CN100368029C - 用磁性复合微粒对血液中病毒及细胞清除的方法及装置 - Google Patents
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Abstract
一种用磁性复合微粒对血液中病毒及病变细胞清除的方法及装置，本发明的特点是利用磁性复合微粒作为反应和分离的固相载体，将血液与磁性复合微粒充分接触，使血液中病毒或病变细胞与磁性复合微粒表面的特异性分子反应并被吸附在磁性复合微粒上，再将磁性复合微粒与血液通过外加磁场进行分离，则得到净化血液；本发明通过磁性复合微粒表面固定的DNA序列或抗体与血液中病毒颗粒、RNA片段以及被感染细胞的亲和反应，实现了清除血液中病毒粒子和病变细胞的目的。本发明解决了已有技术不能彻底清除血液中病毒的缺点，与膜法相比，具有不影响血液中正常组分的优势。本发明具有操作简单、特异性强、无残留、安全可靠、无毒副作用的优点，这对改变目前血液制品和患者血液中病毒清除的现状具有非常重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于血液净化方法及装置的改进。涉及生物化学技术领域。
背景技术
血液是人体维持生命的根本，一些致病物质对血液的侵袭，会直接威胁人体的生命和健康。因此，对血液制品的安全控制以及对疾病患者血液的净化处理，具有非常重要的意义。对病毒感染而言，大部分可在几周内自愈，有些病毒性感染可在几个月后通过自身的免疫系统作用去除病毒，如麻疹病毒、肝炎B型病毒等，但有些病毒在慢性疾病感染后很难被去除，这些病毒主要包括疱疹病毒、反转录病毒、丙型肝炎病毒、刺瘤病毒和多瘤病毒等，这些难以去除的病毒感染血液，并进一步对血细胞、血浆及血浆衍生物引发感染(Lutz G Guertler.Virus safety of human blood，plasma，and derivedproducts.Thrombosis Research，107：S39～S45，2002)，如获得性免疫缺陷综合症病毒(HIV)是艾滋病的致病因子，它感染免疫系统的特定细胞，会危及受感染个体的免疫应答。因此，清除血液制品或人体血液中的病毒颗粒、病毒核酸片段以及被感染的血液细胞对血液的安全具有非常重要的意义。
目前血液制品中所含病毒的处理主要包括灭活和去除两种形式，其中灭活的方法包括巴斯德消毒法、有机溶剂结合表面活性剂(S/D)法、干热灭活法、光化学灭活法等，这些方法都存在有各自的缺点，如巴斯德消毒法对一些耐热病毒的灭活不理想，S/D法不能有效灭活非脂包膜病毒，光化学法对一些血浆蛋白的活性损伤较大，目前的临床使用表明，没有一种病毒灭活方法能保证血液制品绝对无传播病毒的危险(张延莹等，血液制品灭活及去除病毒工艺，中国生化药物杂志，23(4)：207～209，2002)。由于灭活不能保证血液的安全，且作为异源蛋白本身在血液制品或输入血液中会存在潜在的危险，因此，彻底去除病毒显得尤为重要。目前常用的去除病毒的方法包括色谱分离和纳米膜过滤的方法，色谱分离主要包括亲和色谱和离子交换色谱，已经得到了实际应用，但色谱填料表面常需要通过共价偶联的方法将特异的生物分子固定在其表面，该过程较为繁琐。膜法依据蛋白质或病毒颗粒大小的差异会受到膜性质和孔径大小的影响。因此，开发更新、效率更高的病毒去除方法是人们一直致力研究和开发的问题。
本申请所涉及血液中的病毒包括三类：①含有包膜的病毒如疱疹病毒、丙肝病毒(HCV)以及反转录病毒(HIV，HTLV-1)等，这些病毒有些是通过皮肤伤口或感染的血液而进入体内如HCV；有些如HTLV-1病毒主要通过细胞介导的T-淋巴细胞和巨噬细胞传递，血浆中不会存在该种病毒，但在血小板收集过程中会因污染淋巴细胞而感染HTLV-1病毒。②具有特殊被膜的病毒，如乙肝病毒(HBV)主要通过血液和性途径传播③一些无包膜的病毒(HAV，细小病毒)等，如细小病毒B19属DNA病毒，对儿童的感染尤为明显，急性患者每毫升血液中病毒的含量高达1014，该病毒在血浆成分分离的过程中可去除部分，但残留的病毒对热和S/D灭活均具有较强的抑制作用。在上述病毒感染的血液中，有些还存在被病毒感染的细胞。如受HIV感染个体的循环血液中含有完整的病毒粒子、其中的片段和游离的RNA。伴随着HIV-1感染，常常会引发巨细胞病毒(CMV)，乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)的感染，因此，可从被病毒感染个体的血液中清除多种病毒。本申请所涉及血液中的病变细胞主要包括白血病人的淋巴细胞、丙型肝炎患者的外周血单个核细胞等。
磁性微粒是由有机或无机基质与磁性超细粉末(包括磁性金属、金属氧化物等)复合形成的纳米或微米级胶态颗粒。该材料具有的超顺磁性使其通过运动保持在胶体溶液中的稳定性，并有磁响应性可保证在外加磁场中颗粒与悬浮介质的分离，当撤去外磁场后，微粒本身会重新悬浮分散不聚集，不具有磁记忆性。更有意义的是，通过高分子或有机试剂与磁性颗粒的复合，可在颗粒表面引入氨基、羧基、巯基、羟基等功能基团，通过共价作用将酶、抗体、细胞、核酸及寡核苷酸等生物分子固定在表面，进而应用于细胞分选、酶的固定化、免疫检测、药物载体及核酸的纯化与分离、肿瘤的靶向治疗研究等生物和医学领域。
磁性微粒的制备方法有许多，如球磨法、乳液聚合法、液相干燥法、溶胶-凝胶法、均匀沉淀法、气溶胶法、反相胶束法、无定型晶化法等。国外已有相关产品上市，1986年挪威的Dynal公司率先实现了该类产品的商业化，所提供的Dynabead BeadsM-280和M-450已广泛用于细胞分选、蛋白质及核酸分离等领域；德国Miltenyi Biotech公司利用多糖包覆的磁性微粒偶联抗体已应用于细胞分选方面；Boehringer Mannheim公司的mRNA分离试剂盒也是特色产品；美国的FeRx公司、PE公司、Perseptive公司、瑞典的Pharmacia公司、法国的Estapor、德国的Micromod以及加拿大的Biochem Immunosystem等公司，都已将相关的产品商业化。产品所涉及的高分子种类、特性及其与磁性内芯组成等各种各样，应用领域也越来越广。
国内在该领域目前大多处于研究阶段。中科院成都有机所较早利用单体聚合法进行了磁性聚苯乙烯微粒的合成，并用于固定化中性蛋白酶的研究。南开大学高分子化学所研究了磁性葡聚糖毫微粒的合成，并探讨了固定化酶的条件。天津大学生物工程研究中心、第四军医大学等单位在磁性载药颗粒的靶向治疗方面开展了研究。本申请发明人日前做出的一种核/壳型超顺磁性复合微粒及其制备方法与应用(专利申请号：CN03124061.5)、一种组装型磁性复合微粒及其制备方法与应用(专利申请号：CN03153486.4)、磁性荧光微球及其制备方法和采用该磁性荧光微球进行生物分子检测的方法(专利申请号：CN02139365.6)、磁性微球介导的微流体分析系统及其检测方法(专利申请号：CN03134319.8)等研究，均与磁性微粒的制备与应用相关。
中国专利公开了(申请号：CN03113522.6)一种纳米级抗艾滋病病毒微球，该方法是以注射方式将磁性微粒导入静脉，通过诱导产热将病毒灭活，故其不能彻底清除病毒，病毒仍然存在于体内，而且其也未交待体内残留病毒和磁性微粒的清除方法，所以该技术不属于血液病毒清除范围。经检索，未见有磁性微粒在血液中清除病毒或病变细胞方法的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种清除血液中感染的病毒和病变细胞的方法和装置，以解决已有技术存在的缺陷，使其具有操作简单、特异性强、无残留、安全可靠、无毒副作用的优点。
本发明所提出的清除血液中感染的病毒和病变细胞的方法是以磁性微粒和血液净化学为基础；其特征在于：利用磁性复合微粒作为反应和分离的固相载体，将血液与磁性复合微粒充分接触，使血液中病毒或病变细胞与磁性复合微粒表面的特异性分子反应并被吸附在磁性复合微粒上，再将磁性复合微粒与血液通过外加磁场进行分离，则得到净化血液；所述磁性复合微粒的表面固定有特异性的生物大分子，其能与被清除的病毒或病变细胞发生特异性亲和反应；所述磁性复合微粒以胶体状态存在于水或生理盐水介质中。本发明根据血液中的病情，一次处理可清除一种或几种病毒或/和病变细胞，即可在一种磁性微球表面固定一种特异性的生物分子，清除血液中单一的病毒或病变细胞；也可在几种磁性复合微粒表面固定不同的生物分子，将这几种磁性复合微粒同时使用，这样可以同时除去血液中被感染的几种不同的病毒或/和病变细胞。
本发明所提出清除血液中病毒或病变细胞的方法有三种实施方式：
1.用于血站血液流通过程中对病毒和病毒核酸片段的体外快速清除；
将血液或血液制品流经一个装有磁性复合微粒的吸附装置，使血液中的病毒和病毒核酸片段被磁性复合微粒吸附，流出的即为净化的血液；此方法的温度最好在15～25℃，血液流经吸附装置的时间为10～30分钟，由于血站的进出血液所含有病毒和病毒核酸为常见的几种，所以此方式所用的磁性复合微粒是1-5种生物大分子微粒的混合或组合。净化后的血液或血液制品即可贮存或用于临床。
2.用于病人治疗过程中血液在体外快速净化并回输；
首先要确定病人血液中所含病毒或病变细胞的种类，以选择确定磁性复合微粒表面固定的特异性生物大分子，其方式与血液透析原理相同；将患者血液安全地引出体外，流经一个装有磁性复合微粒的吸附装置，使血液中的病毒或/和病变细胞被磁性复合微粒吸附，再将流出的净化血液输回患者体内；此方式的温度最好在30～40℃，血液流经吸附装置的时间为10～30分钟。
3.用于危重病人治疗过程中体内循环吸附、体外分离清除并回输；
首先要确定病人血液中所含病毒或病变细胞的种类，以选择确定磁性复合微粒表面固定的特异性生物大分子；以注射液为介质将磁性复合微粒导入患者血液中，经2～8天体内循环吸附，再将患者血液安全引出，流经一个固定磁场，血液中的磁性复合微粒在磁场中被吸附固定，流出的净化血液回输至患者体内。此方式血液在固定磁场的流经时间不少于1分钟，磁场强度不小于3000高斯，为防止磁性微粒对血管的阻塞(粒径过大)同时保证磁性复合微粒不被组织吸收(粒径过小)，所用磁性复合微粒的粒径在0.1～1μm。
实现本发明所提出清除血液中病毒和病变细胞方法的关键装置是装有磁性复合微粒的吸附装置，其结构原理为：在一两端设有进出口的管状容器内，装有胶态溶液形式的磁性复合微粒，该磁性复合微粒均匀分布，其固形物含量在1mg/mL～20mg/mL之间；为防止血液流动中因涡流造成的溶血现象，吸附装置两端进出口的口径应与设备(血液过滤机或血液透析机)中血液流经管路的口径一致；为使血液与磁性复合微粒充分接触，吸附装置的管径应大于设备流经管路口径，以降低流速，增加接触时间；吸附装置的管长取决于血液在其中需要流经的时间，流经时间越长管越长，但管长与管径成反比，即管径越大，管长越短；所以，吸附装置管状容器可以是粗短的直管，也可以是较长的螺线管；为防止血流带走磁性复合微粒，使血液与磁性复合微粒分离，在吸附装置进出口的外周设置有固定磁场，以吸附流出的磁性复合微粒。由于本发明的吸附装置是与已有设备套接使用，已构成独立的产品，故两端的进出口有密封盖，且有密封的无菌外包装。
本发明的吸附装置在血站的使用(方式1)，其吸附管可采用粗大的直管，这样流量更大些；其内的磁性复合微粒可采用微米级，这样可降低成本；管内磁性复合微粒表面所固定的生物大分子，可以是几种微粒的混合，也可以是几种复合微粒在管内分区段的组合。本发明的吸附装置在体外血液循环净化中的使用(方式2)，其吸附管可使用较长的螺线管，这样使吸附更彻底；此方式的应用还需结合血液体外循环系统的使用，以保证患者血液正常的流出速度和合适的回输静脉压，同时调节磁性复合微粒与血液在吸附装置中的反应时间。在这两种方式的使用中，为使病毒或病变细胞更充分地与磁性复合微粒接触，可在吸附装置外周设置一可变电磁场，以带动微粒在吸附管内的运动；为提高净化血液的安全性，可在设备的后管路(吸附管以后)设置一个固定磁场(永磁铁或电磁场)，使净化血液流出时再次吸附流失的磁性微粒，处理结束清洗设备时，撤去磁场，磁粒即被清除。
实现本发明用于危重病人治疗过程中体内循环吸附体外分离清除方法的装置(方式3)，在分离回收磁性复合微粒时，是与血液体外循环机配合使用，在循环机上血液流经的管路设有外加磁场，实现血液中磁性复合微粒吸附和分离。
由上述内容可见，本发明采用的磁性复合微粒其表面所固定的生物大分子应对血液制品和患者血液内病毒或/和病毒核酸和病变细胞有特异性的亲和反应。其具体的对应物及制备在现有技术中已为人熟知。如，清除血液中乙型肝炎病毒可选择特异性的抗体IgG-HBs，并通过该抗体的Fc端将其固定在磁性复合微粒表面以实现吸附；HIV感染者血液内会存在一定的RNA病毒片段，可通过对HIV基因序列比对，应用现有的生物信息学BLAST分析软件，筛选出针对HIV核酸片段特异性的DNA探针序列，合成并将其固定在磁性复合微粒表面，通过磁性复合微粒表面探针与血液中核酸片段的特异性杂交反应即可除去病毒的核酸片段；还可以通过将丙型肝炎患者外周血中病变的单核细胞表面受体的特异性抗体固定在磁性复合微粒以清除相应的病变细胞。本发明可针对单个病毒的清除，也可针对多种病毒的同时清除，如伴随着HIV-1感染的同时，会引发巨细胞病毒(CMV)、乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)的感染，因此，通过固定有几种特异性抗体的磁性复合微粒的同时应用，可从被病毒感染血液中清除多种病毒。
本发明根据感染血液病毒的不同情况，通过磁性复合微粒表面固定的DNA序列或抗体对血液中病毒颗粒、RNA片段以及被感染细胞的清除，实现清除血液中病毒粒子或病变细胞的目的。本发明解决了目前热灭活法、S/D法、干热灭活法等已有技术不能彻底清除血液中病毒的缺点，与膜法相比，具有不会影响血液中正常组分的优势。此外，本发明具有操作简单、特异性强、无残留、安全可靠、无毒副作用的优点，这对改变目前血液制品和患者血液中病毒清除的现状具有非常重要的意义。
具体实施方式
例1：本实施例仅说明所用Fe3O4/Au组装型磁性复合微粒的制备，但不限于本例所述的范围：
购得商品化磁性Fe3O4纳米微粒，用高纯水反复洗涤至中性，配制成悬浮液；取25mL的Fe3O4悬浮液，磁性分离后，弃上清液，加入H2O∶C2H5OH(体积比1∶1)的混合溶剂250ml左右，然后加入三巯基丙基-3乙氧基硅烷2mL，50℃反应10小时进行硅烷化处理，磁性分离后用双蒸水反复洗涤至中性，完成表面修饰；取30mL表面修饰有功能基团的磁性微粒(固形物含量为4mg/mL)，磁性分离去上清，然后加入100mL粒径为20nm的胶体金，在振荡器上反应5-8小时，使其组装在磁性颗粒的表面，形成组装型磁性复合微粒Fe3O4/Au。
例2：本实施例说明与病毒、病毒颗粒以及被病毒感染细胞具有亲和作用的生物分子，如抗体、核酸探针等，在磁性复合微粒表面的固定化方法。
以HIV病毒衣壳蛋白gp120的特异性抗体的固定化为例.可依据不同磁性复合微粒的特点通过不同的方法进行固定化，若表面含有胶体金和金壳层的磁性复合微粒，可在0.01的PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液中将抗体与磁性复合微粒混合约10～30min，就可方便地将抗体固定在其表面；若磁性复合微粒表面带有氨基，可通过戊二醛为交联剂的二步法将抗体通过希夫碱的形成固定化；带有羧基的磁性复合微粒，可利用水溶性碳二亚胺为偶联剂将抗体固定在微粒表面。固定有抗体的磁性复合微粒可将血液制品或患者血液中的病毒颗粒进行清除。
对核酸探针的固定，可将所选择特异性探针在合成过程中进行氨基或生物素标记，然后通过共价键作用或生物素-亲和素体系将寡核苷酸探针在磁性复合微粒表面固定化。
例3：本实施例用于说明针对HIV-1病毒特定区域的寡聚核苷酸的筛选
通过HIV-1基因序列比对和BLAST软件分析可筛选HIV-1探针序列，如筛选序列可作为5′LTR区的保守序列的互补链。这一序列存在于不同的HIV-1株中，已有技术表明该序列具有一定的应用价值。
Claims (3)
1.一种用磁性复合微粒对血站血液中病毒及病变细胞清除的方法，是将血液或血液制品流经一个装有磁性复合微粒的吸附装置，利用磁性复合微粒作为反应和分离的固相载体，将血液与磁性复合微粒充分接触，使血液中病毒或病变细胞与磁性复合微粒表面的特异性分子反应并被吸附在磁性复合微粒上，再将磁性复合微粒与血液通过外加磁场进行分离，则得到净化血液；所述磁性复合微粒的表面固定有特异性的生物大分子，其能与被清除的病毒或病变细胞发生特异性亲和反应；所述磁性复合微粒以胶体状态存在于水或生理盐水介质中；其特征在于：所述亲和反应的温度为15-25℃，血液流经吸附装置的时间为10-30分钟；所述的磁性复合微粒是1-5种生物大分子微粒的混合或是组合。
2.一种实现权利要求1所述方法的吸附装置，其特征在于，在一两端设有进出口的管状容器内，装有胶态溶液形式的磁性复合微粒，该磁性复合微粒均匀分布，其固形物含量在1mg/mL～20mg/mL之间；吸附装置两端进出口的口径应与设备中血液流经管路的口径一致；吸附装置的管径应大于设备流经管路口径。
3.根据权利要求2所述的吸附装置，其特征在于，所述的吸附装置管状容器可以是直管，或是螺线管；在吸附装置进出口的外周设置有固定磁场，在两端的进出口有密封盖。
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