JP2007238479A

JP2007238479A - ハイドロキシアパタイトに吸着された有機物の溶出方法及び該溶出方法を用いた有機物の精製方法

Info

Publication number: JP2007238479A
Application number: JP2006060782A
Authority: JP
Inventors: Tatsuki Sato; 達記佐藤; Akihito Watanabe; 彰仁渡邊
Original assignee: Denka Seiken Co Ltd
Current assignee: Denka Seiken Co Ltd
Priority date: 2006-03-07
Filing date: 2006-03-07
Publication date: 2007-09-20

Abstract

【課題】ハイドロキシアパタイトを用いてタンパク質や核酸等のような有機物を精製する方法において、該有機物が吸着されたハイドロキシアパタイトからの該有機物の溶出量を増大させ、回収率を高めることができる手段を提供すること。
【解決手段】ポリペプチド及びその複合体並びに核酸及びその複合体から成る群から選ばれる少なくとも１種の有機物が吸着されたハイドロキシアパタイトを溶出液と接触させて前記有機物を前記ハイドロキシアパタイトから溶出する方法は、溶出液が、アミノ酸又はその塩を含むことを特徴とする。
【選択図】図２

Description

本発明は、ハイドロキシアパタイトに吸着したポリペプチド若しくはその複合体又は核酸若しくはその複合体である有機物を効果的に溶出させる方法に関するものである。

ハイドロキシアパタイトは無機成分から構成されているため、生物学的には不活性で生理活性物質の不活化が起きにくい事が知られている。また、核酸や生物活性タンパク質との親和性が高いため、ワクチン、血液タンパク、成長ホルモン、食品添加物、インターフェロン等の精製に応用されている（特許文献１、非特許文献１）。

ハイドロキシアパタイトに吸着するタンパク質や核酸等のような有機物の中には、該吸着が強固なものが存在する。そのような有機物を溶出させる場合には、従来、溶出液中のリン酸イオン濃度を増加させるという方法が採られているが、溶出量は十分ではなく、回収率が低くなるという問題があった。

特開2000-262280ウイルスまたはウイルス性抗原の精製方法およびワクチンの製造方法 Sumisaki Tsuru et.al. Bio-Medical Materials and Engineering

従って、本発明の目的は、ハイドロキシアパタイトを用いてタンパク質や核酸等のような有機物を精製する方法において、該有機物が吸着されたハイドロキシアパタイトからの該有機物の溶出量を増大させ、回収率を高めることができる手段を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、タンパク質や核酸等のような有機物が吸着されたハイドロキシアパタイトから該有機物を溶出させる際に、アミノ酸又はその塩を添加した溶出液を用いることで高い回収率が得られることを見出し、本願発明を完成した。

すなわち、本願発明は、ポリペプチド及びその複合体並びに核酸及びその複合体から成る群から選ばれる少なくとも１種の有機物が吸着されたハイドロキシアパタイトを溶出液と接触させて前記有機物を前記ハイドロキシアパタイトから溶出する方法において、該溶出液が、アミノ酸又はその塩を含むことを特徴とする溶出方法を提供する。また、本願発明は、そのような溶出方法により溶出工程が行なわれることを特徴とする有機物の精製方法を提供する。

本発明の方法によれば、従来法ではハイドロキシアパタイトからの溶出が困難であったタンパク質又は核酸等の有機物を高い回収率で得る事が可能である。

本発明の溶出方法は、タンパク質や核酸等のような有機物がハイドロキシアパタイトに吸着する性質を利用して、ハイドロキシアパタイトを用いて前記有機物を精製する方法において、該ハイドロキシアパタイトに吸着した前記有機物を該ハイドロキシアパタイトから溶出する際の溶出方法として、特に好適に用いられる。従って、本発明は、本発明の溶出方法と共に、該溶出方法を用いた精製方法をも提供するものである。

本発明の溶出方法により溶出される有機物は、ポリペプチド及びその複合体並びに核酸及びその複合体から成る群から選ばれる少なくとも１種の有機物である。ここで、「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合したものを意味し、タンパク質も包含される。「複合体」という語は、ポリペプチド又は核酸と、他の物質とが結合した物質を意味し、その例としてはポリペプチドの場合には糖タンパク質やリポタンパク質等、核酸の場合には核酸とタンパク質の複合体等が挙げられる。該有機物は、ハイドロキシアパタイトに吸着するものであれば特に限定されないが、具体例としては、酵素、抗体、膜タンパク質、ウイルス、ワクチン用抗原、ssDNA、dsDNA、RNA、プラスミドDNA等の生化学分野及び医療学分野でタンパク質又は核酸と分類されるものが挙げられる。

本発明では、目的とする有機物を吸着させる固相担体として、焼成して合成されたハイドロキシアパタイトが用いられ、特にセラミック化して合成されたハイドロキシアパタイトがより好ましい。焼成し、セラミック化する事で物理的強度を増加し、カラムクロマトグラフィー法を適用する場合においても、系内で加えられる圧力に耐え得る粒子を形成する事ができる。また、平均粒径が10〜100μmの球状多孔質粒子である事が好ましい。粒子を球状とする事で単位体積当たりの表面積を最も大きくする事ができ、吸着能を増加する事ができる。また、粒子を多孔質にすることにより単位体積当たりの表面積が大きくなり、吸着能を増加する事ができる。

目的の有機物をハイドロキシアパタイトに吸着させる方法については特に限定されないが、試料原液中にハイドロキシアパタイトを投入して目的の有機物を吸着させるバッチ法、試料原液をハイドロキシアパタイトが充填されたカラム又は流動床筒内に流入することにより目的の有機物を吸着させるカラムクロマトグラフィー法又は吸着流動床法等が挙げられる。

溶出は、目的の有機物が吸着されたハイドロキシアパタイトを溶出液と接触させることにより行なわれ、例えば有機物が吸着されたハイドロキシアパタイトを溶出液中に浸漬すること等により行なうことができる。あるいは、カラムクロマトグラフィー法が適用される場合であれば、有機物が吸着されたカラムに溶出液を添加することにより、溶出を行なうことができる。

本発明で用いられる溶出液は、アミノ酸又はその塩を含む。該溶出液は好ましくは水溶液である。該アミノ酸又はその塩としては、酸性アミノ酸又は塩基性アミノ酸が好ましい。酸性アミノ酸は等電点が5.5以下のもので、特に3付近で等電点を持ち、安価で入手可能なグルタミン酸が好ましい。塩基性アミノ酸は等電点が7.0以上のものが好ましく、特に最も塩基性の強いアミノ酸であるアルギニンが好ましい。アミノ酸の塩としては、ナトリウム塩やカリウム塩のようなアルカリ金属塩が好ましい。溶出液に含まれるアミノ酸又はその塩は１種類でもよいし、複数でも良い。溶出液中の濃度は特には限定されないが、アミノ酸又はその塩のいずれか１種類を用いる場合でも複数を用いる場合でも、その合計濃度が0.1M以上であれば高い溶出効果が得られる。なお、特に限定されないが、合計濃度は通常3M以下である。なお、許容される範囲内でアミノ酸若しくはその塩及び／又は後述する塩類濃度を高めることにより、目的とする有機物の溶出効率を高めることができる。本発明で用いられる溶出液のpHは、特に限定されないが、溶出対象の有機物の生化学活性を保持したい場合には、好ましくはpH５〜９、さらに好ましくはpH６〜８の中性付近とすることが望ましい。中性付近の溶出液を用いることにより、該有機物の活性を損なわずに溶出することができる。

本発明で用いられる溶出液には、塩類をさらに含ませてもよい。ここで、塩類とは、酸と塩基の反応によって生じる塩のことを言い、リン酸塩、酢酸塩などのようなpH緩衝能を有する弱酸とその共役塩基の塩又は弱塩基とその共役酸の塩が包含される。ここに例示したものに限定されず、目的や用途に合わせて適宜好ましいものを選択できる。塩類としては、ナトリウム塩やカリウム塩のようなアルカリ金属塩が好ましい。また、溶出液に含まれる塩類は１種類でもよいし、複数でも良い。例えば、前記のとおり溶出対象の有機物の生化学活性を保持したい場合には、中性付近でpH緩衝能を有するリン酸塩を含ませることが好ましい。該塩類の溶出液中の合計濃度は、特に限定されないが、通常、0.005Mから3M、好ましくは0.1Mから2Mの範囲である。

ハイドロキシアパタイトに吸着させた有機物を溶出させる前に、前記溶出液よりも低濃度のアミノ酸若しくはその塩、及び／又は低濃度の塩類を含む前処理液により洗浄処理してもよい。この洗浄工程により、試料中に存在する目的とする有機物以外の夾雑物等を可能な限り排除することができる。塩類濃度、アミノ酸又はその塩の濃度は直線勾配又は曲線勾配のいずれかを用いて増加させるものであってもよい。この工程により、ハイドロキシアパタイトに吸着した物質のうち、吸着力の弱い物質が溶出されるため、目的とする有機物と夾雑物とを選択的に分離することが可能である。

さらに、本発明の溶出方法は、ポリペプチド及びその複合体並びに核酸及びその複合体から成る群から選ばれる少なくとも１種の精製すべき有機物を含む原液をハイドロキシアパタイトと接触させる第１工程と、該ハイドロキシアパタイトを前記原液から分離する第２工程と、分離した前記ハイドロキシアパタイトを溶出液と接触させて前記有機物を前記ハイドロキシアパタイトから溶出する第３工程とを含む有機物の精製方法において、前記第３工程を行なう方法として用いることができる。すなわち、本発明は、前記の精製方法において、前記第３工程が本発明の溶出方法により行なわれることを特徴とする有機物の精製方法をも提供する。

前記第１工程では、精製すべき有機物をハイドロキシアパタイトに吸着させる。吸着させる方法については特に限定されないが、試料原液中にハイドロキシアパタイトを投入して精製すべき有機物を吸着させるバッチ法、試料原液をハイドロキシアパタイトが充填されたカラム又は流動床筒内に流入することにより精製すべき有機物を吸着させるカラムクロマトグラフィー法又は吸着流動床法等が挙げられる。カラムクロマトグラフィー法及び吸着流動床法は多量処理、再現性に優れており、本発明の精製方法の一応用例として好ましい。なお、前述したとおり、ハイドロキシアパタイトを平均粒子径10〜100μｍの球状多孔質粒子とした場合には、カラムクロマトグラフィー法及び吸着流動床法を適用する際に有利である。

続く第２工程では、第１工程で用いたハイドロキシアパタイトを前記原液から分離する。バッチ法が適用される場合、一般的に濾過法、遠心分離法、傾斜法等が用いられるが、ハイドロキシアパタイトとして磁性吸着剤を用いた場合は、磁気分離法を用いることができる。カラムクロマトグラフィー法が適用される場合、カラムを洗浄し、カラムに吸着した精製すべき有機物以外の物質を除去する工程が該第２工程に相当する。

続く第３工程では、本発明の溶出方法により、ハイドロキシアパタイトに吸着した有機物の溶出が行なわれる。例えば、バッチ法が適用される場合、有機物が吸着されたハイドロキシアパタイトを本発明で用いられる溶出液中に浸漬することにより有機物を溶出することができる。カラムクロマトグラフィー法が適用される場合、有機物が吸着されたカラムに本発明で用いられる溶出液を添加することにより、有機物を溶出することができる。

また、前記第２工程と第３工程の間に、前記溶出液よりも低濃度のアミノ酸若しくはその塩、及び／又は前記溶出液よりも低濃度の塩類を含む前処理液で処理する工程をさらに含ませてもよい。この工程により、前記原液中に存在する精製すべき有機物以外の夾雑物等を可能な限り排除することができ、有機物の純度を高めることができるため好ましい。

以下、本発明の実施例に基づき具体的に説明する。本発明は下記実施例に限定されるものではない。

ハイドロキシアパタイトを吸着担体として用いたクロマトグラフィー法を用いて、下記に示す手順にてインフルエンザウイルスの回収を行った。

[溶出液]
溶出液は以下３種類を準備した。
従来の方法の溶出液１
400mMリン酸緩衝液pH 7.0。
本発明の方法の溶出液２
酸性アミノ酸であるグルタミン酸Naが1M濃度、リン酸ナトリウムが400mM濃度、pHが7.0になるように調製した。
本発明の方法の溶出液３
塩基性アミノ酸であるアルギニン塩酸塩が1M濃度、リン酸ナトリウムが400mM濃度、pHが7.0になるように調製した。

［実験方法］
1. 発育鶏卵で培養したH3N2 A/New York株インフルエンザウイルスをショ糖密度勾配遠心で精製し、精製ウイルスを10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.0で25倍に希釈した。

2. 平均粒子径20μmのハイドロキシアパタイト粒子が5mL充填されたカラムを10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.0で平衡化し、希釈精製ウイルス50mLを流速1.0mL/分でカラムに供給した。

3. 次に10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.0でカラムを流速1.0mL/分で洗浄した。

4. 予め準備しておいた各溶出液１から３を用いて溶出した。流速1.0mL/分で溶出液を流して吸着したウイルスを溶出し、カラムを通液した溶出液は2mL/フラクションで回収した。

5. 次に各フラクションのタンパク質含量をUV (280nm) 吸収スペクトルにより調べた。さらに、各フラクション中のインフルエンザウイルス生物活性を赤血球凝集アッセイ(HA)により調べた。これらの結果を図1〜3に示す。

6. 図1の結果から従来の溶出方法である400mMリン酸ナトリウムを用いた場合、溶出ピークのUV280nmの吸収（タンパク質量を示す）が最大で400mAu程度である。それに対して本発明の方法（アミノ酸添加群）では、図2及び図3より溶出ピークのUV280nmの数値がいずれも1000mAuを超えている。このことからも本発明が従来の溶出液よりも溶出効果が高いことがわかる。また、従来の溶出方法である400mMリン酸ナトリウムに比較して本発明の溶出方法の方が高いタンパク回収率（UV280nm）及びインフルエンザウイルス回収率（HA活性）でいずれも高い結果が得られた。

400mMリン酸Na pH7.0を溶出液として用いた時のインフルエンザウイルスの溶出パターンである。 1Mグルタミン酸Na 400mMリン酸Na pH7.0を溶出液として用いた時のインフルエンザウイルスの溶出パターンである。 1Mアルギニン塩酸塩 400mMリン酸Na pH7.0を溶出液として用いた時のインフルエンザウイルスの溶出パターンである。

Claims

ポリペプチド及びその複合体並びに核酸及びその複合体から成る群から選ばれる少なくとも１種の有機物が吸着されたハイドロキシアパタイトを溶出液と接触させて前記有機物を前記ハイドロキシアパタイトから溶出する方法において、該溶出液が、アミノ酸又はその塩を含むことを特徴とする溶出方法。
前記溶出液が前記アミノ酸又はその塩の水溶液である請求項１記載の方法。
前記アミノ酸又はその塩の合計濃度が0.1Mから3Mである請求項１又は２に記載の方法。
前記溶出液がリン酸塩をさらに含む請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
前記リン酸塩の濃度が0.005Mから3Mである請求項４記載の方法。
前記溶出液のpHが６〜８である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
前記ハイドロキシアパタイトが、平均粒子径10μm〜100μmの球状多孔質である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
前記有機物が、ウイルス、酵素、抗体、DNA又はRNAである請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
前記溶出液と接触させる前に、糖類、アミノ酸及びその塩、並びにリン酸塩から成る群から選ばれる少なくとも１種の物質を前記溶出液よりも低濃度で含む前処理液で処理する工程をさらに含む請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
ポリペプチド及びその複合体並びに核酸及びその複合体から成る群から選ばれる少なくとも１種の精製すべき有機物を含む原液をハイドロキシアパタイトと接触させる第１工程と、該ハイドロキシアパタイトを前記原液から分離する第２工程と、分離した前記ハイドロキシアパタイトを溶出液と接触させて前記有機物を前記ハイドロキシアパタイトから溶出する第３工程とを含む有機物の精製方法において、前記第３工程が、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法により行なわれることを特徴とする、有機物の精製方法。
前記第２工程と第３工程の間に、糖類、アミノ酸及びその塩、並びにリン酸塩から成る群から選ばれる少なくとも１種の物質を前記溶出液よりも低濃度で含む前処理液で処理する工程をさらに含む請求項１０記載の方法。