剂法去除亚甲蓝，但去除率通常只能达到85％左右，且该过程会影响血液制品中的正常成分。
上述几种灭活病毒的方法均无法将灭活后的病毒从血液或血液制品中去除，而且临床使用表明，没有一种病毒灭活方法能保证血液制品绝对无传播病毒的危险。
比较成熟的病毒去除方法中：色谱法耗时太长，且去除病毒不彻底。膜法易损伤细胞成分。免疫吸附柱法处于研发之中，可用于血液制品中病毒的彻底去除，但该法特异性太强，故实际应用范围很窄。
申请号为200410026221.2的中国专利，公开了一种将抗体固定于磁性微粒表面，利用抗原抗体间的特异性结合及磁性微粒的磁性分离性能去除血液中病毒的方法。但由于该法中抗体稳定性较差，产品难以长期保存，故实际应用受到很大限制。
磁性微粒是由有机或无机基质与磁性金属、金属氧化物等磁性超细粉末复合形成的纳米或微米级胶态颗粒。该材料的超顺磁性使其在胶体溶液中具有稳定性，其磁响应性可保证在外加磁场中颗粒与悬浮介质的分离，在撤去外磁场时微粒本身会重新悬浮分散而不聚集，即不具有磁记忆性。更有意义的是，通过高分子或有机试剂与磁性颗粒的复合，可在颗粒表面引入氨基、羧基、巯基、羟基等功能基团，通过共价作用将酶、抗体、细胞、核酸及寡核苷酸等生物分子固定在表面，可应用于细胞分选、酶的固定化、免疫检测、药物载体及核酸的纯化与分离、肿瘤的靶向治疗研究等生物、医学领域。
磁性微粒的制备有球磨法、乳液聚合法、液相干燥法、溶胶-凝胶法、均匀沉淀法、气溶胶法、反相胶束法、无定型晶化法等许多方法，国外已有相关上市产品，1986年挪威的Dynal公司率先实现了该类产品的商业化，所提供的Dynabead BeadsM-280和M-450已广泛用于细胞分选、蛋白质及核酸分离等领域；德国MiltenyiBiotech公司利用多糖包覆的磁性微粒偶联抗体已应用于细胞分选方面；BoehringerMannheim公司的mRNA分离试剂盒也是特色产品；美国的FeRx公司、PE公司、Perseptive公司、瑞典的Pharmacia公司、法国的Estapor、德国的Micromod以及加拿大的Biochem Immunosystem等公司，都已将相关的产品商业化。产品所涉及的高分子种类、特性及其与磁性内芯组成等各种各样，应用领域也越来越广。
目前，国内在该领域大多处于研究阶段。中科院成都有机所较早利用单体聚合法进行了磁性聚苯乙烯微粒的合成，并用于固定化中性蛋白酶的研究。南开大学高分子化学所研究了磁性葡聚糖毫微粒的合成，并探讨了固定化酶的条件。中国专利CN03124061.5公开的一种核/壳型超顺磁性复合微粒及其制备方法与应用，中国专利CN03153486.4公开的一种组装型磁生复合微粒及其制备方法与应用，中国专利CN02139365.6公开的一种磁性荧光微球及其制备方法和采用该磁性荧光微球进行生物分子检测的方法，中国专利CN03134319.8公开的一种磁性微球介导的微流体分析系统及其检测方法，均与磁性微粒的制备与应用相关。《中国药师》(陶利军，孙永海，张宏，刘建行9：24-26，2006)最近有文章报道了一种将亚甲蓝包加在磁性明胶微粒中以制备磁性药物缓释剂的方法，仅仅对产品的性能进行了评价。对吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒用于灭活及去除血液及血液制品中病毒的方法及装置则未报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种净化血液及血液制品的方法，其解决了背景技术中灭活操作所采用的吩噻嗪类染料难以从血液及血液制品中去除的问题。
本发明的技术解决方案如下：
一种净化血液及血液制品的方法，其实现步骤包括：
(1)以吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒作为反应和分离的固相载体，将吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒加入待处理血液或血液制品中；比例为每1升待处理血液或血液制品中加入5～50mg吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒；
(2)将待处理血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒通过温和振荡混合均匀，吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒表面的吩噻嗪类染料分子与血液或血液制品中的病毒作用，则病毒被吸附于吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒上；
(3)用波长600～800nm的光照射血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的混合物，激活键合在吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒表面的吩噻嗪类染料，所产生单线态氧及氢氧自由基将血液或血液制品中的病毒杀灭；
(4)用外加磁场作用于血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的混合物，作用时间10～30分钟，则将吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒与被杀灭病毒的血液或血液制品的混合物进行分离，得到净化血液或血液制品。
上述用光照射杀灭血液或血液制品中的病毒的光波长可为600～700nm；光照时间一般为5～30分钟；光照温度一般可为4～30℃；用外加磁场作用于血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的混合物，进行分离的磁场强度一般可为2500～3500高斯。
上述用光照射杀灭血液或血液制品中的病毒的光的波长优选660nm；光照时间以10分钟为宜；光照温度20～25℃即可；用外加磁场作用于血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的混合物，进行分离的磁场强度优选3000高斯。
上述吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒以采用水或生理盐水为介质的胶体状态的吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒为宜。
上述用外加磁场作用于血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的混合物，进行分离的磁性分离装置一般采用圆柱状容器或管道，以及设置于该圆柱状容器或管道外周的磁场构成。磁性分离装置的圆柱状容器或管道可采用高分子材料或玻璃，优选透明有机玻璃材料。
本发明具有如下优点：
特异性强，杀灭及去除病毒效率高。操作容易，不需复杂设备，成本低。本发明无染料残留，无毒副作用，安全可靠，既能杀灭血液及血液制品中的病毒，又能去除杀灭病毒所采用的物质。
具体实施方式
本发明的实现步骤如下：
(1)以吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒作为反应和分离的固相载体，将吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒加入待处理血液或血液制品中；比例为每1升待处理血液或血液制品中加入5～50mg吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒。吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒以采用水或生理盐水为介质的胶体状态的吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒为宜。
(2)将待处理血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒通过温和振荡混合均匀，吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒表面的吩噻嗪类染料分子与血液或血液制品中的病毒作用，则病毒被吸附于吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒上。
(3)用波长600～800nm的光照射血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的混合物，激活键合在吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒表面的吩噻嗪类染料，所产生单线态氧及氢氧自由基将血液或血液制品中的病毒杀灭。用光照射杀灭血液或血液制品中的病毒的光波长以600～700nm为宜，优选波长660nm的光。光照时间一般可为5～30分钟，通常10分钟为宜。光照温度可为4～30℃，通常20～25℃或室温为宜。
(4)用外加磁场作用于血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的混合物，作用时间10～30分钟，将吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒与被杀灭病毒的血液或血液制品的混合物进行分离，得到净化血液或血液制品。用外加磁场进行分离，磁场强度以2500～3500高斯为宜，优选3000高斯。磁性分离装置一般可采用圆柱状容器或管道，在该圆柱状容器或管道外周设置磁场构成。磁性分离装置的圆柱状容器或管道可采用高分子材料或玻璃，优选透明有机玻璃材料。
本发明吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的化学结构为：
其中R1、R9分别表示H、低级烷基或低级芳烷基；R2表示H或低级烷基；R3、R4分别表示低级烷基；n表示2～5之间的整数；P表示微米级Fe3O4磁性微粒；低级烷基为含1～6个碳原子的直链或支链烷基，低级芳烷基为连接有芳基的低级烷基。
本发明的血液主要是指全血或各种成分血，如浓缩红细胞、洗涤红细胞、代浆血、少白细胞的红细胞、冰冻红细胞、浓缩血小板、新鲜冰冻血浆、冰冻血浆、冷沉淀等。血液制品主要是指白蛋白、丙种球蛋白、特异性免疫球蛋白、浓缩VIII因子、凝血酶原复合物、干扰素、转移因子等。血液或血液制品中的病毒主要是指含有包膜的RNA病毒，如丙肝病毒(HCV)以及反转录病毒艾滋病病毒(HIV)等；或含有包膜的DNA病毒，如乙肝病毒(HBV)等。
实施例1：向临床袋装的200ml血液中加入3mg吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒，以660nm波长光照射20分钟，将血袋置于3000高斯强磁场中，使磁性微粒沉淀下来，实现与血液的分离。净化后的血液可直接用于临床输注。
实施例2：每15升血液或血液制品中加入0.2g吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒。磁性分离装置采用直径20cm、容积20升的细长透明圆柱状容器固定在支架上，容器两端设置有液体引入接口及流出接口，圆柱状容器外周设有若干可产生波长600～700nm光线的灯管。将血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的混合物引入磁性分离器，并缓慢流过磁性分离装置，圆柱状容器在电机带动下绕轴缓慢旋转，光照30分钟，温度为室。净化后的血液可直接罐装入血袋于血站贮存或直接用于临床输注。
Claims (6)
1.一种净化血液及血液制品的方法，其实现步骤包括：
（1）以吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒作为反应和分离的固相载体，将吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒加入待处理血液或血液制品中；比例为每1升待处理血液或血液制品中加入5～50mg吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒；
（2）将待处理血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒通过温和振荡混合均匀，吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒表面的吩噻嗪类染料分子与血液或血液制品中的病毒作用，病毒被吸附于吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒上；
（3）用波长600～800nm的光照射血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的混合物，激活键合在吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒表面的吩噻嗪类染料，所产生单线态氧及氢氧自由基将血液或血液制品中的病毒杀灭；
（4）用外加磁场作用于血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的混合物，作用时间10～30分钟，则将吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒与被杀灭病毒的血液或血液制品的混合物进行分离，得到净化血液或血液制品。
2.根据权利要求1所述的净化血液及血液制品的方法，其特征在于：所述用光照射杀灭血液或血液制品中的病毒的光波长为600～700nm；所述的光照时间为5～30分钟；所述的光照温度为4～30℃；所述用外加磁场作用于血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的混合物，进行分离的磁场强度为2500～3500高斯。
3.根据权利要求1所述的净化血液及血液制品的方法，其特征在于：所述用光照射杀灭血液或血液制品中的病毒的光的波长为660nm；所述的光照时间为10分钟；所述的光照温度为20～25℃；所述用外加磁场作用于血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒混合物，进行分离的磁场强度为3000高斯。
4.根据权利要求1或2的净化血液及血液制品的方法，其特征在于：所述的吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒是以水或生理盐水为介质的胶体状态。
5.根据权利要求4所述的净化血液及血液制品的方法，其特征在于：所述用外加磁场作用于血液或血液制品与吩噻嗪类染料修饰的磁性微粒的混合物进行分离，进行分离的磁性分离装置由圆柱状容器或管道以及设置于该圆柱状容器或管道外周的磁场构成。
6.根据权利要求5所述的净化血液及血液制品的方法，其特征在于：所述磁性分离装置的圆柱状容器或管道为高分子材料或透明有机玻璃材料。
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