JP2007238474A - 難水溶性金属化合物に吸着した有機物の溶出方法及び該溶出方法を用いた有機物の精製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】難水溶性金属化合物を用いてタンパク質や核酸等のような有機物を精製する方法において、該有機物が吸着された難水溶性金属化合物からの該有機物の溶出量を増大させ、回収率を高めることができる手段を提供すること。
【解決手段】ポリペプチド及びその複合体並びに核酸及びその複合体から成る群から選ばれる少なくとも１種の有機物が吸着された難水溶性金属化合物を溶出液と接触させて前記有機物を前記難水溶性金属化合物から溶出する方法は、溶出液が、糖類及び／又はアミノ酸若しくはその塩を含むことを特徴とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、難水溶性金属化合物に吸着したポリペプチド若しくはその複合体又は核酸若しくはその複合体である有機物を効果的に溶出させる方法に関するものである。

難水溶性金属化合物、特に元素周期表2族に属するバリウム、カルシウム及びマグネシウムの硫酸塩、リン酸塩、水酸化物及び炭酸塩、並びに典型金属元素であるアルミニウムのリン酸塩及び水酸化物は、生物学的には不活性で生理活性物質の不活化が起きにくい事が知られている。また、生物活性タンパク質や核酸との親和性が高いため、ワクチン、血液タンパク、成長ホルモン、食品添加物、インターフェロン等の精製に応用されている（特許文献１、非特許文献１〜６）。

難水溶性金属化合物に吸着するタンパク質や核酸等のような有機物の中には、該化合物に強固に吸着するものが存在する。そのような有機物を溶出させる場合には、従来、溶出液中のアルカリ金属イオン、リン酸イオンもしくはキレート剤濃度を増加させるという方法が採られているが、溶出量は十分ではなく、回収率が低くなるという問題があった。

特開2000-262280ウイルスまたはウイルス性抗原の精製方法およびワクチンの製造方法 Voss, D.:Barium sulphate adsorption and elution of the 'prothrombin complex' factors., Scand J Clin Lab Invest. 1965 ; 17 : Suppl 84 : 119-128. C.B.Reimer et.al.:Purification of Large Quantities of Influenza Virus by Density Gradient Centrifugation. , Journal of Virology., Dec.1967. 1207-1216 H.Prydz : Studies on Proconvertin (Factor VII) IV. The Adsorption on Barium Sulphate , Scandinav. J. Clin. & Lab. Investigation, 16, 1964, 409-414 Andrzej G. : Inhibition of influenza A virus hemagglutin and induction of interferon by synthetic sialylated glycoconjugates, Can.J.Microbiol., Vol37, 1991,233-237 糖鎖工学初版第１刷 549頁〜552頁（産業調査会 バイオテクノロジー情報センター） Tsutomu Kawasaki : Hydroxyapatite as a liquid chromatographic packing., Journal of Chromatography, 544. 1991.147-184

従って、本発明の目的は、難水溶性金属化合物を用いてタンパク質や核酸等のような有機物を精製する方法において、該有機物が吸着された難水溶性金属化合物からの該有機物の溶出量を増大させ、回収率を高めることができる手段を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、タンパク質や核酸等のような有機物が吸着された難水溶性金属化合物から該有機物を溶出させる際に、糖類および／またはアミノ酸若しくはその塩を添加した溶出液を用いることで高い回収率が得られることを見出し、本願発明を完成した。

すなわち、本願発明は、ポリペプチド及びその複合体並びに核酸及びその複合体から成る群から選ばれる少なくとも１種の有機物が吸着された難水溶性金属化合物を溶出液と接触させて前記有機物を前記難水溶性金属化合物から溶出する方法において、該溶出液が、糖類及び／又はアミノ酸若しくはその塩を含むことを特徴とする溶出方法を提供する。また、本願発明は、そのような溶出方法により溶出工程が行なわれることを特徴とする有機物の精製方法を提供する。

本発明の方法によれば、従来法では難水溶性金属化合物からの溶出が困難であったタンパク質又は核酸等の有機物を高い回収率で得る事が可能である。

本発明の溶出方法は、タンパク質や核酸等のような有機物が難水溶性金属化合物に吸着する性質を利用して、難水溶性金属化合物を用いて前記有機物を精製する方法において、該難水溶性金属化合物に吸着した前記有機物を該難水溶性金属化合物から溶出する際の溶出方法として、特に好適に用いられる。従って、本発明は、本発明の溶出方法と共に、該溶出方法を用いた精製方法をも提供するものである。

本発明の溶出方法により溶出される有機物は、ポリペプチド及びその複合体並びに核酸及びその複合体から成る群から選ばれる少なくとも１種の有機物である。ここで、「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合したものを意味し、タンパク質も包含される。「複合体」という語は、ポリペプチド又は核酸と、他の物質とが結合した物質を意味し、その例としてはポリペプチドの場合には糖タンパク質やリポタンパク質等、核酸の場合には核酸とタンパク質の複合体等が挙げられる。該有機物は、難水溶性金属化合物に吸着するものであれば特に限定されないが、具体例としては、酵素、抗体、膜タンパク質、ウイルス、ワクチン用抗原、ssDNA、dsDNA、RNA、プラスミドDNA等の生化学分野及び医療学分野でタンパク質又は核酸と分類されるものが挙げられる。

本発明で用いられる難水溶性金属化合物としては、元素周期表２族に属するバリウム、カルシウム及びマグネシウムの硫酸塩、リン酸塩、水酸化物及び炭酸塩、並びに典型金属元素であるアルミニウムのリン酸塩及び水酸化物が挙げられる。これらの物質の形状等は特に限定されないが、平均粒子径0.1〜300μmの粒子状とすることもできる。難水溶性金属化合物が充填されたカラム又は流動床筒を用いるカラムクロマトグラフィー法又は吸着流動床法によって目的の有機物を難水溶性化合物に吸着させる場合には、このような粒子状の難水溶性金属化合物を有利に用いることができる。

目的の有機物を難水溶性金属化合物に吸着させる方法については特に限定されないが、試料原液中に難水溶性金属化合物を投入して目的の有機物を吸着させるバッチ法、試料原液を難水溶性金属化合物が充填されたカラム又は流動床筒内に流入することにより目的の有機物を吸着させるカラムクロマトグラフィー法又は吸着流動床法等が挙げられる。

溶出は、目的の有機物が吸着された難水溶性金属化合物を溶出液と接触させることにより行なわれ、例えば有機物が吸着された難水溶性金属化合物を溶出液中に浸漬すること等により行なうことができる。あるいは、カラムクロマトグラフィー法が適用される場合であれば、有機物が吸着されたカラムに溶出液を添加することにより、溶出を行なうことができる。

本発明で用いられる溶出液は、糖類及び／又はアミノ酸若しくはその塩を含む。アミノ酸の塩としては、ナトリウム塩やカリウム塩のようなアルカリ金属塩が好ましい。該溶出液は好ましくは水溶液である。溶出液に含まれる糖類又はアミノ酸若しくはその塩は１種類でもよいし、複数でも良い。また、糖類並びにアミノ酸及びその塩を全て含んでいても良い。溶出液中の濃度は、特に限定されないが、糖類又はアミノ酸若しくはその塩のいずれか１種類を用いる場合でも複数を用いる場合でも、その合計濃度が0.1M以上であれば高い溶出効果を得ることができる。なお、特に限定されないが、合計濃度は通常3
M以下である。なお、許容される範囲内で糖類及び／又はアミノ酸若しくはその塩の濃度を高めることにより、あるいはまた後述の溶出液中に含まれ得る塩類濃度を高めることにより、目的とする有機物の溶出効率を高めることができる。本発明で用いられる溶出液のpHは、特に限定されないが、溶出対象の有機物の生化学活性を保持したい場合には、好ましくはpH５〜９、さらに好ましくはpH６〜８の中性付近とすることが望ましい。中性付近の溶出液を用いることにより、該有機物の活性を損なわずに溶出することができる。

本発明で用いられる溶出液には、塩類をさらに含ませてもよい。ここで、塩類とは、酸と塩基の反応によって生じる塩のことを言い、塩化ナトリウム等のほか、リン酸塩、クエン酸塩などのようなpH緩衝能を有する弱酸とその共役塩基の塩又は弱塩基とその共役酸の塩も包含される。ここに例示したものに限定されず、目的や用途に合わせて適宜好ましいものを選択できる。また、塩類としては、ナトリウム塩やカリウム塩のようなアルカリ金属塩が好ましい。また、溶出液に含まれる塩類は１種類でもよいし、複数でも良い。例えば、前記のとおり溶出対象の有機物の生化学活性を保持したい場合には、中性付近でpH緩衝能を有するリン酸塩及び／又はクエン酸塩を含ませることが好ましい。該塩類の溶出液中の合計濃度は、特に限定されないが、通常、0.005Mから3M、好ましくは0.1Mから2Mの範囲である。

本発明で用いられる溶出液に含まれる糖類としては、単糖類、少糖類及び多糖類のほか、糖分子の官能基を置換、還元等して得られる誘導体(アミノ糖、糖アルコール、糖リン酸、ウロン酸など)も包含される。これらのうち、単糖類、少糖類及びそれらの誘導体が好ましい。溶出液に添加する糖類は、固液分離を容易にするために、好ましくは溶出液に可溶化した状態で用いる。すなわち、溶出液に可溶の糖類が好ましく、例えば溶出液が水溶液であれば水溶性の糖類を用いることが好ましい。好ましい糖類の具体例としては、七炭糖のセドヘプツロース、六炭糖のグルコース、フルクトース、リブロース、ガラクトース、タロース、アロース、マンノース、五炭糖のアピオース、リボース、アラビノース、キシロース、二糖のマルトース、ラクトース、スクロース、可溶性の多糖類、少糖(オリゴ糖)のフルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、デオキシ糖のデオキシリボース、フコース、ラムノース、ウロン酸のアスコルビン酸(ビタミンC)、グルクロン酸、ガラクツロン酸、アミノ糖のグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-アセチルグルコサミン、糖アルコールのグリセリン、キシリトール、ソルビトール、糖リン酸のグルコース1-リン酸、グルコース6-リン酸、フルクトース1,6-ビスリン酸および5-ホスホリボシル1-ピロリン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明で用いられる溶出液に含まれるアミノ酸又はその塩は、固液分離を容易にするために、溶出液に可溶化した状態で用いることが望ましい。すなわち、溶出液に可溶のアミノ酸又はその塩が好ましく、例えば溶出液が水溶液であれば親水性アミノ酸又はその塩を用いることが好ましい。具体例としては、塩基性アミノ酸のアルギニン、リジン、ヒスチジン、酸性アミノ酸のグルタミン酸、アスパラギン酸およびそれらのアミドであるグルタミン、アスパラギン、中性アミノ酸のグリシン、トレオニン、セリンなど、並びにこれらの塩が挙げられるが、これらに限定されない。なお、前記のとおり、溶出液のpHを中性付近として用いることが望まれる場合には、溶出液に添加するアミノ酸又はその塩としては、中性付近で陽イオン又は陰イオンの存在比率の高い塩基性アミノ酸若しくは酸性アミノ酸またはそれらの塩が好ましく用いられ得る。

難水溶性金属化合物に吸着させた有機物を溶出させる前に、糖類、アミノ酸及びその塩、並びに塩類から成る群から選ばれる少なくとも１種以上の物質を前記溶出液よりも低濃度で含む前処理液を用いて処理してもよい。この処理工程により、試料中に存在する目的とする有機物以外の夾雑物等を可能な限り排除することができる。塩類濃度、糖類濃度、アミノ酸若しくはその塩の濃度は直線勾配又は曲線勾配のいずれかを用いて増加させるものであってもよい。この工程により、難水溶性金属化合物に吸着した物質のうち、吸着力の弱い物質が溶出されるため、目的とする有機物と夾雑物とを選択的に分離することが可能である。

さらに、本発明の溶出方法は、ポリペプチド及びその複合体並びに核酸及びその複合体から成る群から選ばれる少なくとも１種の精製すべき有機物を含む原液を難水溶性金属化合物と接触させる第１工程と、該難水溶性金属化合物を前記原液から分離する第２工程と、分離した前記難水溶性金属化合物を溶出液と接触させて前記有機物を前記難水溶性金属化合物から溶出する第３工程とを含む有機物の精製方法において、第３工程を行なう方法として用いることができる。すなわち、本発明は、前記の精製方法において、前記第３工程が本発明の溶出方法により行なわれることを特徴とする有機物の精製方法をも提供する。

前記第１工程では、精製すべき有機物を難水溶性金属化合物に吸着させる。吸着させる方法については特に限定されないが、試料原液中に難水溶性金属化合物を投入して精製すべき有機物を吸着させるバッチ法、試料原液を難水溶性金属化合物が充填されたカラム又は流動床筒内に流入することにより精製すべき有機物を吸着させるカラムクロマトグラフィー法又は吸着流動床法等が挙げられる。カラムクロマトグラフィー法及び吸着流動床法は多量処理、再現性に優れており、本発明の精製方法の一応用例として好ましい。なお、前述したとおり、難水溶性金属化合物を平均粒子径0.1〜300μｍの粒子状とした場合には、カラムクロマトグラフィー法及び吸着流動床法を適用する際に有利である。

続く第２工程では、第１工程で用いた難水溶性金属化合物を前記原液から分離する。バッチ法が適用される場合、一般的に濾過法、遠心分離法、傾斜法等が用いられるが、難水溶性金属化合物として磁性吸着剤を用いた場合は、磁気分離法を用いることができる。カラムクロマトグラフィー法が適用される場合、カラムを洗浄し、カラムに吸着した精製すべき有機物以外の物質を除去する工程が該第２工程に相当する。

続く第３工程では、本発明の溶出方法により、難水溶性金属化合物に吸着した有機物の溶出が行なわれる。例えば、バッチ法が適用される場合、有機物が吸着された難水溶性金属化合物を本発明で用いられる溶出液中に浸漬することにより有機物を溶出することができる。カラムクロマトグラフィー法が適用される場合、有機物が吸着されたカラムに本発明で用いられる溶出液を添加することにより、有機物を溶出することができる。

また、前記第２工程と第３工程の間に、上記した通り、糖類、アミノ酸及びその塩、並びに塩類から成る群から選ばれる少なくとも１種以上の物質を前記溶出液よりも低濃度で含む前処理液で処理する工程をさらに含ませてもよい。この工程により、前記原液中に存在する精製すべき有機物以外の夾雑物等を可能な限り排除することができ、有機物の純度を高めることができるため好ましい。

以下、本発明の実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

下記に示す手順にてインフルエンザウイルスの回収を行った。硫酸バリウムからなる難水溶性金属化合物を吸着担体として用いたバッチ法にて行った。

[溶出液]
溶出液は以下9種類を準備した。
従来の方法の溶出液１：
12%クエン酸ナトリウム-6%塩化ナトリウム溶出液(pH 7.5)
本発明の方法の溶出液２：
溶出液１に、単糖のグルコースを1M濃度になるように可溶化した溶液(pH7.3)。
本発明の方法の溶出液３：
溶出液１に、二糖のトレハロースを1M濃度になるように可溶化した溶液(pH7.3)。
本発明の方法の溶出液４：
溶出液１に、二糖のマルトースを1M濃度になるように可溶化した溶液(pH7.2)。
本発明の方法の溶出液５：
溶出液１に、二糖のスクロースを1M濃度になるように可溶化した溶液(pH7.5)。
本発明の方法の溶出液６：
溶出液１に、糖アルコールのソルビトールを1M濃度になるように可溶化した溶液(pH7.5)。
本発明の方法の溶出液７：
溶出液１に、塩基性アミノ酸のアルギニン(塩酸塩) を1M濃度になるように可溶化した溶液(pH6.9)。
本発明の方法の溶出液８：
溶出液１に、酸性アミノ酸のグルタミン酸(ナトリウム塩) を1M濃度になるように可溶化した溶液(pH7.2)。
本発明の方法の溶出液９：
溶出液１に、中性アミノ酸のグリシンを1M濃度になるように可溶化した溶液(pH7.2)。

［実験方法］
従来の方法の溶出液１および本発明方法の溶出液２〜９を用いて以下の通りバッチ法によるインフルエンザウイルスの精製回収を行い、インフルエンザウイルスの回収率(% CCA)を求めた。

発育鶏卵で培養されたH3N2 A/New York株インフルエンザウイルスを含有する原料40mL (尿膜腔液 : 0.45μmフィルター処理済み)に、シュウ酸カリウム40mgを添加後、室温で15分間攪拌した。次に難水溶性金属化合物である硫酸バリウム800mgを徐々に添加し、更に室温で30分間攪拌した。

遠心処理(2000rpm,10分,4℃)後、吸着上清を傾斜法により除去し、沈渣に溶出液を20mL添加し、室温で30分間攪拌した。続く遠心処理(2000rpm,10分,4℃)後、溶出液を傾斜法により回収した。

得られた溶出液から2.5mLを採取し、セファデックス G-25（商品名）脱塩カラムで1mLずつ分画処理(移動層:10mM PBS(pH7.2))した。各分画中のインフルエンザウイルス生物活性を赤血球凝集素(HA)価より調べ、HA陽性の5分画をまとめた。このように脱塩処理した溶出液由来の検体と、同様に脱塩処理を行った原料のCCA価を比較することにより、溶出液を用いたインフルエンザウイルスの回収率(% CCA)を求めた。

[結果]
従来の方法の溶出液１および本発明方法の溶出液２〜９を用いた実験結果を下表に示す。通常の溶出液に、糖類ではグルコース、トレハロース、マルトース、スクロース、ソルビトール、アミノ酸ではアルギニン(塩酸塩)、グリシン、グルタミン酸（ナトリウム塩）を各々添加することによりインフルエンザウイルス回収率が90%以上となった。従来の溶出液による回収率が50%未満であったことから、本発明法は従来法と比較して明らかに溶出効果が優れていることがわかる。

Claims (14)

1. ポリペプチド及びその複合体並びに核酸及びその複合体から成る群から選ばれる少なくとも１種の有機物が吸着された難水溶性金属化合物を溶出液と接触させて前記有機物を前記難水溶性金属化合物から溶出する方法において、該溶出液が、糖類及び／又はアミノ酸若しくはその塩を含むことを特徴とする溶出方法。
2. 前記溶出液が前記糖類及び／又はアミノ酸若しくはその塩の水溶液である請求項１記載の方法。
3. 前記糖類及び／又はアミノ酸若しくはその塩の合計濃度が0.1Mから3Mである請求項１又は２記載の方法。
4. 前記糖類が、単糖類若しくは少糖類又はそれらの誘導体である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記溶出液が１種又は２種以上の塩類をさらに含む請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記塩類の合計濃度が0.005Mから3Mである請求項５記載の方法。
7. 前記塩類がリン酸塩及び／又はクエン酸塩である請求項６記載の方法。
8. 前記溶出液のpHが５〜９である請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記難水溶性金属化合物が、バリウム、カルシウム又はマグネシウムの硫酸塩、リン酸塩、水酸化物及び炭酸塩、並びにアルミニウムのリン酸塩及び水酸化物から成る群より選ばれる少なくとも１種である請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記難水溶性金属化合物が、平均粒子径0.1μm〜300μmの粒子状である請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記有機物が、ウイルス、酵素、抗体、DNA又はRNAである請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記溶出液と接触させる前に、糖類、アミノ酸及びその塩、並びに塩類から成る群から選ばれる少なくとも１種の物質を前記溶出液よりも低濃度で含む前処理液で処理する工程をさらに含む請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
13. ポリペプチド及びその複合体並びに核酸及びその複合体から成る群から選ばれる少なくとも１種の精製すべき有機物を含む原液を難水溶性金属化合物と接触させる第１工程と、該難水溶性金属化合物を前記原液から分離する第２工程と、分離した前記難水溶性金属化合物を溶出液と接触させて前記有機物を前記難水溶性金属化合物から溶出する第３工程とを含む有機物の精製方法において、前記第３工程が、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法により行なわれることを特徴とする、有機物の精製方法。
14. 前記第２工程と第３工程の間に、糖類、アミノ酸及びその塩、並びに塩類から成る群から選ばれる少なくとも１種の物質を前記溶出液よりも低濃度で含む前処理液で処理する工程をさらに含む請求項１３記載の方法。