KR101901830B1 - 제한된 공수화 크로마토그래피를 통한 생물학적 산물의 정제 - Google Patents

제한된 공수화 크로마토그래피를 통한 생물학적 산물의 정제 Download PDF

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Abstract

대류성 크로마토그래피, 유동층 또는 공침전 적용과 연관된 항체, 바이러스, 세포 및 세포 기관과 같은 생물학적 물질의 정제에 있어서 제한된 공수화 제제의 사용을 위한 물질들 및 방법들이 제공된다.

Description

제한된 공수화 크로마토그래피를 통한 생물학적 산물의 정제{PURIFICATION OF BIOLOGICAL PRODUCTS BY CONSTRAINED COHYDRATION CHROMATOGRAPHY}
본 출원은 미국 2011년 6월 8일자로 출원된 미국 임시출원 제 61/494,669호, 2011년 6월 8일자로 출원된 미국 임시출원 제 61/494,687호, 2011년 11월 14일자로 출원된 싱가포르 특허출원 제 201108397-9호 및 2012년 5월 31일자로 출원된 미국 임시 출원 제 61/653,950호를 기초로 우선권을 주장하고 있으며, 상기의 각 출원은 본 출원에 전체로서 참조로 병합된다.
본 발명은 생물학적 산물의 정제를 향상시키기 위한 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 바이러스의 정제 및 항체의 정제를 향상시키기 위한 방법에 관한 것이다.
크로마토그래피 방법은 일반적으로 적어도 하나의 화학적 관능성을 보유하여 상기 화학적 관능성에 따라 복합 샘플의 성분들을 분리하기 위해 생분자들과의 상호작용에 활성을 가지고 관여하는 고체 표면의 개발에 의존한다. 이러한 방법들은 흡착 크로마토그래피 방법으로 지칭된다. 흡착 방법들 사이에서 부착된 성분들을 방출하는 화학적 수단에 따라 고체 화학이 서로 상이하나, 동작 원리는 동일하다. 일 예로서 생친화(bioaffinity) 크로마토그래피를 들 수 있으며, 상기 생친화 크로마토그래피에 있어서 불활성 표면이 복합 샘플로부터 관심 대상인 성분에 특이적인 생물학적 리간드로 대체된다. 상기 관심 대상 성분은, 나머지 성분은 그러하지 않으나, 결합 후 이어서 화학적 조건을 변화시킴에 따라 방출될 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 상당한 다양성을 가진 방법들을 대표한다. 불활성 표면은 하전된 화학 그룹으로 공유결합에 의해 대체된다. 음이온 교환 크로마토그래피의 경우, 상기 화학 그룹은 양전하를 가질 수 있다. 충분히 음전하를 갖는 샘플 성분들은 결합되며, 가장 큰 음전하를 갖는 성분이 가장 강하게 결합된다. 음전하가 부족한 샘플 성분들은 결합하지 못한다. 결합된 성분들은 염 구배 증가에 의해 이들의 상호작용 순서에 따라 방출될 수 있으며, 이는 전하 상호작용의 교란의 정도를 점진적으로 증가시켜 음이온 교환기와의 상호작용 강도 순서에 따라 결합된 성분들을 방출할 수 있다. 화학의 차이를 제외하면, 동일한 동작 원리가 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 및 히드록시아파타이트(hydroxyapatite)를 포함하는 소위 혼합-모드 크로마토그래피의 다양한 예들에 적용될 수 있다.
흡착 방법의 화학 관능성에 대한 예외는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography: SEC)이며, 겔 여과 및 겔 침투 크로마토그래피로도 알려져 있다. 분자 및 이러한 적용법에서의 매체의 표면 사이의 화학적 상호작용은 실제적으로 영이다. SEC는 샘플 성분들이 칼럼 내에 충진된 입자들의 기공 내부로 차등 확산됨에 의해 작용한다. 매우 큰 성분들은 상기 기공들로부터 배제되어 입자간 공간으로만 통과된다. (임의적으로) 중간 사이즈의 분자들은 보다 큰 기공들 내부로 확산된다. 이는 분자간 공간에만 접근 가능한 배제된 분자들의 보다 큰 유체 부피로의 접근을 가능케한다. (임의적으로) 작은 분자들은 모든 기공들 내부로 확산될 수 있으며, 이는 더 큰 유체 부피로의 접근을 가능케한다. 소정의 크기 계층의 분자들이 평형 상태에 있는 유체 부피가 커질수록, 칼럼으로부터 이들을 분리시키는데 더 많은 부피의 유체가 요구된다. 따라서, 대형 분자들이 SEC 칼럼으로부터 먼저 용출되고, 이어서 크기가 감소되는 분자 순서대로 용출된다.
침전 방법이 단백질 및 바이러스의 정제를 포함하는 생물학 분야에서 널리 공지되어 있다. 가장 널리 활용되는 방법들 중 두 가지는 소위 염 침전 및 PEG 침전 방법이며, 이들은 우선 배제(preferential exclusion)로 알려진 힘을 이용한다. 상기의 용어는 1980년대 초부터 널리 사용되기 시작했으며, 단백질 및 용해된 분자들(용질)의 상호작용을 서술하기 위한 승인된 용어가 되었다[1-5]. 우선적으로 배제된 용질들은 상기 우선적으로 배제된 용질이 결핍된 물 층으로 둘러싸인 단백질에서 이탈하는 방식으로 단백질과 상호작용한다. 이러한 용질-결핍 존(zone)은 우선 수화 존, 또는 우선 수화 쉘(shell) 혹은 시스(sheath)로 지칭된다. 우선적으로 수화된 단백질들이 용액 내에서 서로 만나면, 이들의 우선 수화 시스가 병합된다. 배제된 용질의 농도가 높을수록, 두 단백질들이 보다 강하게 결합을 유지한다.
암모늄 설페이트, 소듐 시트레이트 및 포타슘 포스페이트와 같은 소위 코스모트로픽(kosmotropic) 염들은 단백질 표면으로부터 강하게 배제된다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 유기 고분자들 역시 단백질 표면들로부터 강하게 배제되는 것으로 알려져 있다[3-5]. 이러한 침전 방법들은 다량의 우선적으로 배제된 제제를 침전되어야 할 종들을 함유하는 샘플 내에 용해시킴으로써 수행된다. 상기 우선적으로 배제된 제제가 문턱 레벨까지 상승함에 따라, 랜덤하게 서로 접촉하는 타겟 종들(target species)이 각각의 우선 수화 시스들로부터의 물을 공유함으로써 결합을 유지할 수 있다. 이는 최종적으로 침전되는 대형 불용성 응집체의 형성을 유도하며, 이후 원심분리 또는 여과에 의해 회수될 수 있다. 침전 방법들은 그러나 바람직하지 않은 한계들을 보유하고 있으며, 이들 중 주요한 것은 정제 성능이 전체적으로 크로마토그래피 방법보다 열등한 것으로 인식되고 있으며, 특히 침전되는 산물의 농도 편차와 연관되어 배치(batch)와 배치 사이에서 높은 편차를 보일 수 있다는 점이다. 회수(recovery) 역시 유사하게 변화될 수 있으며, 관심 대상 산물이 저농도로 존재할 경우 매우 낮을 수 있다. 이러한 문제들은 침전 방법의 매우 불균일한 표면, 즉 침전되어야 할 단백질과의 상호작용에의 의존성에 기인한다. 상업적 제품들은 존재하나, 보다 양호한 회수 및 높은 순도를 제공하는 크로마토그래피로 대부분 대체되고 있다. 그러나, 침전 방법은 크로마토그래피 보다 높은 생산성을 제공할 수 있으며, 재료의 비용이 저렴하고 장치 작동이 용이하다는 점 때문에 관심이 남아있다.
우선 배제 힘은 단백질 및 흡착 크로마토그래피 매체 사이에 존재하는 상호작용을 증진시키는데 사용되어 왔다. 염들은 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography: HIC)에서의 결합(binding)을 증진시키는 것으로 널리 알려져 있다. 이는 결합을 획득하는 표준적인 기술이다. 이는 또한 단백질 A 친화성 크로마토그래피(6)와 같은 일부 친화성 방법에서의 결합을 증진시키는데 사용되어 왔다. 암모늄 설페이트는 1970년대에 비관능화된 기공성 입자 크로마토그래피 담체에의 단백질의 결합을 유도하는 것으로 보고되었으나, 샘플 제조 및 칼럼 적용상의 한계 때문에 활용되지는 않았다. 샘플에 과량의 암모늄 설페이트의 직접 첨가는 크로마토그래피 칼럼을 막는 침전물을 생성한다. 염의 비침전 양의 첨가는 참조 문헌 7에서 명확히 나타난 바와 같이 저 용량을 보충할 수 있는 것으로 기대된다.
우선 배제 힘은 또한 흡착 크로마토그래피 방법에서 PEG와 같은 비이온성 고분자와의 결합을 증진시키는데 사용되어왔다. 염과 달리, PEG의 내재적인 소수성이 결합 메커니즘을 직접적으로 방해하므로, 이는 HIC에서는 작용하지 않는다. PEG는 HIC 칼럼 내부에서 단백질을 침전시키는데 사용될 수 있으며, 상기 단백질은 이어서 재용해될 수 있으나, 이는 흡착 크로마토그래피가 아니며 활용성이 떨어진다: 용량 및 분해능이 제한된다[6]. PEG는 친화성 크로마토그래피[6], 이온 교환 크로마토그래피[8] 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피[9]와 결합을 증진시키는데 사용되어 왔으며, SEC[10]에서 획득된 분리를 방해하는 것으로 알려졌다. 상기의 모든 경우들에서, 이는 특히 응집체와 같은 대형 분자들의 용출을 지연시키며, 때때로 분리를 촉진할 수 있다[9]. 그러나, 이는 고점도에 기인하여 널리 활용되지 않는다. 단백질들을 기공으로, 기공 내부로, 기공으로부터 전달하는 확산에 의존하므로 고점도는 모든 기공성 입자들 상에서의 크로마토그래피 방법들에 있어서 특히 문제가 된다. 확산성은 점도에 직접 비례하며, 따라서 칼럼 성능은 PEG 농도에 직접 비례하여 저하된다. 또한, 점도는 크로마토그래피 칼럼의 입자간 공간에서 발생하는 전단력을 증가시킨다. PEG는 작은 분자에 비해 대형 분자들의 결합에 보다 강하게 영향을 미치며, 따라서 히드록시아파타이트의 비응집 항체로부터 항체 응집체를 분리하는 능력을 향상시키는 것으로 밝혀졌기 때문에 이러한 한계들은 일부 예들에서 용인된다[7, 8]. 두 가능성들이 PEG 농도에 직접 비례하여 증가하므로, 이의 광범위한 적용이 지양되었던 것은 놀라운 사실이 아니다.
유동 입자층(fludidized particle bed)은 충진층(packed bed)에서의 크로마토그래피에 대한 대안으로 제공될 수 있다. 유동층에서, 입자들은 타겟 분자를 함유한 샘플에 걸쳐 분산된다. 상기 타겟 분자에 결합 후, 상기 입자들은 농축되어 미결합된 오염물들이 세척되고 결합된 산물은 고농도로 용출될 수 있다. 상기 입자들의 농축은 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 물보다 큰 밀도를 갖는 입자들은 침전될 수 있다. 철-코어(iron-core) 입자들은 자기장에 의해 농축될 수 있다. 또한 입자들은 여과 멤브레인 상에서 농축될 수 있다. 입자 사이즈는 100nm 이하에서 100미크론 이상까지 분포될 수 있다. 팽창층(expanded bed) 크로마토그래피에 대한 입자들의 표면은 일반적으로 의도된 타겟 분자와 강하게 상호작용하는 화학 그룹들로 관능화된다. 예를 들면, 많은 문헌들은 유동 입자들 상의 단백질 A의 고정이 IgG를 포획 및 정제하는 것으로 보고하고 있다. 다른 문헌들은 하전된 그룹들, 소수성 그룹들, 금속 친화성 그룹들 및 복수의 화학을 채용하는 그룹들에 의한 관능화에 대해 기술하고 있다. 이러한 다양한 관능화는 유동층 포맷에 있어서 고정층 크로마토그래피 방법에서의 관능화에 의해 제공되는 동일한 범위의 화학 선택성을 제공하게 한다.
유동층의 중요성은 이들이 충진층의 가장 심각한 한계중 하나인 낮은 생산성을 극복할 수 있는 물리적 특성을 제공한다는 점에 있다. 종래의 기공 입자 칼럼에서는 전체적으로 지나친 시간 간격을 요구하는 느린 유속이 필요하였다. 이러한 시간 간격은 크로마토그래피 매체가 매우 고비용이 소요되어 사용자로 하여금 단일 사이클의 공정을 수행하기 위한 충분한 크로마토그래피 물질의 가격 때문에 감소된 부피의 칼럼 상에서 복수의 사이클을 수행하게 할 때 배가된다. 그러나, 원료 생물학 샘플로부터 초기 산물 포획의 필요성을 충족하기 위한 임의의 방법에 있어서, 생리학적 pH 및 염 농도에 가까운 조건에서 양호한 결합 용량을 획득하는 것이 또한 요구된다. 모든 공지된 크로마토그래피 방법은 이러한 적용을 위해 평가되어왔고, 생친화성 크로마토그래피만이 현재까지 이러한 요구사항을 충족하고 있다. 다른 모든 방법들은 실질적인 조건의 조절이 요구되고/또는 세포 배양 상등액의 성분에 의해 비효율화된다.
[참조문헌]
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(10) T. Arakawa (1985) The mechanism of increased elution volume of proteins by polyethylene glycol, Analyt. Biochem.,144 267-268.
생물학적 산물의 정제를 향상시키기 위한 방법, 조성물 및 키트가 제공된다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 (i) 샘플을 비용해된 물질의 수화된 표면과 접촉시키는 단계 및 (ii) 상기 샘플 및 비용해된 물질을 적어도 현재 우선적으로 수화된 타겟 종들의 일부를 상기 비용해된 물질의 현재 우선적으로 수화된 표면에 유지시킬 수 있는 충분한 양의 우선 배제 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 샘플 내의 생물학적으로 유래된 타겟 종들의 정제 방법을 제공한다. 이러한 연관 형태는 본 출원에서 제한된 공수화(constrained cohydration)로 지칭된다. 상기 우선 배제 제제는 제한 제제로 지칭될 수도 있다. 간결한 설명을 위해, 우선적으로 수화된 분자들 및 표면들은 간단히 "수화된"으로 지칭될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 수화된 타겟 종들의 50% 이상이 상기 제한 제제에 의해 상기 비용해된 물질의 수화된 표면에 유지될 수 있으며, 일부 실시예들에 있어서 실질적으로 상기 타겟 종들 모두가 유지될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 수화된 타겟 종들의 적어도 한 개체가 상기 제한 제제의 존재에 의해 발생하는 제한된 공수화에 의해 상기 수화된 표면에 배타적으로 유지될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 실질적으로 모든 상기 타겟 종들이 상기 제한 제제의 존재에 의해 발생하는 제한된 공수화에 의해 배타적으로 상기 수화된 표면에 유지되는 조건으로 유지될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 제한 제제의 존재에 기인한 제한된 공수화에 의해 상기 수화된 표면에의 상기 수화된 타겟 종들의 배타적 유지는 상기 제한 제제 농도의 제거 또는 감소를 통한 유지 종결에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예들에 있어서, 3분할(tripartite) 시스템 분리, 침전 방법, 유동층 공정 또는 대류성 크로마토그래피 공정의 맥락에서 본 발명의 실행을 위한 방법, 연관 조성물 및 키트들이 제공된다.
본 발명은 바이러스의 정제 및 항체의 정제를 향상시키기 위한 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 실험예 5에서 설명되는 수화된 모노리스 표면에 제한된 공수화에 의해 유지된 IgM의 퍼센트 및 우선 배제 제제, PEG-6000의 서로 다른 퍼센트들(8%, 9%, 10%, 11% 및 12%)에 대한 pH 사이의 관계를 도시하고 있다.
도 2는 실험예 6에서 설명되는 수화된 모노리스 표면에 제한된 공수화에 의해 유지된 IgM의 퍼센트 및 우선 배제 제제, PEG-6000의 서로 다른 퍼센트들(8%, 9%, 10%)에 대한 NaCl 농도 사이의 관계를 도시하고 있다.
도 3은 실험예 7에서 설명되는 수화된 모노리스 표면에 제한된 공수화에 의해 유지된 IgM의 퍼센트 및 우선 배제된 제제, 다양한 분자량(6000, 4000 및 2000)의 PEG의 퍼센트 사이의 관계를 도시하고 있다.
도 4는 실험예 8에서 설명되는 IgG 정제를 위한 PEG-6000의 존재 하에 유기 핵형성 중심에 의한 제한된 공수화의 효율을 도시하고 있다.
도 5는 실험예 9에서 설명되는 수화된 모노리스 표면에 제한된 공수화에 의해 유지되는 타겟 종들의 퍼센트 및 3개의 타겟종들(파지 M13, IgM 및 IgG)에 대한 우선 배제 제제 PEG-6000의 퍼센트들 사이의 관계를 도시하고 있다.
도 6은 오염물 및 타겟 IgM의 용출 시간에서 우선 배제된 제제 PEG-6000의 영향을 포함하는 실시예 32에서의 모노클로날 IgM의 제한된 공수화 대류성 크로마토그래피의 성능을 도시하고 있다.
도 7a 및 도 7b는 실험예 33에서 설명되는 모노클로날 IgM의 제한된 공수화 대류성 크로마토그래피의 성능을 도시하고 있다.
본 발명 수행을 위한 방법들, 조성물들 및 키트들이 제공된다. 특정 실시예들에 있어서, (i) 샘플을 비용해된 물질의 수화된 표면과 접촉시키는 단계 및 (ii) 상기 샘플 및 비용해된 물질을 적어도 현재 우선적으로 수화된 타겟 종들의 일부를 상기 비용해된 물질의 현재 우선적으로 수화된 표면에 유지시킬 수 있는 충분한 양의 우선 배제 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 샘플 내의 생물학적으로 유래된 타겟 종들의 정제 방법을 제공한다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 수화된 타겟 종들의 50% 이상이 제한 제제에 의해 상기 비용해된 물질의 수화된 표면에 유지될 수 있으며, 일부 실시예들에 있어서 실질적으로 상기 타겟 종들 모두가 유지될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 수화된 타겟 종들의 적어도 한 개체가 상기 제한 제제의 존재에 의해 발생하는 제한된 공수화에 의해 상기 수화된 표면에 배타적으로 유지될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 실질적으로 모든 상기 타겟 종들이 상기 제한 제제의 존재에 의해 발생하는 제한된 공수화에 의해 배타적으로 상기 수화된 표면에 유지되는 조건으로 유지될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 제한 제제의 존재에 기인한 제한된 공수화에 의해 상기 수화된 표면에의 상기 수화된 타겟 종들의 배타적 유지는 상기 제한 제제 농도의 제거 또는 감소를 통한 유지 종결에 의해 수행될 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 타겟 종들은 단백질, 항체, 응고 인자(clotting factor), 세포 기관, 바이러스, 바이러스 유사 입자, 유전자 치료 벡터 또는 세포이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 세포 배양 산물, 세포 배양 상등액, 세포 배양으로부터 유래된 단백질 함유 용액, 세포 배양으로부터 유래된 항체 함유 용액, 세포 배양으로부터 유래된 바이러스 함유 용액, 또는 정제 이전 단계로부터의 타겟 종 함유 용액이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 타겟 종은 단백질이다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 타겟 종은 유형 IgA, IgD, IgE, IgG, 혹은 IgM 또는 이들의 절편의 폴리클로날(polyclonal) 혹은 모노클로날(monoclonal) 항체이다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 타겟 종은 원핵 세포, 진핵 세포, 줄기 세포이다. 또 다른 실시예들에 있어서, 상기 타겟 종은 바이러스, 지질 외피 바이러스, 단백질 캡시드 바이러스 또는 바이러스 유사 입자이다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 타겟 종은 엑소좀(exosome), 리포좀(liposome), 미토콘드리아, 엽록체, 리소좀(lysosome) 또는 다른 세포 소기관이다. 추가적인 실시예들에 있어서, 상기 타겟 종은 응고 인자이다. 상술한 타겟 종들에서 알 수 있듯이, 본 발명은 자연 상에 존재하는 다수의 타겟 종들의 정제를 위한 특정한 활용법을 제공한다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 비용해된 물질의 표면은 일 이상의 극성 화학 잔기를 갖는다. 상기 극성 화학 잔기는 특정 실시예들에 있어서, 히드록실, 폴리히드록실, 아민, 이민, 우레이드(ureide), 카르보하이드레이트, 아미노산, 펩티드, 양이온성 전하 그룹 또는 음이온성 전하 그룹일 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 극성 화학 잔기는 글루코스(glucose), 만노스(mannose), 갈락토스(galactose), 락토스(lactose), 모노사카라이드(monosaccharaide), 디사카라이드(disaccharide) 및 폴리사카라이드(polysaccharide)로 구성된 그룹에서 선택되는 카르보하이드레이트이다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 극성 화학 잔기는 우레아(urea), 요산(uric acid), 알란토인(allantoin), 히단토인(hydantoin)으로 구성된 그룹에서 선택되는 우레이드이다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 극성 화학 잔기는 히스티딘(histidine), 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 발린(valine), 루신(leucine), 이소루신(isoleucine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 프롤린(proline), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 티로신(tyrosine), 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine), 리신(lysine), 아르기닌(arginine), 또는 셀레노시스테인(selenocysteine)이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 표면은 상기의 그룹들의 조합을 포함한다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 제한 제제는 염, 폴리사카라이드, 비이온성 유기 고분자, 무기 고분자, 코스모트로픽 염, 복수의 양성 및 음성 전하를 갖는 양쪽성 고분자, 또는 아미노산 중 일 이상이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 제한 제제는 암모늄 설페이트(ammonium sulfate), 소듐 시트레이트(sodium citrate), 포타슘 시트레이트(potassium citrate), 포타슘 포스페이트(potassium phosphate), 및 소듐 클로라이드(sodium chloride)이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 제한 제제는 수용성 비전하 선형 또는 분지형 비이온성 유기 고분자이다. 상기 제한 제제는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 덱스트란(dextran), 전분(starch), 셀룰로스(cellulose)일 수 있다. 특정한 경우, 상기 제한 제제는 폴리에틸렌 글리콜이며, PEG는 100 및 10,000D 사이의 평균 고분자량을 가질 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, PEG의 상기 평균 고분자량은 600 및 8,000D 사이일 수 있으며, 또는 약 200, 300, 400, 600, 1,000, 1500, 1540, 4000, 6,000, 또는 20,000 중 임의의 값을 가질 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 5% 및 약 25%(w/v)의 농도로 제공된다. 특정 실시예들에 있어서, PEG 농도는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 혹은 15%, 또는 이들 값들 중 2개 사이의 범위일 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 비용해된 물질은 유기 핵형성 중심들의 집합일 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 유기 핵형성 중심들은 과포화 농도에서 자연적으로 발생하는 비독성 유기 화합물들, 수화된 표면을 갖는 나노 및/또는 마이크로 입자들 형태의 불용성 잔여물로 구성된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 유기 핵형성 중심들은 카르보하이드레이트, 우레이드 혹은 펩티드, 또는 보다 복잡한 조성물을 포함할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 제한 제제의 존재 하에 수화된 표면을 갖는 유기 핵형성 중심은 상기 타겟 종들의 일 이상의 층을 유지할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 유기 핵형성 중심의 표면은 상기 타겟 종의 단층에 결합하는 반응성 원소들을 함유할 수 있으며, 이는 제한 제제의 존재 하에 수화된 표면이 되고, 그 상부에 상기 타겟 종들의 복수의 추가적인 층들이 제한된 공수화에 의해 유지된다. 자연적으로 발생하는 유기 핵형성 중심들을 활용하는 본 발명의 특정한 이점은 이들은 상대적으로 합성 입자들에 비해 저렴하며, 일반적으로 생분해가능하여 처리 비용 및 환경에의 영향을 저감할 수 있다는 것이다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상기 제한 제제에 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 상기 유기 핵형성 중심과 접촉된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기의 방법은 표면에 유지된 상기 타겟 종들을 갖는 상기 유기 핵형성 중심으로부터 오염물을 함유하는 상등액을 분리하는 추가적인 단계를 포함한다.
특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 유기 핵형성 중심들을 상기 타겟 종들의 상기 유기 핵형성 중심으로부터의 분리 및 상기 유기 핵형성 중심들로부터 재용해된 상기 타겟 종들의 회수를 촉진하는 조건에 노출시킴으로써 상기 타겟 종들을 상기 유기 핵형성 중심으로부터 분리하는 추가적인 단계를 제공한다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 타겟 종들은 실질적으로 상기 제한 제제의 농도를 감소시킴으로써 상기 유기 핵형성 중심으로부터 분리된다. 특정 실시예들에 있어서, 염 농도는 상기 제한 제제가 상기 유기 핵형성 중심의 수화된 표면에 상기 타겟 종들을 유지하는 효율을 충분히 감소시키도록 증가된다. 특정 실시예들에 있어서, 당 농도는 상기 제한 제제가 상기 유기 핵형성 중심의 수화된 표면에 상기 타겟 종들을 유지하는 효율을 충분히 감소시키도록 증가된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 공정은 상기 유기 핵형성 중심들로부터 상기 타겟 종들을 분리하기 이전에 상기 유기 핵형성 중심들을 세척하는 일 이상의 추가적인 단계를 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 세척 용액은 상기 유기 핵형성 중심들의 상기 수화된 표면에 상기 타겟 종들의 유지를 지속시키는 적절한 농도의 일 이상의 제한 제제를 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 유기 핵형성 중심들로부터 상기 타겟 종들을 분리하는 단계에 사용되는 용액들은 상기 타겟 종들의 회수를 위해 사용되는 용액들과 실질적으로 동일하다.
특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 유기 핵형성 중심들 및 본 발명의 방법의 용이한 실행을 위해 제공되는 제한 제제들을 포함하는 키트(kit)를 제공한다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 비용해된 물질은 합성 입자들을 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 이러한 입자들은 나노입자 또는 마이크로입자들이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 자성, 상자성 또는 고밀도 입자들이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 고분자 코팅을 포함한 금속-코어 입자, 셀룰로스 코팅을 포함한 금속 코어 입자, 유리 입자, 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리메타크릴레이트(polymethacrylate), 스티렌디비닐벤젠(styrenedivinylbenzene), 티오필릭(thiophilic) 자성 입자, 셀룰로스 코팅 텅스텐 카바이드 입자, 실리카 입자, 아가로스(agarose) 입자, 셀룰로스 입자 또는 복합체(composite) 입자들 중 어느 하나이다. 특정 실시예들에 있어서, 입자 사이즈는 약 100nm 및 약 500㎛ 사이; 또는 약 10nm 및 500nm 사이; 또는 약 100nm 및 약 50㎛ 사이; 또는 약 100nm 및 약 4㎛ 사이; 또는 약 100nm 및 약 3㎛ 사이; 또는 약 100nm 및 약 1㎛ 사이; 또는 약 200nm 및 약 2㎛ 사이; 또는 약 200nm 및 약 500nm 사이; 또는 약 500nm 약 1㎛ 사이; 또는 약 5㎛ 및 약 50㎛ 사이이다.
특정 실시예들에 있어서, 타겟 샘플을 상기 입자들에 접촉시키는 단계는 상기 제한 제제로 상기 타겟 종들을 유지시키는 단계 이전에 수행된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 방법은 (i) 상기 입자들을 액상으로부터 상기 입자들의 수화된 표면과 연관된 상기 타겟 종들과 함께 분리시키는 단계 및 (ii) 상기 타겟 종들을 상기 입자들로부터 분리시키는 단계의 추가적인 단계들을 포함한다. 특정 실시예들에 있어서. 상기 타겟 종들을 분리시키는 단계는 용액으로 상기 입자들을 세척하는 단계를 포함하며, 상기 용액은 (i) 상기 제한 제제를 포함하지 않거나, (ii) 상기 입자들의 상기 수화된 표면에 상기 타겟 종들을 유지하기에 불충분한 양으로 상기 제한 제제를 함유하거나, (iii) 상기 입자들의 상기 수화된 표면으로부터 상기 타겟 종들의 분리에 효과가 있는 제제를 함유하거나 (iv) (i) 및 (iii)의 조합, 또는 (iv) (ii) 및 (iii)의 조합 중 어느 하나이다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 입자들의 표면이 다수의 혹은 강한 반응성 화학 잔기들을 포함하는 경우, 칼럼에 전달되는 버퍼의 pH, 염 농도 및 다른 성분들이 공정의 적어도 일 단계 동안 상기 타겟 종들 및 상기 화학적 반응성 잔기들 사이의 직접적인 상호작용을 중단시키도록 선택되어, 제한 제제의 작용을 통해 제한된 공수화 중재에 의해 배타적으로 상기 단계 동안 유지된 상기 타겟 종들을 이탈시킨다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 타겟 종들과 입자 표면 상의 화학적 반응성 잔기들의 상호 작용을 중단시키는 제제는 킬레이트제, 계면활성제, 염, 카오트로프(chaotrope), pH 변화, 또는 이들 제제 및 조건들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 입자들로부터 상기 타겟 종들을 분리시키는 단계는 또한 킬레이트제, 계면활성제, 염, 카오트로프, pH 변화 또는 상기 입자들로부터 상기 타겟 종들의 회수를 향상시키는 제제 및 조건들의 조합을 포함한다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 입자들의 표면이 소수의 또는 약한 반응성 화학 잔기들을 포함하는 경우, 칼럼에 전달되는 버퍼의 pH, 염 농도 및 다른 성분들은 특히 분리 단계에서 상기 타겟 종들의 회수를 증진시키기 위해 상기 타겟 종들 및 상기 화학적 반응성 잔기들 사이의 직접적 상호작용을 감소시키거나 중단시키도록 선택된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 입자 표면 상에서 상기 타겟 종들과 화학적 반응성 잔기들의 상호작용을 감소시키거나 중단시키는 제제는 킬레이트제, 계면활성제, 염, 카오트로프, pH 변화 또는 제제들 및 조건들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 제한 제제는 상기 샘플 및 상기 입자들에 약 1분 내지 약 5시간; 2분 및 15분 사이; 2분 및 30분 사이; 10분 및 30분 사이; 2분 및 2시간 사이; 또는 2분 및 1시간 사이의 시간에 걸쳐 첨가된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 혼합물의 액체 성분으로부터 원심분리, 침전, 디캔테이션(decantation), 상기 혼합물을 자기장에 노출 또는 여과에 의해 분리된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 분리된 입자들은 상기 제한 제제를 포함하는 용액으로 세척된다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 분리 단계는 상기 입자들에 분리 버퍼를 첨가하는 단일 단계로 수행된다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 타겟 종들을 분리하는 단계는 상기 제한 제제의 농도 감소를 통해 점증적으로 수행된다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 방법은 다른 물질들로부터 상기 타겟 종들을 분류하는 방법이 수행되기 이전 혹은 이후에 수행되며, 상기 분류 방법은 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피, 침전법, 폴리에틸렌 글리콜 침전, 옥탄산(octanoic acid) 침전, 원심분리 및 초원심분리로 구성된 그룹에서 선택된다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 비용해된 물질은 고정층 대류성(fixed-bed convective) 크로마토그래피 물질이다. 특정 실시예들에 있어서. 상기 대류성 크로마토그래피 물질은 모노리스, 멤브레인, 및 비기공성 입자들로 충전된 칼럼으로 구성된 그룹에서 선택된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 대류성 크로마토그래피 물질은 비기공성 실리카 입자들이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 대류성 크로마토그래피 물질은 모노리스이다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 모노리스는 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 스티렌디비닐벤젠 또는 실리카로 이루어진다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 모노리스는 약 1 미크론 및 200 미크론 사이의 평균 채널 사이즈를 갖는다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 채널 사이즈는 약 1 미크론 및 2 미크론; 약 10 미크론 및 20 미크론; 또는 약 20 미크론 및 200 미크론 사이의 값을 갖는다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 모노리스는 고분자로 코팅된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 모노리스는 화학적으로 변성되어 표면 수화도를 증가시킬 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 대류성 크로마토그래피 물질 표면은 히드록실화된다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 대류성 크로마토그래피 물질 표면이 하전된 잔기들을 포함하는 경우, 칼럼에 전달되는 버퍼의 pH 및 염 농도는 상기 타겟 종들이 상기 제한된 공수화에 의해 배타적으로 유지되는 상기 공정의 적어도 일 단계 동안 상기 하전된 잔기들에의 상기 타겟 종들의 정전기적 결합을 중단시키도록 선택된다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플을 상기 대류성 크로마토그래피 물질의 수화된 표면과 접촉시키는 단계는 제한 제제의 존재하에 수행된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 대류성 크로마토그래피 물질은 먼저 상기 타겟 종들을 유지하기에 충분한 농도의 제한 제제를 함유하는 용액과 평형을 이룬다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상기 대류성 크로마토그래피 물질과 접촉되기 전에 상기 샘플 성분들의 침전을 최소화 혹은 방지하기 위해, 혼합물이 상기 대류성 크로마토그래피 물질과 접촉하기 직전에 상기 제한 제제의 농축된 용액과 혼합되는 방식으로 적용된다. 특정 실시예들에 있어서, 이는 샘플을 하나의 펌프를 통해 로딩하는 단계, 또 다른 펌프를 통해 상기 농축된 제한 제제를 로딩하는 단계, 이들이 상기 대류성 크로마토그래피 물질과 접촉하기 직전에 믹서에서 만나도록 시스템을 플럼빙(plumbing)하는 단계, 및 상기의 두 펌프들의 유속을 조절하여 상기 대류성 크로마토그래피 물질의 수화된 표면 상에 상기 타겟 종들의 유지를 획득하기 위해 요구되는 농도의 제한 제제를 전달하는 단계에 의해 수행된다. 샘플 적용의 이러한 방법은 이하에서 인-라인 희석(in-line dilution)으로 지칭된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 방법은 우선적으로 배제된 제제의 적절한 농도를 함유하는 용액으로 상기 수화된 대류성 크로마토그래피 물질을 세척하여 상기 타겟 종들의 유지를 지속시키고 비유지된 오염물들을 씻어내는 추가적인 단계들을 제공한다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 대류성 크로마토그래피 물질은 상기 대류성 크로마토그래피 물질로부터 상기 타겟 종들을 분리하는 용액과 접촉될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 타겟 종들을 분리하는 단계는 상기 대류성 크로마토그래피 물질을 용액으로 세척하는 단계를 포함하며, 상기 용액은 (i) 제한 제제를 함유하지 않거나, (ii) 상기 대류성 크로마토그래피 물질의 우선 수화된 표면에서 상기 타겟 종들을 유지하기에 불충분한 양의 제한 제제를 함유하거나, (iii) 상기 대류성 크로마토그래피 물질의 우선 수화된 표면으로부터 상기 타겟 종들의 분리에 효과가 있는 제제를 함유하거나, (iv) (i) 및 (iii)의 조합 혹은, (iv) (ii) 및 (iii)의 조합 중 어느 하나이다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 대류성 크로마토그래피 물질의 수화된 표면으로부터 상기 타겟 종들의 분리에 효과를 갖는 상기 제제는 계면활성제, 카오트로프, 염, 당 또는 아미노산으로 구성된 그룹에서 선택된다.
특정 실시예들에 있어서, 본 발명의 방법은 다른 물질들로부터 상기 타겟 종들을 분류하는 방법이 수행되기 이전 혹은 이후에 수행되며, 상기 분류 방법은 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 단백질 A 크로마토그래피, 단백질 G 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피, 침전법, 폴리에틸렌 글리콜 침전, 옥탄산 침전, 원심분리 및 초원심분리로 구성된 그룹에서 선택된다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 비용해된 물질은 제1 조건 세트에서 상기 타겟 종들과 결합하며, 제2 조건 세트에서 상기 타겟 종들과 결합하지 않는 화학적 반응성 잔기들을 보유하며, 상기 방법은 우선 배제 제제의 추가적인 존재, 상술한 제2 조건 세트들과 동일한 조건 하에서 상기 비용해된 물질의 수화된 표면에 상기 타겟 종들을 유지하는 단계를 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 제1 조건 세트 하에서 상기 비용해된 물질의 수화된 표면에 상기 타겟 종들을 유지하는 단계에서, 그 방법은 상기 타겟 종들이 상기 비용해된 물질에 결합되어 있는 상태에서 상기 제1 조건 세트 하에서 상기 샘플을 세척하는 추가적인 단계를 포함한다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 조건 세트들은 pH, 전도도 및 염 농도 중 적어도 하나에 대해서 차이가 있다.
특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 크로마토그래피 칼럼에 충전된 기공성 입자들과 같은 비대류성 크로마토그래피 물질들을 사용하여 수행된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 기공성 입자 적용의 활용성은 본 발명에서 기공성 입자가 결여된 것보다 향상될 수 있으나, 일반적으로 성능은 대류성 크로마토그래피 매체로 수행되는 본 발명 또는 본 발명의 다른 형태보다 열등할 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 타겟 종들이 제한된 공수화에 의해 유지되지 않고 오염물들이 유지되어 상기 타겟 종들로부터 분리되는 소위 음성(negative) 크로마토그래피법에 적용될 수 있다. 유기 핵형성 중심들 및 합성 입자들을 갖는 특정 실시예들에 있어서, 제거되어야 할 오염물들이 상기 입자들에 의해 유지되는 반면 상기 타겟 종들은 상등액 내에 유지되는 것으로 이해된다. 고대류성 물질 또는 기공성 입자 칼럼을 포함하는 고정층 크로마토그래피 매체를 갖는 특정 실시예들에 있어서, 제거되어야 할 오염물들은 유지되는 반면 상기 타겟 종들은 크로마토그래피 층을 통과해 흐를 수 있는 것으로 이해된다. 용어"음성 크로마토그래피"에 추가로, 이러한 적용법은 때때로 "관류(flow-through) 법"으로 지칭된다.
놀랍게도, 제한 제제의 첨가 전에 생물학적 제제 내로 과량의 고체 유기 핵형성 중심들을 분산시킴으로써 생성되는 3-상(phase) 시스템은 종래의 2-상 침전 시스템보다 짧은 배양 시간, 양호한 순도, 회수 및 재생성을 보이는 것으로 발견되었다. 염 또는 비이온성 유기 고분자인 상기 제한 제제의 점진적인 첨가가 본 방법의 요구조건이다. 이를 통해 상기 제한 제제가 상기 타겟 종이 서로 연관되는 대신 상기 유기 핵형성 중심들과 안정한 결합을 형성하도록 유도함을 알 수 있다. 상기 유기 핵형성 중심의 수화된 화학 표면이 단백질 및 다른 침전 타겟 종들의 매우 불균일한 표면들보다 균일한 성질을 가지므로, 분배계수가 보다 잘 정의되며, 이는 예를 들면 매우 높은 순도의 보다 정제된 분류를 가능케한다. 상기 핵형성 중심들은 과량으로 제공되므로, 질량 작용(mass action)은 보다 효율적이어야 하며, 보다 짧은 배양 시간으로 높은 회수(recovery)를 지원해야한다. 균일성 및 과량의 조합은 샘플 조성의 편차에도 불구하고, 양호한 재생성과 양립할 수 있다. 따라서 특정 실시예들에 있어서 상기 방법은 종래의 2상 침전 시스템의 가장 바람직하지 않은 한계들을 극복한다. 상기 유기 핵형성 중심들로 상기 타겟 종들을 공침전시킨 후, 상등액은 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다. 이어서, 상기 타겟 종들은 상기 제한 제제가 결여된 용액에 노출시킴으로써 상기 유기 핵형성 중심으로부터 회수될 수 있다. 여전히 불용성인 유기 핵형성 중심은 이어서 원심분리 또는 여과에 의해 제거될 수 있다.
놀랍게도, 특정 실시예들에 있어서, 제한 제제를 생물학적 액체 내에 분산된 수화된 합성 입자들과 접촉시키는 경우 대형 단백질 및 상기 입자들 표면 상의 다른 대형 생물학적 산물들의 선택적 결합이 촉진되며, 상기 생물학적 산물은 이어서 상기 제한 제제의 농도를 감소시킴으로써 현저하게 높은 순도로 회수될 수 있음을 발견하였다. 특정 실시예들에 있어서, 친화성 리간드, 양전하, 음전하, 소수성 리간드 또는 이들의 조합과 같은 상기 입자들 표면 상에 상기 산물과 강하게 상호작용하는 화학적 관능성이 요구되지 않는다. 결합 및 용출이 넓은 범위의 pH 및 전도성 조건에서 발생할 수 있으며, 이에 따라 본 방법은 원료 세포 배양 상등액으로부터 산물을 획득하는데 특히 적합하다. 특정 실시예들에 있어서, 본 공정은 관심 대상인 타겟 종을 함유하는 생물학적 샘플 내에 입자들을 분산시키는 단계, 상기 입자들 및 상기 타겟 종 사이의 안정한 결합을 생성시키기에 충분한 농도로 제한 제제를 점진적으로 첨가하는 단계, 이어서 오염물을 함유한 액체로부터 상기 입자들을 분리하는 단계를 수반한다. 일 이상의 세척 단계가 상기 입자에 결합된 상기 타겟 종을 유지하기에 적합한 농도의 상기 제한 제제를 함유하는 클린(clean) 버퍼 내에 상기 입자들을 재서스펜딩 시킴으로써 적용될 수 있다. 이는 입자들 내에 혹은 입자들 사이에 포착된 오염물 함유 액체를 희석시키는 효과를 갖는다. 상기 산물은 최종적으로 이들을 감소된 농도의 상기 제한 제제를 포함하는 용액에 노출시킴으로써 상기 입자들로부터 분리된다. 실험 결과들은 특정 실시예들에 따른 본 방법이 IgG 항체들의 단백질 A 친화도 정제와 같은 생친화성 방법들과 매우 유사한 산물 순도를 유지하며, 또한 침전 방법들에 일반적인 순도 및 회수의 변동을 극복함을 보여주고 있다. 또한 실험 데이터들은 상기의 향상된 성능은 시스템 내에서 우선 공수화 파트너로서 작용하는 과량의 균일한 수화된 표면으로부터 도출됨을 제안하고 있다. 아마도, 본 접근법의 가장 놀랍고 현저한 특징은 동일한 구조의 단백질 A 친화성 나노입자들보다 30배 이상의 용량으로 90% 이상의 순도 및 90% 이상의 회수를 보장하는 전분-변성 자성 나노입자들로 예시된다. 이러한 결과들은 상기 입자들은 상기 타겟 종의 단층만을 적층가능한 반응성 표면 화학적 잔기들에만 의존하는 입자들과 비교하여 선택된 타겟 종의 복수의 층들을 적층할 수 있음을 제시하고 있다.
놀랍게도, 특히 비이온성 유기 고분자를 포함하는 제한 제제들은 특정 실시예에 있어서 생물학적 산물 및 표면 사이의 상당한 화학적 인력 없이 대류성 크로마토그래피 매체의 수화된 표면 상에 생물학적 산물의 유지를 획득하는데 사용될 수 있음이 발견되었다. 특정 실시예들에 있어서, 고용량 샘플 로딩은 크로마토그래피 상의 하나의 펌프 라인을 통해 샘플을 로딩하는 단계, 동시에 제2 펌프 라인을 통해 고농도의 우선 배제된 제제를 로딩하는 단계, 대류성 크로마토그래피 담체 직전에 두 스트림(stream)을 혼합하는 단계들에 의해 수행된다. 이는 혼합물의 프리-칼럼(pre-column) 체류 시간을 매우 짧은 간격으로 제한시켜 상기 공정을 방해할만한 충분한 정도로 침전이 일어나지 않도록 한다. 따라서, 상기 고점도의 우선 배제 용질에도 불구하고 고용량 및 고 분해능을 획득할 수 있으며, 기공성 입자 칼럼에서 획득할 수 있는 것보다 10배 이상 높은 유속으로 유지된다. 프리-칼럼 체류 시간은 유속과 역비례하므로, 이는 크로마토그래피 담체 이전의 샘플 침전을 최소화하는 효과를 가능케 한다. 이는 상기 우선 배제된 제제의 보다 높은 농도의 사용을 가능하게 하며, 이는 높은 결합 용량에 유리하다. 타겟 산물이 크로마토그래피 담체에 결합된 이후, 베드(bed)는 클린 버퍼로 세척되어 미결합 오염물들을 제거할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 세척 버퍼는 관심 대상 산물의 표면 결합을 유지할 수 있는 충분한 농도의 제한 제제를 함유하는 것으로 이해된다. 이어서. 타겟 산물의 분리 및 회수가 이어진다. 이는 유지 획득에 사용되었던 상기 제한 제제의 농도를 감소시킴으로써 수행될 수 있다. 모노리스 및 멤브레인 상에서 수행되는 본 방법의 또 다른 가치있는 특징은 정제되는 산물의 사이즈에 상관없이 고용량 및 고분해능 분류가 유지되므로, 본 발명은 단백질에서와 같이 바이러스 입자에서도 효과적이라는 점이다. 기공성 입자 매체는 대형 생물학적 산물에 있어서 매우 열등한 성능을 보인다. 또 다른 가치 있는 특징은 본 발명은 모노리스 내부에서의 입자간 전단(shear)이 없다는 점과 함께 제한 제제의 구조 안정화 능력에 기인하여, 다른 방법들에 비해 화학적으로 보다 안정적이라는 점이다. 또 다른 가치있는 특징은 비이온성 유기 고분자를 활용한 본 발명의 실행은 세포 배양 상등액내에 다수 존재하는 작은 소수성 오염물에 의한 크로마토그래피 표면의 파울링(fouling)을 야기할 수 있는 비특이적 소수성 상호작용을 제한한다는 점이다. 상술한 현저한 결과는 메커니즘, 방법 및 물질들의 독특한 조합은 우수한 작용성을 갖는 시스템을 생성하여 공지된 흡착 크로마토그래피 방법들에 대해 경쟁력있는 대안을 제공하며, 다른 모든 방법들이 실패한 우수한 결과들을 제공할 수 있음을 보여준다. 추가적으로 본 발명의 특정 실시예들의 분류 메커니즘은 공지된 방법들에 상보적이며, 공정 개발자 및 제조자들에게 제공될 수 있는 가치있는 새로운 툴(tool) 세트를 형성할 수 있다.
[용어의 정의]
본 발명의 보다 용이한 이해를 위해 용어가 의미가 정의되고 설명된다. 추가적인 정의들은 상세한 설명에 전체적으로 제공된다.
"아미노산(Amino acid)"은 아민 그룹, 카르복시산 및 측쇄를 포함하는 배열형태로 탄소, 수소, 산소 및 질소를 함유하는 자연 또는 합성의 유기 분자 클래스를 지칭한다. 유기 핵형성 중심의 적절한 예들은 낮은 용해도의 종들을 선호한다. 이러한 제제들의 유효 농도는 아미노산의 종류 및 본 발명에 의해 처리되는 생물학적 산물의 특징에 따라 변화한다. 나아가, 유기 핵형성 중심들로서 또한 작은 펩티드들이 채용될 수 있다. 아미노산의 예들은 이에 제한되는 것은 아니나, 약 2.5M의 농도까지 용해가능한 글리신을 포함한다.
"응집체(Aggregate(s))"는 생리학적 조건에서 안정적이며 넓은 범위의 pH 및 전도도 조건에 걸쳐 안정성을 유지하는 2 이상의 분자의 회합을 지칭한다. 응집체는 빈번하게 단백질, 핵산 또는 지질 및 다른 분자 혹은 금속 이온과 같은 일 이상의 생분자를 포함한다. 상기 회합은 임의의 타입의 화학적 상호작용들 또는 이들의 임의의 조합을 통해 일어난다. 예를 들면, 항체의 응집체는 두 카테고리로 분류될 수 있다: "호모응집체(Homoaggregates)"는 2 이상의 항체 분자의 안정한 회합을 지칭한다. "헤테로응집체(Hetero-aggregates)"는 일 이상의 항체 분자와 일 이상의 비항체 분자들의 안정한 회합을 지칭한다. 상기 비항체 성분은 뉴클레오티드, 엔도톡신(endotoxin), 금속 이온, 단백질, 지질 또는 세포 배양 매체 성분으로 구성된 그룹으로부터의 일 이상의 개체로 구성될 수 있다.
"항체(Antibody)"는 면역글로불린(immunoglobulin), 이의 복합체(composite) 또는 절편을 지칭한다. 상기 용어는 이에 제한되는 것은 아니나, 인간 또는 다른 포유동물의 세포 주로부터 유래한 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 클래스의 폴리콜로날 또는 모노클로날 항체들을 포함하며, 인간화, 인간, 단일-사슬, 키메릭(chimeric), 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이(mutated), 그라프팅(grafted) 및 인 비트로 합성 항체들의 자연적 혹은 유전적 변이된 형태를 포함한다. "항체"는 또한 이에 제한되는 것은 아니나 면역 글로불린 잔기를 함유하는 융합 단백질을 포함하는 복합체 형태를 포함한다. "항체"는 또한 항원-결합 기능을 보유 혹은 미보유하는, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, Fc 및 다른 조성과 같은 항체 절편을 포함할 수 있다. "항체"는 또한 항체의 Fc 부분이 재조합적으로 비항체 단백질에 융합되는 소위 융합 단백질을 포함하는 재조합 구조의 화합물을 포함할 수 있다. "항체"는 또한 효소 및 다른 단백질이 항체에 화학적으로 결합된 소위 효소 콘쥬게이트들을 포함하는 합성 구조물을 포함할 수 있다.
"카르보하이드레이트(Carbohydrate)"는 Cm(H2O)n의 일반식을 갖는 탄소, 수소 및 산소를 함유하는 자연 또는 합성 유기 분자의 클래스를 지칭한다. 본 발명의 특정 실시예들을 수행하는데 적합한 유기 핵형성 중심들을 구성하는 종들은 이에 제한되는 것은 아니나, 셀룰로스, 전분 및 용해성이 떨어지는 당을 포함한다.
"크로마토그래피 담체(Chromatography support)"는 크로마토그래피를 수행하는데 사용될 수 있는 고정 크로마토그래피 베드를 지칭한다. 상기 크로마토그래피 담체는 모노리스, 멤브레인 또는 기공성 혹은 비기공성 입자들의 충전 칼럼을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 실시예들에 있어서 사용되는"제한 제제(Constraining agent)"(일부 경우에 있어서, "우선 배제 제제(preferentially excluded agent)," "침전제(precipitating agent)," "우선 배제 용질(preferentially excluded solute)," 또는 "제한된 공수화 제제(constrained cohydration agent)") 는 본 출원에 있어서 제한된 공수화로 지칭되는 메커니즘에 의해 수화된 표면 상에 생물학적 타겟 종의 유지(retention)를 야기하는 제제를 지칭한다. 이러한 제제의 일부들은 우선 배제 용질 및 침전제로서 보다 광범위하게 기술된다. 우선 배제 물질은 이에 제한되는 것은 아니나, 소위 코스모트로픽 염, 비이온성 혹은 양쪽이온성 유기 고분자, 일부 폴리사카라이드 및 아미노산을 포함할 수 있다. 예시적인 하나의 그룹으로서, 이에 제한되는 것은 아니나 암모늄 설페이트, 소듐 시트레이트 및 포타슘 포스페이트와 같은 소위 침전제를 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 그룹은 비이온성 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 유기 고분자를 포함한다. PEG는 HO-(CH2-CH2-O)n-H의 구조식을 갖는다. 비제한적인 예들은 평균 고분자량 100 내지 10,000 dalton, 보다 통상적으로 3,000 내지 8,000 dalton을 갖는 조성을 포함한다. 또 다른 그룹은 글리신과 같은 아미노산을 포함한다. 어느 특정한 이론에 제한되는 것은 아니나, 우선 배제는 단백질을 4nm 이내의 거리에서 바로 감싸는 용매가 특정 제한 제제가 결여된 조건을 지칭하는 것으로 간주된다. 이 영역은 결과적으로 우선적으로 수화되는 것으로 여겨진다. 우선적으로 수화된 표면들이 상호작용할 때, 이들은 물을 공유하며 일부 물을 다시 용매 벌크로 돌려보낸다. 상기 제한 제제가 존재하는 동안은 이들은 다시 물을 획득할 수 없으므로, 이들 각각의 우선 수화 물 공유를 지속하도록 제한된다. 이러한 조건을 제한 공수화로 지칭한다.
"엔도톡신(Endotoxin)"은 세포 용균시 방출되는 그람-음성 박테리아의 외측 멤브레인 내에 존재하는 독성 열-안정적인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide) 물질을 지칭한다.
"엑소좀(Exosomes)"은 줄기 세포와 연관된 세포 소기관의 종류를 지칭한다.
"Factor VIII"은 응고 단백질(clotting protein)이다.
"피브리노겐(Fibrinogen)"은 응고 단백질이다.
"수화된 표면(Hydrated surface)" 또는 "고도 수화된 표면" 또는 "친수성 표면"은 잠재적으로 수소 결합, 전왜(electrostriction) 또는 이들 두 메커니즘의 조합을 통해 물과 강하게 상호작용하는 표면을 지칭한다. 이러한 상호작용은 히드록실, 음전하 혹은 양전하, 또는 비전하 극성 그룹과 같은 화학 그룹들에 의해 중재될 수 있다. 수화가능한 화학 그룹들의 존재는 입자 또는 대류성 크로마토그래피 물질과 같은 주어진 물질의 내재적 조성의 기본적 특징이거나, 비제한적인 예로서 카르보하이드레이트 및 우레이드를 포함하는 표면 상에 상기 그룹들을 고정화하는 화학적 변이에 의해 추가되거나 향상될 수 있다. 소위 소수성 표면은 일반적으로 고도로 수화되지 않는 것으로 간주되나. 소수성 잔기와 조합된 강한 수화가능 그룹을 포함하는 표면은 본 발명 실행을 위해 충분히 수화될 수 있다.
"코스모트로픽 염(Kosmotropic salts)"은 비제한적인 예로서 암모늄 설페이트, 소듐 설페이트, 포타슘 포스페이트, 소듐 시트레이트, 포타슘 시트레이트 및 소듐 클로라이드를 포함하는 다양한 염들 중 임의의 염을 포함할 수 있다. 상기 염들의 유효 농도는 염의 종류 및 본 발명에 의해 처리되는 생물학전 산물의 특성에 따라 변화된다.
"비이온성 유기 고분자(Non-ionic organic polymer)"는 하전된 그룹이 결여된 연결된 반복 유기 서브유닛으로 구성되는 자연발생적 혹은 합성 탄화수소를 지칭한다. 이는 선형, 일부 분지를 포함하나 선형이 우세한 구조, 또는 분지가 우세한 구조를 가질 수 있다. 본 발명 수행에 적합한 비제한적인 예들로서 덱스트란(dextran), 전분(starch), 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 들 수 있다. PEG는 HO-(CH2-CH2-O)n-H의 구조식을 갖는다. 비제한적인 예들은 100 내지 10000 dalton의 평균 고분자량을 갖는 조성을 포함한다. 상업적인 PEG 제조물의 평균 분자량은 일반적으로 하이픈 첨자로 표시된다. 예를 들면, PEG-6000은 평균 분자량 6,000 dalton의 제조물을 지칭한다, 이러한 제제의 유효 농도는 고분자의 종류 및 본 발명에 의해 처리되는 생물학적 산물의 특성에 따라 변화된다.
"유기 핵형성 중심(Organic nucleation center)"은 적어도 부분적으로 나노 및/또는 마이크로 입자들 형태의 비용해된 고체로서 존재하는 유기 분자의 단순하거나 복잡한 비합성 종들을 지칭한다. 서브 용어인 "핵형성 중심"은 결정학 분야에서 유래되며, 주변으로 표면 상에 물질이 부착되는 "시드(seed)"를 기술하고 있다. 대부분의 유기 분자들은 어느 정도의 수용성을 보유하고 있으므로, 비용해된 고체의 요구는 용액을 포화시키는데 필요한 양보다 많은 양을 사용함으로써 충족될 수 있다. 과포화에 유효한 양의 유기 핵형성 중심의 비제한적인 예로서, 특히 카르보하이드레이트, 우레이드, 아미노산 및 잠재적인 이들의 조합들을 들 수 있다. 전분 및 셀룰로스는 카르보하이드레이트 유기 핵형성 중심의 예이다. 요산 및 알란토인은 우레이드 유기 핵형성 중심의 예이다.
"유기 용매"는 액상에서 존재하는 자연발생 또는 합성 유기 화합물을 지칭한다. 본 발명 실행에 적합한 예로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 디메틸 설폭사이드, 에탄올 및 페녹시에탄올을 들 수 있다.
"우선 배제(Preferential exclusion)"는 벌크 용액에서 동일한 물질의 농도와 비교할 때, 친수성(수화된) 표면을 둘러싼 근접 영역에 특정 비용해 물질이 결핍되는 상호작용을 나타낸다. 우선 배제 용질은 특히, 소위 침전 염, 비이온성 고분자 및 아미노산을 포함한다.
"합성 입자(Synthetic particles)"는 100nm에서 100미크론 범위의 사이즈를 가질 수 있다. 이들은 기공성 혹은 비기공성일 수 있다. 이들은 예를 들면, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 아가로스, 셀룰로스, 덱스트란 혹은 다른 고분자들로 구성되거나 실리카와 같은 무기물질일 수 있다. 이들은 전체적으로 균일한 구조를 갖거나, 금속 합금 또는 소수성 고분자와 같은 물질의 내부 코어를 포함하고 고도로 수화되거나 화학 그룹들의 부착을 허용하여 고도로 수화된 표면을 생성하도록 적용된 표면으로 코팅된 화합물일 수 있다. "합성 입자"는 크로마토그래피 법을 위해 설계된 입자들 또는 크로마토그래피 분야와 전체적으로 구별되는 적용예들을 위해 설계된 입자들을 포함할 수 있다.
"폴리뉴클레오티드(Polynucleotide)는 사슬에 공유 결합된 복수의 뉴클레오티드 모노머들로 구성된 생고분자를 지칭한다. DNA(deoxyribonucleic acid) 및 RNA(ribonucleic acid)를 폴리뉴클레오티드의 예로 들 수 있다.
"단백질(Protein)"은 탄소, 수소, 산소, 질소 및 보통 황을 함유하며 주로 펩티드 결합에 의해 연결된 일 이상의 아미노산 사슬로 구성된 일련의 복합 유기 마크로분자를 지칭한다. 단백질은 자연적 또는 재조합에 의해 생성될 수 있다. 단백질은 글리코실레이션(glycosylation), 페길레이션(pegylation) 또는 다른 화학적 잔기들과의 콘쥬게이션 등을 통해 비아미노산 잔기들로 변성될 수 있다. 단백질의 비제한 적인 예로서, 항체, 응고 인자, 효소 및 펩티드 호르몬을 들 수 있다.
"줄기 세포(Stem cells)"는 다른 타입의 조직으로 분화되는 능력으로 알려진 세포들의 클래스를 지칭한다.
"과포화 전분(Supersaturated starch)"은 특정 단백질 제제에서 우세한 조건 하에서 이의 최대 용해도를 초과하는 양의 전분을 함유한 용액을 지칭한다. 특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 샘플내에서 전분이 예를 들면 10%, 20% 또는 특정 적용법의 요구사항에 따라 다소 변화된 양으로 비용해 상태로 그 일부가 존재하도록 하는 조건 하에서, 상기 샘플 내의 전분의 용해도 보다 많은 양으로 전분이 존재하는 용액을 제공한다.
"과포화 우레이드(Supersaturated ureide)"는 특정 단백질 제제에서 우세한 조건 하에서 이의 최대 용해도를 초과하는 양의 우레이드를 함유한 용액을 지칭한다. 특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 샘플내에서 우레이드가 비용해 상태로 그 일부가 존재하도록 하는 조건 하에서, 상기 샘플 내의 우레이드의 용해도 보다 많은 양으로 우레이드가 존재하는 용액을 제공한다.
"계면활성제(Surfactant)"는 일반적으로 소수성 부분 및 친수성 부분을 구현하여 양친매성(amphiphilic)으로 지칭되도록 하는 유기 분자들의 클래스와 같은 "표면 활성 제제"를 포함한다. 수용액 내 충분한 농도에서, 계면활성제는 물과의 접촉을 최소화하는 중심에 집중되는 소수성 부분 및 물과 접촉을 최대화하는 외측으로 방사하는 친수성 부분으로 클러스터를 이루며 자기-회합될 수 있다. 생물학적 제제, 특히 소수성 특성을 갖거나 소수성 영역을 보유하는 물질들을 함유하는 제제의 존재 하에서, 계면활성제의 상기 소수성 부분은 자발적으로 소수성 물질의 일부와 회합하며, 계면 활성제의 상기 소수성 부분의 영향을 통해 이의 용해도를 증가시키는 경향이 있다. 이들은 또한 수용성 용매내에서 용해된 서로 다른 소수성 물질들 사이에서 발생하는 소수성 상호작용을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시예들을 실행하는데 적합한 계면활성제의 예들은 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리소르베이트 계면활성제(예를 들면, Tween 20, 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노라우레이트, 및 Tween 80, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올리에이트) 및 Triton(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에테르)과 같은 비이온성 고분자, 및 CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate), CHAPSO (3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate) 및 옥틸 글루코시드(예를 들면, (2R,3S,4S,5R,6R)-2-(hydroxymethyl)-6-octoxyoxane -3,4,5-triol)와 같은 양쪽이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
"3분할 시스템(Tripartite system)" 또는 "3상 시스템(3-phase system)"은 주로 타겟 종, 유기 핵형성 중심 및 우선 배제 침전제를 함유하는 수용액 제제로 구성된 타겟 종을 침전시키기 위해 사용되는 시스템을 지칭한다. 일 예로 모노클로날 항체, 전분 및 PEG를 함유하는 세포 배양 상등액을 들 수 있다.
"2상 시스템(2-phase system)"은 본 발명의 특정 실시예들에 따른 3상 시스템과 구별되며, 주로 타겟 종 및 우선 배제 침전제를 함유하는 수용액 제제로 구성된 타겟 종을 침전시키기 위해 사용되는 시스템을 지칭한다. 일 예로서 모노클로날 항체 및 암모늄 설페이트를 함유하는 세포 배양 상등액을 들 수 있다.
"우레이드(Ureide)"는 일 이상의 우레아 잔기 또는 이의 유도체를 포함하는 자연적 혹은 합성된 시클릭 혹은 비시클릭 유기 분자를 지칭한다. 특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 우레아, 요산, 히단토인(hydantoin), 알란토인(CAS number 97-59-6; 알클록사(alcloxa), 알디옥사(aldioxa), 헤모칸(hemocane), 우레이도히단토인(ureidohydantoin), 5-우레이도히단토인, 글리옥실우레이드(glyoxylureide), 글리옥시산 디우레이드(glyoxylic acid diureide), 2,5-디옥소-4-이미다졸리디닐 우레아(2,5-dioxo-4-imidazolidinyl urea)), 퓨린(purines) 및 이의 유도체와 같은 우레이드들을 제공한다. 특정 실시예들에 있어서, 본 발명은 R-CO-NH-CO-NH2 또는 R-CO-NH-CO-NH-CO-R' 또는 R'R''NH-CO-NR'''R'''' 의 화학식을 갖는 유기 분자들을 제공하며, "R 그룹"은 수소 혹은 임의의 유기 잔기이다.
"바이러스" 혹은 "비리온(virion)"은 오로지 생물 호스트, 주로 박테리아, 식물 및 동물들의 세포에서 복제되는 극미소의(대략 20 내지 300nm의 지름), 대사적으로 불활성의, 전염성 제제를 지칭하며: RNA 혹은 DNA 코어, 단백질 코팅, 및 보다 복잡한 타입에서는 주위 외피로 구성된다. 비제한적인 예들은 dsDNA 바이러스, ssDNA 바이러스, dsRNA 바이러스, (+)ssRNA 바이러스, (-)ssRNA 바이러스, ssRNA RT 바이러스 및 dsDNA-RT 바이러스; 아데노바이러스(adenovirus), 헤르페스 바이러스(herpes virus), 폭스바이러스(poxvirus), 파보바이러스(parvovirus), 레오바이러스(reovirus), 피코르나바이러스(picornavirus), 토가바이러스(togavirus), 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus), 라브도바이러스(rhabdovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 헤파단바이러스(hepadanvirus), 파필로마바이러스(papillomavirus), 인간면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus (HIV)), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 뎅기 바이러스(dengue virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 및 박테리오파지(bacteriophages)를 포함한다. 용어 바이러스는 유전자 치료를 위한 벡터 용도, 백신 용도 및 항생제 대체물로서 용도를 위한 바이러스 입자들을 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 소위 수도비리온(pseudovirions)을 포함하는 것으로 이해되며, 이는 재조합적으로 변성되어 전염을 야기하는 능력이 제거된 반면 보호 면역을 생성하는 능력이 보존된 바이러스 입자들로 기술될 수 있다.
"폰 빌레브란드 인자(Von Willebrands Factor)"는 응고 단백질이다. 이는 Factor VIII에 결합되며, 약 2백만 dalton의 분자량을 갖는 소위 항-혈우병(anti-hemophiliac) 인자를 형성한다.
특정 실시예들의 실행을 위한 상세 물질들 및 방법들
유기 핵형성 중심으로 사용되는 효과적인 물질들은 제제 내에서 최소한 부분적으로 불용성인 양으로 존재하는 자연 유기 화합물로 구성될 수 있다. 이의 예들은 이에 제한되는 것은 아니나, 비제한적인 예로서 셀룰로스, 전분 및 당을 포함하는 카르보하이드레이트; 비제한적인 예로서 알란토인 및 요산을 포함하는 우레이드; 및 비제한적인 예로서 히스티딘을 포함하는 아미노산과 같은 고 극성 물질들을 포함한다. 물속에서 팽윤하지 않는 물질들이 일반적으로 바람직하나, 셀룰로스와 같이 팽윤하는 물질들도 효과적인 결과들을 생성할 수 있다. 본 방법의 수행은 단일 제한 제제를 사용함에 의해 단순화될 수 있으나, 2 이상의 조합들도 효과적으로 사용될 수 있다. 일반적으로, 강한 친화도는 침전제의 제거 시 타겟 종의 회수 불량을 야기할 수 있으므로, 유기 핵형성 중심에 대한 침전되어야 할 종들의 내재적인 친화도는 영(nil)이어야 한다. 그러나, 약한 친화도는 본 방법에 의해 획득되는 순도를 향상시킬 수 있으며, 친화도 인자를 약화시키거나 중지시키는 물질의 존재 하에 회수 단계를 수행함에 의해 회수 손실이 최소화될 수 있다. 우레이드의 사용은 명백히 작은 종들 보다 대형 종들에 대한 차등 친화도에 기인하여, 항체 제조에 있어서 응집 감소의 놀라운 효과를 이끌어낸다. 이는 우선적으로 응집을 다수 생성하는 경향이 있는 종래의 방법에 대해서 본 방법의 현저한 차별성을 부여한다.
상기 유기 핵형성 중심의 물리적 형태는 미립자, 필라멘트 또는 분지된 필라멘트일 수 있다. 임의의 입도의 입자들이 채용될 수 있다. 보다 미세한 입도는 건조 그램당 보다 높은 표면적을 의미할 수 있으며, 이는 그램 당 보다 높은 공침전 용량에 상응하며 상기 핵형성 중심 사용량을 낮출 수 있는 것으로 기대될 수 있다. 보다 거친 입도는 반대 경향을 도출하는 것으로 예상될 수 있으나, 원심분리보다는 여과에 의한 상등액 제거를 촉진함으로써 일부 환경에서는 유리할 수 있다. 미립자 물질을 사용하는 적용예에서는, 기공을 탈출하는데 실패한 타겟 종들의 비율에 의한 잠재적 손실을 회피할 수 있으므로, 비기공성 물질들 또는 타겟 종이 진입하기에 지나치게 작은 기공을 갖는 물질들이 선호될 수 있다.
상기 유기 핵형성 중심의 양은 모든 타겟 종들을 공침전시키기에 충분한 양이어야 한다. 이는 실험에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 유기 핵형성 중심의 전형적인 양은 5% 내지 20% 범위일 수 있으나, 본 방법은 효과의 감소 없이 더 작은 그리고 더 많은 양으로 실행될 수도 있다. 일반적으로 샘플 물질의 lot-to-lot 편차를 예상하여 실험적으로 최소로 결정된 양보다 다소 많은 양을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 소위 다소 많은 양이란, 샘플 조성물의 편차 수준에 따라 10% 더 많은, 또는 50% 더 많은 혹은 최소량의 2배에 상응할 수 있다. 지나치게 많은 양은 타겟 종의 수용불가능한 손실을 초래할 수 있다.
제한 제제는 단백질 및 바이러스들의 침전에 상용되는 임의의 우선 배제 용질일 수 있으며, 이는 비제한적인 예로서, 암모늄 설페이트, 소듐 설페이트, 소듐 시트레이트 또는 포타슘 포스페이트; 또는 PEG, PPG, PVP 또는 덱스트란을 포함할 수 있다. 본 방법은 단지 단일 제한 제제가 사용되는 경우 더 단순할 수 있으나, 2 이상의 조합을 사용하여도 효과적으로 수행될 수 있다. 일반적으로, 선택된 상기 제한 제제의 유효 레벨은 본 발명이 제외된 침전에 채용되는 레벨과 유사할 수 있으나, 세심한 실험결과 필요량은 보통 낮은 것으로 나타난다. 그러나, 높은 레벨 역시 효과적으로 사용될 수 있으며, 다량의 제한 제제가 정제 인자의 수용불가능한 감소를 초래하지 않는 한, 유기 핵형성 중심의 필요량을 감소시키는 효과를 가질 수 있다.
상기 제한 제제는 농축액 형태로 첨가되어 액체를 통해 분산되는 효율을 증가시킬 수 있다. 첨가는 손으로 또는 펌프를 사용하여 자동화되어 편리하게 수행될 수 있다. 상기 제한 제제는 파우더로 첨가될 수도 있다. 이는 최종 공정 부피를 감소하는 이점을 제공하나, 상기 제한 제제가 용해되는 시간이 필요하므로 첨가 시간이 증가될 수 있다. 일반적 개시점으로서, 건조 파우더의 첨가는 60분 동안 수행됨에 반해, 농축액으로서 제한 제제의 첨가는 30분 동안 수행될 수 있다. 후속 실험은 임의의 주어진 적용예에 대해 특정 한계들을 보여줄 수 있다.
본 발명의 중요하고 현저한 특징은 비이온성 고분자 제한 제제가 침전 염들보다 빈번하게 양호한 결과를 제공한다는 점이다. 침전 염들의 사용은 pH 지시 염료 및 다른 소수성 물질들을 포함하는 작은 분자 오염물들의 공침전을 야기한다. 상기 비이온성 고분자 제한 제제의 사용은 이러한 문제를 회피하며, 이는 PEG와 같은 비이온성 고분자들의 소수성 및 강한 수소 결합 능력이 상기 오염물들의 용해도를 증진시키며, 상기 유기 핵형성 중심과의 비특이적 상호작용을 억제하기 때문으로 추정된다.
본 방법은 주요 산물 포획, 중간체 정제 또는 연마(polishing)에 사용될 수 있으며; 예를 들면, 상기 방법은 다른 정제 방법들의 수행 전 또는 수행 이후에 사용될 수 있으며, 모든 단계에서 정제의 전체적인 요구사항을 우수하게 충족시킬 수 있다. 다른 정제 방법들은 다른 침전 방법들로 구성될 수 있으나, 크로마토그래피 방법이 더 상용될 수 있으며, 비제한적인 예로서 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 소위 혼합 모드 크로마토그래피 방법을 포함할 수 있다.
항체들 및 바이러스 입자들은 본 방법이 적용될 있는 타겟 종의 널리 공지된 두 클래스들이나, 종래의 2상 시스템으로 효과적으로 침전될 수 있는 다른 타겟 종에도 동일한 이점을 획득하기 위해 사용될 수 있다.
본 방법은 저순도 혼합물로부터 관심 대상의 산물을 공침전시키기 위해 가장 빈번하게 사용될 수 있으나, 이는 상기 관심대상 산물이 용해상태로 잔류하는 동안 조제물로부터 특정 오염물을 공침전시키기 위해 적용될 수도 있다.
일반적으로, 상기 유기 핵형성 중심의 균일성은 종래의 2상 시스템으로 수득될 수 있는 매우 고도의 분해능을 가능케 할 것으로 예상된다. 다르게 말하면, 본 발명은 2상 시스템에 의해 효과적으로 분류되지 않는 오염물들로부터 관심 대상 산물의 효과적인 분류를 가능케 할 수 있다.
유기 핵형성 중심의 관여는 우선 배제 제제에 의해 침전이 유도되는 시스템에 있어서 가장 효과적일 수 있으나, 이는 유기 용매와 같은 다른 침전제에 있어서도 상당한 향상을 제공할 것으로 기대된다.
본 발명의 추가적인 목적 및 이점들이 이어지는 상세한 설명에 제공될 것이며, 부분적으로는 상세한 설명으로부터 자명하게 인식될 수 있으며, 또는 본 발명의 수행을 통해 인지될 수 있다. 본 발명의 목적 및 이점들은 청구항에 특정된 구성들 및 조합 수단에 의해 구현되고 수득될 수 있다.
상술한 일반적인 설명 및 이어지는 상세한 설명들은 모두 예시적인 것이며, 청구되는 본 발명을 제한하기 위해 사용된 것이 아님을 이해해야한다.
상술한 기술은 불용성이나 100nm 내지 100㎛ 범위의 사이즈를 갖는 수화된 유기 핵형성 중심을 채용한다. 이러한 핵형성 중심들은 크로마토그래피 수행을 위해 설계 또는 의도된 합성 입자들과 대비하여 특히 자연 유기 물질들을 포함한다. 수화는 극성 표면 잔여물과 물의 상호작용에 의해 부여된다. 이러한 입자들은 단백질 또는 다른 관심대상 산물과 결합된다. 유기 핵형성 중심의 넓은 총 누적 표면적은 단백질-단백질 상호작용 보다 단백질-표면 상호작용의 높은 빈도에 유리하다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 다른 소위 배제 용질(제한 제제)과 같은 비이온성 유기 고분자의 후속 첨가는 상호작용하는 단백질 및 표면으로부터 벌크 용매로 과량의 물의 전달을 야기하며, 이에 따라 단백질이 상기 표면에 트랩된다. 트랩되지 못한 오염물들은 세척되어 제거된다. 결합은 배제 용질의 제거에 의한 현재-정제된 상태에서 PEG가 제거될 때까지 안정하게 유지된다.
수화된 표면의 높은 접근성은 배제 용질을 사용한 침전(30분에서 수 시간)에 비해 매우 유리한 빠른 동역학적 특성(수 초에서 수 분)을 가능케 한다.
상기 수화된 표면의 균일성은 단백질-단백질 표면들의 상호작용에 의해 야기되는 통상적으로 넓게 정의된 침전 및 재용해 등온선과 비교하여 좁게 정의된 흡착 및 탈착 등온선을 가능케 한다. 이는 고도의 분해능, 예를 들면 고도의 정제 인자로 변환된다.
유기 핵형성 중심의 사용은 PEG와 같은 비이온성 유기 고분자 및 암모늄 설페이트와 같은 침전 염 등의 배제 용질을 사용한 종래의 침전 방법보다 향상된 분류 속도 및 분해능을 제공한다.
본 발명의 실행을 위해 적합한 제한 제제들은 특히, 일반적으로 600 내지 6000 Dalton 범위의 분자량 및 이보다 많거나 작은 양에 해당하는 분자량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)와 같은 비이온성 유기 고분자를 포함한다. 다른 비이온성 유기 고분자들, 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리프로필렌 글리콜, 덱스트란 및 기타의 물질들도 효과적으로 사용될 수 있다. 본 발명을 실행하기 위해 적합한 다른 우선 배제 용질들은 암모늄 설페이트, 소듐 설페이트, 소듐 혹은 포타슘 시트레이트, 포타슘 포스페이트 및 기타 염을 포함하는 그룹에서 선택되는 코스모트로픽 염; 및 글리신과 같은 아미노산을 포함할 수 있다. 실험 데이터에 의하면 상이한 우선 배제 용질은 상이한 선택성을 부여할 수 있다. 따라서, 일반적으로 최선의 결과는 특히 생물학적 샘플이 세포 배양 상등액과 같은 원료(crude) 조성물일 때 비이온성 유기 고분자들에 의해 수득되나, 배제 용질 대비 비이온성 유기 고분자 또는 아미노산으로 수득된 결과를 비교하는 것이 중요할 수 있다. 이러한 샘플에서의 우선 배제 용질의 사용은 통상적으로 크로마토그래피 담체 상에 짙은 색의 소수성 물질의 부착을 야기하여 작동 압력에 있어서 이탈 증가를 일으킬 수 있다. 우선 배제 제제로서 비이온성 유기 고분자의 사용은 상기 고분자의 내재적인 소수성에 근거하여 이러한 문제들을 억제할 수 있다. 본 방법은 비이온성 유기 고분자와 염과 같은 서로 다른 우선 배제 제제 클래스의 조합으로 실행될 수 있으나, 일부 조합들은 자발적인 상 분리를 생성할 수 있으므로, 주의를 기울여야 한다. 비이온성 유기 고분자의 또 다른 중요한 이점은 이들의 화학적 안정성이다. 고농도의 PEG는 오랫동안 단백질을 안정시키는 것으로 알려져왔으며, 이들은 생물 세포에 의해 허용될 수 있고, 다수의 FDA-승인된 인간-주입 가능한 치료 제형들이 PEG를 비활성 성분으로 채용하고 있다.
본 발명의 실행을 위해 적합한 크로마토그래피 담체는 특히 고도로 수화된 표면을 갖는 매체를 포함한다. 흡착 크로마토그래피를 위해 비관능화된 다수의 고분자-기반 매체는 물과 강하게 상호작용하는 히드록실 그룹들이 고밀도로 배치된 표면들을 가지며, 상기 표면은 고도로 수화된다. 고도로 수화된 물질들에 의해 관능화된 표면들 역시 이상적이며, 고정화된 당, 전분, 기타 카르보하이드레이트 및 우레이드를 포함할 수 있다. 양성 및 음성으로 하전된 그룹들 역시 고도로 수화되는 경향이 있으며, 생물학적 샘플 성분들 및 담체 사이의 전하 상호작용이 효과적으로 중지되는 고염 조건에서 본 발명을 실행하는데 사용될 수 있다. 일부 소수성 특성을 갖는 표면들은 표면을 지배하기에 충분한 전체적은 극성 성질을 보유한다면 적절하며, 이는 소수성 상호작용 크로마토그래피 수행을 위해 의도된 대부분의 표면들을 배제한다. 입자-기반 크로마토그래피 담체들이 원리 증명을 보여주기 위해 적절한 효율성으로 사용될 수 있으나, 본 방법은 이의 실용적 사용을 제한하는 한계적 특성으로 작용한다. 높은 유속에서 유용한 용량 및 분류 능력은 모노리스 및 멤브레인과 같은 대류성 크로마토그래피 담체들에 의해서만 획득된다. 모노리스는 멤브레인보다 높은 용량 및 분해능을 보장하는 반면, 멤브레인은 일반적으로 모노리스보다 높은 유속을 보장할 수 있다. 특정 적용예의 요구에 가장 적합한 것은 간단한 실험을 통해 결정될 수 있다.
본 발명에 의해 효과적으로 정제될 수 있는 생물학적 산물은 항체 및 응고 인자를 포함하는 단백질; 바이러스 입자; 리보솜, 미토콘드리아 및 엑소좀과 같은 세포 기관들을 포함한다.
담체에 결합된 생물학적 산물의 용출은 우선 배제 제제의 능력을 저해하는 제제를 첨가하여 타겟 산물의 결합을 유지함으로써 수행될 수 있다. 이러한 제제들은 바람직하게는 계면활성제, 우레아, 중성 염, 폴리사카라이드, 및 소듐 혹은 포타슘 티오시아네이트(thiocyanate), 소듐 혹은 포타슘 퍼클로레이트(perchlorate) 및 구아니딘과 같은 카오트로픽(chaotropic) 염을 포함하며; 또는 대부분의 경우에서 단순한 우선 배제 제제 감소 방법이 선호될 것이나, 우선 배제 제제 농도의 감소와 함께 이러한 제제들이 적용될 수 있다.
크로마토그래피 표면 및 관심대상 산물 사이에 수화 물의 공유 이외의 화학적 상호작용은 영(nil)인 것으로 이해되나, 본 방법의 선택성 및 효율은 pH 및 전도도에 상당한 영향을 받는다. 이는 pH가 상기 산물의 표면 전하에 영향을 미쳐, 이에 따라 수화의 정도에 영향을 줄 수 있다는 기대와 일치한다. 전도도의 효과는 현재 완전히 이해되지는 않았으나, 실험적 관점에서 볼 때 소듐 클로라이드의 유효 농도의 함유는 빈번하게 작동 압력 감소의 일반적 효과를 가지며 칼럼에 있어서 보다 높은 로딩 용량을 허용한다. 이는 이온 교환 및 소수성 상호작용 크로마토그래피의 동작과 상반되며, 따라서 본 방법의 독특한 선택성을 부각시킨다는 점에서 주목된다. 일반적으로, 선택성은 주로 관심 대상 산물의 사이즈의 함수이며, 유지 강도는 상기 산물의 사이즈에 비례한다. 이는 단백질 수화가 사이즈에 비례한다는 사실과 합치한다. 실제 결과는 결합에 필요한 우선 배제 제제의 농도는 산물 사이즈에 역비례한다는 것이다. 양호한 바이러스 결합은 5%의 낮은 PEG-6000 농도에서 획득되며, IgM 항체는 이의 2배, IgG 항체는 여기에 5% 더 많은 농도를 요구한다.
비이온성 고분자 사용의 추가적인 이점은 본 발명 사용에 의한 정제도를 증가시키기 위해 사용될 수 있는 다른 크로마토크래피 방법들과 직접적인 양립성을 제공한다는 점이다. PEG는 비이온성이므로 비-소수성 리간드 기반 크로마토그래피 방법과의 간섭을 회피할 수 있다. 본 방법에 의해 정제된 항체들 및 바이러스 입자들이, 두 경우 모두 샘플과 중간 평형을 요구함이 없이 음이온 교환기 및 히드록시아파타이트 칼럼에 직접적으로 적용될 수 있음이 실험 결과를 통해 확립되어 있다. 이는 본 발명이 일반적으로 다른 크로마토그래피 방법들, 침전법들 및 액체-액체 분리(partitioning)를 포함하는 일 이상의 다른 방법들과 조합되어 실행될 수 있다는 점을 부각시킨다. 이러한 방법들에 대한 적절한 조건들을 개발하고 이들 본 출원에 설명되는 발명과 병합하여 특정 생물학적 산물의 원하는 정제를 획득하는 것은 당해 기술 분야에 통상의 지식을 가진자의 능력 범위에 있다.
타겟 종을 함유하는 샘플을 고도로 수화된 크로마토그래피 표면과 접촉시키기 위한 조제물에 있어서, 특정 실시예에 있어서, 크로마토그래피 담체 내부의 화학적 환경을 평형화 하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 칼럼을 통해 평형 버퍼를 유동시켜 특히 우선 배제 용질 농도를 포함하는 적절한 조건을 수립합으로써 달성될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 평형 버퍼는 적절한 pH 조절을 부여하는 버퍼링 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 화합물은 이에 제한되는 것은 아니나, 아세테이트(acetate), 포스페이트, MES, HEPES, BICINE, 이미다졸(imidazole) 및 Tris를 포함한다. 상기 평형 버퍼의 pH는 약 pH 4.0 내지 약 pH 9.0 범위일 수 있다. 모노클로날 IgM의 정제를 위해 적절한 일 실시예에 있어서, 상기 평형 버퍼는 pH 7.0에서 약 50mM 농도의 Hepes, 200mM 농도의 소듐 클로라이드 및 12.5% 농도의 PEG-6000을 함유한다. IgG의 정제를 위해 적절한 또 다른 실시예에 있어서, 상기 평형 버퍼는 약 pH 7.0에서 약 50mM 농도의 Hepes, 1.0M 농도의 소듐 클로라이드 및 15% 농도의 PEG-6000을 함유한다. 바이러스 입자의 정제를 위해 적절한 또 다른 실시예에 있어서, 상기 평형 버퍼는 pH 5.8에서 약 50mM 농도의 MES, 600mM 농도의 소듐 클로라이드 및 6% 농도의 PEG-6000을 함유한다. 항체 정제를 위해 적절한 또 다른 실시예에 있어서, 상기 평형 버퍼는 약 pH 7.0에서 약 50mM 농도의 Hepes, 약 1.5M 농도의 암모늄 설페이트를 함유한다.
특정 실시예들에 있어서, 산물 제조물은 본 발명이 실행되기 전에 칼럼 평형 버퍼와 양립 가능한 조전에서 평형이 유지된다. 일 실시예에 있어서, 샘플은 하나의 라인을 통해 칼럼 상에 펌핑되고, 우선 배제 용질의 농축 용액은 또 다른 라인을 통해 동시에 상기 칼럼 상에 펌핑되고, 상기 칼럼 직전에 상기 두 라인들은 혼합되어 산물이 우선 배제 제제에 노출되는 프리 칼럼 시간을 최소화시킬 수 있으며, 이는 상기 샘플이 상기 칼럼 상으로 유입되기 전에 발생하는 침전 정도를 제한하는 수단으로서 작용한다. 일 실시예에 있어서, 하나의 라인을 통해 적용되는 상기 우선 배제 제제의 농도는 혼합물의 타겟 농도의 125%이고, 샘플 대비 우선 배제 제제의 혼합비는 80% 제제, 20% 샘플이다. 특정 실시예들에 있어서, 이는 광범위한 유효 개시점을 제공하며, 결정되어야할 요구사항은 단지 원하는 산물 결합 특성을 획득하기 위해 최종 혼합물 내에 요구되는 우선 배제 제제의 양이다. 수작업 방법에 있어서, 상기 우선 배제 제제의 상대적 농도 및 배합비 인자는 최저 혼합 샘플 부피와 조합되어 최고 용량을 보장하는 조건을 식별하기 위해 다양화될 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 상기 우선 배제 제제는 PEG-8000, 또는 PEG-6000, 또는 PEG-3500, 또는 PEG-2000, 또는 PEG-1000, 또는 PEG-600이다. 일반적으로, 고분자가 커질수록 양호한 결합을 획득하기 위해 요구되는 농도는 낮아진다. 낮은 분자량의 PEG들은 불균형적으로 낮은 점도를 갖는 경향이 있다. 낮은 점도는 낮은 작동 압력을 발생시키며, 기계적 시스템의 혼합 능력 상에 낮은 스트레스를 가한다는 점에서 유리할 수 있으므로, 이러한 옵션을 적용하는 것은 가치있을 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 평형 버퍼의 제형은 평형이 유지된 샘플의 제형과 실질적으로 상이할 수 있다. 예를 들면, 1.2M의 소듐 클로라이드가 샘플에 첨가될 수 있으며, 반면 평형 버퍼는 400mM의 소듐 클로라이드의 넷(net) 샘플 염 농도를 유지하기 위한 목적으로 단지 200mM의 소듐 클로라이드를 함유하며(인-라인 희석 비율 80:20), 이어서 200mM의 소듐 클로라이드로 바로 세척될 수 있다. 이러한 전략은 높은 염 농도가 높은 결합 용량에 기인하나, 보다 낮은 염 농도가 특정 오염물의 부분 집합을 세척하기 위해 보다 효과적일 때 사용될 수 있다. 염 농도의 상이함에 추가하여, 두 버퍼들은 pH, 다른 제제들의 존재, 부존재 또는 양에 있어서 상이할 수 있다. 유사한 효과가 선택적으로 제2 세척 버퍼를 적용함으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예들에 있어서, 칼럼은 샘플 로딩 이후, 평형 버퍼와 통상적으로 동일한 조성의 세척 버퍼로 세척되어 크로마토그래피 담체로부터 미결합된 오염물들을 제거한다.
본 방법의 특정 실시예들에 있어서, 이어서 산물은 단지 우선 배제 제제의 농도를 감소시킴으로써, 예를 들면 Hepes/PEG에서 단지 Hepes 버퍼로의 농도구배를 생성함으로써 크로마토그래피 담체로부터 용출된다.
다른 실시예에 있어서, 우선 배제 제제의 감소는 농도구배 종말점 버퍼 내에 이러한 물질을 증가시킴으로써 일 이상의 용출 증진 물질의 증가를 수반한다. 이러한 제제들의 예는 우레아, 아르기닌 또는 계면 활성제를 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 실시예들을 실행하기에 적합한 제한 제제들은 특히 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 유기 고분자를 포함하며, 이들의 분자량은 일반적으로 600 내지 6000 Daltons 범위이며, 이보다 낮은 또는 높은 범위도 포함할 수 있다. 고분자량의 PEG는 오랫동안 단백질을 안정시키며, 생물 세포에 의해 용인되는 것으로 알려져 있으며, 다수의 FDA-승인된 인간-주입가능한 치료 제형들은 불활성 제제로서 PEG를 채용하고 있다. 다른 비이온성 유기 고분자들 역시 효과적으로 사용될 수 있으며, 이의 비제한적인 예로서 폴리프로필렌 글리콜, 덱스트란 등을 들 수 있다. 본 발명을 실행하는데 적합한 다른 우선 배제 제제들은 암모늄 설페이트, 소듐 설페이트, 소듐 혹은 포타슘 시트레이트, 포타슘 포스페이트 등을 포함하는 그룹에서 선택되는 코스모트로픽 염들; 글리신과 같은 아미노산을 포함할 수 있다. 실험 데이터는 상이한 우선 배제 제제들은 상이한 선택성을 부여함을 나타낸다. 따라서, 배제 염들 대비 비이온성 유기 고분자 혹은 아미노산으로 획득된 결과를 비교하는 것이 가치있을 수 있다. 본 방법은 비이온성 유기 고분자를 갖는 염들과 같이 우선 배제 제제의 상이한 클래스들의 조합으로 실행될 수 있으나, 일부 조합들은 자발적 상분리를 생성할 수 있으므로 주의가 필요하다.
본 발명의 특정 실시예들을 실행하는데 적합한 크로마토그래피 입자들은 특히 고도로 수화된 표면들을 갖는 입자들을 포함한다. 흡착 크로마토그래피를 위해 비관능화된 다수의 고분자-기반 매체는 물과 강하게 상호작용하는 히드록실 그룹들이 고밀도로 배치되어 고도로 수화된 표면들을 갖는다. 고도로 수화된 물질들로 관능화된 표면들도 또한 이상적이며, 이는 고정화된 당, 전분, 다른 카르보하이드레이트들 및 우레이드를 포함할 수 있다. 양성 및 음성으로 하전된 그룹들 역시 고도로 수화되는 경향이 있으며, 생물학적 샘플 성분들 및 담체 사이의 전하 상호작용이 효과적으로 차단되는 고염 조건에서 본 발명을 실행하는데 사용될 수 있다. 일부 소수성 특성을 갖는 표면들은 이들이 전체적으로 표면을 지배하는 충분한 극성 특성을 보유하는 경우 적합하며, 이는 소수성 상호작용 크로마토그래피 수행을 위해 의도된 대부분의 표면들을 배제할 것이다.
특정 실시예들에 의한 본 방법은 기공성 입자들을 이용하여 수행될 수 있으나, 비기공성 입자들이 유리함이 밝혀졌다. 기공성 입자들은 오염물들 및 관심대상 산물 양자를 포함하는 다양한 단백질들이 기공 내부로 확산되는 가능성을 제공하여 정제 및 산물 회수를 포함하는 본 공정의 다양한 단계들에서 점진적으로 누출될 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 입자들의 사이즈는 100nm 내지 200μm 범위일 수 있다. 이는 나노입자들에서 마이크로입자들의 범위를 커버하면, 이들 모두 효과적임이 밝혀졌다. 입자들은 고분자, 미네랄 또는 금속을 포함하는, 입자들의 내부와 상이한 표면 조성을 갖는 임의의 물질로 구성될 수 있다. 이는 특히 자성 분리기에 의해 수집될 수 있도록 설계된 철-코어 입자들, 및 본 방법이 소위 확장 베드 모드에서 실행될 때 고밀도로 코어가 존재하는 합금 코어 입자들을 포함한다. 후자의 예로서, 셀룰로스로 코팅된 텅스텐-카바이드-코어 입자들을 들 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 입자들의 양은 모든 타겟 종들의 결합을 수용하기에 충분한 양이어야 한다. 이는 실험에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적인 양은 5% 내지 20% 범위일 수 있으나, 본 방법은 효율 감소 없이 그보다 더 적거나 더 많은 양으로도 실행될 수 있다. 일반적으로, 샘플 물질의 lot-to-lot 편차를 예상하여 실험적으로 최소로 결정된 양보다 다소 많은 양을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 소위 다소 많은 양은 샘플 조성의 편차 레벨에 따라, 10% 더 많은, 혹은 50% 더 많은, 또는 최소량의 2배일 수 있다. 과도하게 많은 양은 타겟 종들의 용인할 수 없는 손실을 야기할 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 제한 제제는 농축 액체로서 첨가되어 상기 액체에 걸쳐 분산 효율을 증가시킬 수 있다. 상기 첨가는 수작업으로 혹은 펌프를 사용하여 편리하게 자동화로 수행될 수 있다. 침전제는 선택적으로 파우더로 첨가될 수 있다. 이는 최종 공정 부피를 감소시키는 이점이 있으나, 상기 침전제가 용해되는 시간이 허용되어야하므로 첨가가 수행되는 시간을 증가시킨다. 일반적 개시점으로서, 농축 액체로서 침전제의 추가는 30분 또는 그 이상의 시간동안 수행될 수 있으며, 반면 건조 파우더의 첨가는 60분 또는 그 이상의 시간에 걸쳐 수행될 수 있다. 후속 실험들은 임의의 주어진 적용예에 있어서 특정 한계들을 드러낼 것이다.
본 발명의 특정 실시예들에 의해 효과적으로 정제될 수 있는 생물학적 산물들은 항체 및 응고 인자를 포함하는 단백질; 바이러스 입자들; 리보솜, 미토콘드리아 및 엑소좀을 포함하는 세포 기관들을 포함한다. 보다 일반적 레벨에서, 본 발명은 염들 또는 비이온성 유기 고분자들을 사용한 침전에 의해 부분적으로 정제될 수 있는 임의의 산물의 정제를 위해 이점을 가지고 적용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시예들에 의한 방법이 불순한 혼합물로부터 관심 대상 산물을 침전시키는데 가장 빈번히 사용될 것이나, 이는 또한 관심 대상 산물이 불용성으로 존재하는 가운데 조제물로부터 특정 오염물을 침전시키는데 적용될 수 있다. 본 발명은 이의 필수적 특징으로부터 벗어남이 없이 단순하거나 복잡한 기계적 시스템을 사용하여 실행될 수 있다.
공침전 방법과 연관된 본 발명의 특정 실시예들을 실행하기 위해. 이의 이점을 측정하는 정의된 개시점을 사용하는 것이 유용할 것이다. 이에 대한 접근법 중 하나는 참조 물질을 생성하기 위한 표준 프로토콜에 따라 암모늄 설페이트 침전 및/또는 PEG 침전을 수행함으로써 개시하는 것이다. 이어서 본 발명의 염 및/또는 PEG 대응물을 수행한다. 예를 들면, IgG 항체의 경우 20%의 무게-대-부피비에서 항체 조제물을 전분과 결합시킨다. 상기 항체 조제물에 전분을 완전히 분산시키고(교반), 30%의 PEG-6000을 30분 동안 첨가하여 최종 농도 15%의 PEG를 생성한다. 샘플을 원심분리하여 전분 및 공침전된 항체를 침전시킨다. 공침전 혼합물을 pH 6.8-7.2의 포스페이트 완충 혹은 Hepes 완충 염수(100-150 mM NaCl)와 같은 생리학적 버퍼로 재서스펜딩시킴으로써 항체를 회수한다. IgM의 경우, 12.5%와 같은 적은 양의 PEG로도 충분할 것이다. 바이러스 종에 있어서는 5-7.5% PEG와 같이 더 적은 양의 PEG로 충분할 것이다. 표준 실험실 방법에 의해 순도, 회수 및 응집체 함량을 특성화한다.
통상적으로 PEG가 침전 염보다 양호한 결과를 나타냄에 부가하여, 이는 특정 실시예들에 있어서 본 방법의 선택성을 미세 조절하는 광범위한 기회를 제공하여 순도 및 회수를 최적화할 수 있다. 침전 염의 높은 전도도는 단백질들 사이에서 전하 상호작용을 억제하며, 이에 따라 저 전도도의 효과를 획득하는 것이 불가능해지며, 시스템 작동에 있어서 pH 변화에 대한 반응성을 낮춘다. PEG에 있어서, 전도도는 소듐 클로라이드와 같은 비침전 염으로 0에서 매우 높은 값까지 변화될 수 있다. 특히 저전도도 값에서, pH 변이는 시스템의 선택성을 변경하는 중요한 기회를 제공할 수 있다.
특정 실시예들에 있어서, 카르보하이드레이트 유기 핵형성 중심 대비 우레이드 유기 핵형성 중심을 사용한 결과들의 차이점을 분석하는 것이 중요할 수 있다. 예를 들면, 단순히 전분을 알란토인으로 대체하고, 회수된 단백질의 응집체 함량에 주의하면서 결과를 비교함으로써, 본 발명의 특정 실시예들에 있어서 특정 유기 핵형성 중심의 상대적 장점의 평가가 가능하다. 본 발명의 우레이드 버전으로부터 회수된 항체는 통상적으로 1-2% 낮은 응집체를 함유한다. 우레이드는 일부 단백질에의 약한 결합에 기인하여 바이러스에 대해 전분보다 낮은 회수를 부여하는 경향이 있을 수 있으나, 공침전이 수행되는 버퍼 내에 아르기닌 혹은 우레아를 포함시킴으로써 효과를 보상할 수 있다. 전분 대 알란토인의 기본 평가에 이어서, 두 클래스들의 광범위한 선택으로 결과들을 평가하는 것이 가치있을 수 있다.
유기 핵형성 중심, 침전제, 정의된 pH 및 전도도 조건으로, 샘플 부피당 유기 핵형성 중심의 필요한 양을 결정하기 위한 실험들이 수행될 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 위에 제안된 20% 양은 일반적으로 과량으로 나타날 것이다. 더 많은 양으로 평가될 수 있으나, 더 적은 양들이 통상적으로 적합한 것으로 나타날 것이다. 일반적으로, 더 적은 양들이 특히 본 발명이 스케일 업(scale up)되는 경우 유리한 것으로 나타날 수 있다.
물질들 및 비율에 상관없이, 최종 산물의 순도는 일반적으로 특정 실시예들에 있어서 초기 공침전 및 회수 단계 사이에서 중간 세척 단계를 수행함으로써 향상될 수 있다. 이러한 세척 단계는 최초 공침전 혼합물과 동일한 농도의 침전제를 함유하는 클린 버퍼 용액으로 제1 공침전물을 재서스펜딩하고, 이어서 제2 상등액을 배출하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 동작은 초기 침전 후에 공침전물의 간극 내의 유체 내에 잔류할 수 있는 오염물들을 희석시킨다. 이러한 단계는 원하는 산물이 높은 레벨의 순도에 이를 때까지 반복될 수 있다. 이는 원심분리 대신 여과 포맷에서 세척을 수행함으로써 촉진될 수 있다.
물질들 및 비율에 상관없이, 최종 산물의 순도는 일반적으로 특정 실시예들에 있어서 제2 회수 단계를 수행함으로써 향상될 수 있다. 재용해된 산물을 함유하는 초기 회수 버퍼를 제거한 후, 클린 버퍼의 또 다른 일정분이 첨가되어 유기 핵형성 중심을 재서스펜딩시킬 수 있다. 이는 제1 회수 단계 후에 유기 핵형성 중심의 간극에서 접근이 불가능했던 재용해된 산물의 회수를 가능케한다.
상술한 다양한 관점들에서 제안된 바와 같이, 특정 실시예들에 있어서 본 발명은 원심분리 혹은 여과 포맷으로 수행될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 특정 이론에 제한됨이 없이, 대형 생물학적 화합물들을 이들의 각 수화 쉘(shell) 사이에서 제한된 물의 공유를 통해 배타적으로, 비반응성 친수성 표면에 트랩시킴으로써 이들을 정제하는 방법을 제공한다. 상기 트랩은 우선적으로 친수성 표면을 수화시키는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 제제들에 의해 유도 및 안정화된다. 선택성은 분자 사이즈와 연관된다. 유지(retention)는 PEG 사이즈 및 농도에 따라 증가된다. 결합은 타겟 생분자의 등전위 점(isoelectric point: pI) 근방에서 증진된다. 염은 PEG 사이즈를 감소시킴으로써 유지를 약화시킨다. 크루드 피드 스트림(crude feed stream)으로부터의 단일-단계 정제 인자는 IgG에 대해서 90% 내지 바이러스 입자들에 있어서 99.8% 범위에 이른다. 생리학적 pH 및 전도도에 가까운 분류는 바이러스 및 IgM과 같은 만성적으로 불안정한 생물학적 개체의 활성을 보존한다. 모노리스 상의 바이러스 결합 용량은 mL 당 약 1조의 입자들에 이른다. 자성 나노입자-기반 버전은 상응하는 양이온 교환 입자들보다 30배 높은 IgG 결합 용량을 획득할 수 있다.
당해 분야의 통상의 기술자라면 주어진 적용예를 지지하기 위해 필요한 정도까지 본 공정을 스케일 업 하는 방법을 명확히 이해할 수 있을 것이다.
실험예들
실험예 1: IgM의 정제
약 50㎍/mL IgM 클론(clone) 529를 함유하는 100mL의 정화된 세포 배양 상등액(cell culture supernatant)을 교반되게 하였다. 4g의 감자 전분을 상기 용액 내에 분산시켰다. 50mM 헤페스(Hepes), pH 7.0의 200mM NaCl, pH 7.0 내의 30% PEG-6000이 연동 펌프(peristaltic pump)를 통해 30분의 주기로 10%의 최종 농도까지 첨가되었다. 교반은 상기 상등액의 원심분리 및 제거에 수반하여 추가적으로 30분 동안 계속되었다. 공침된(co-precipitated) IgM-전분은 10% PEG, 50mM 헤페스(Hepes), 200mM NaCl, pH 7.0 내의 재현탁에 의해 세척되었으며, 이후에 원심분리되었고, 상기 상등액이 제거되었다. 상기 IgM이 분리되었고, 50mL of 50mM 헤페스, 200mM NaCl, pH 7.0의 첨가에 의해 상기 전분으로부터 회수되었다. 상기 과정에서 선택된 단계들로부터의 샘플들이 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 의해 분석되었다. 호스트(host) 단백질들 및 세포 배양 성분들의 대다수가 제1 상등액 내에서 발견되었다. 약 90%의 순수한 IgM이 상기 회수된 부분 내에서 약 70%의 회수로 발견되었다. 상기 실험은 쌀로부터 및 옥수수로부터의 전분으로 반복되었다. 옥수수 및 쌀 전분으로부터 회수된 IgM은 약간 많은 호스트 단백질 오염을 가졌으며, 쌀이 보다 많은 고분자량 응집체들을 가졌다.
실험예 2: IgG의 정제
800㎍/mL IgG 콜론 her2를 함유하는 100mL의 세포 배양 상등액을 교반되게 하였다. 2g의 감자 전분이 상기 용액 내에 분산되었다. 30% PEG-6000 in 50mM 헤페스, 200mM NaCl, pH 7.0 내에 0% PEG-6000가 연동 펌프를 통해 30분의 주기에 대해 15%의 최종 농도까지 첨가되었다. 교반은 상기 상등액의 원심분리 및 제거에 수반하여 추가적으로 30분 동안 계속되었다. 공침된 IgG-전분은 15% PEG 50mM 헤페스, 200mM NaCl, pH 7.0 내에서의 재현탁에 의해 세척되으며, 이후에 원심분리되었고 상기 상등액이 제거되었다. 상기 IgG가 분리되었고, 50mL의 50mM 헤페스, 200mM NaCl, pH 7.0의 첨가에 의해 상기 전분으로부터 회수되었다. 다른 100mL의 상등액이 전분의 부존재에서 동일한 용액들 및 종말점들을 사용하여 PEG에 의해 침전되었다. 회수된 항체의 샘플들은 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 분석되었다. 양 방법들로부터 회수된 IgG은 약 2%의 응집체를 함유하였다. 황산암모늄(ammonium sulfate)과의 비교는 동일한 결과를 산출하였다. 상기 실험은 반복되었고, 감자 전분을 알란토인(allantoin)으로 대체하였다. 알란토인과의 공침으로부터 회수된 IgG는 다른 방법들에 대해 약 10-폴드(fold)의 감소인 약 0.2% 응집체를 함유하였다. 200mM 아르기닌(arginine)으로 상기 알란토인의 후속 처리는 IgG의 높게 응집된 부분을 방출하였다. IgM으로 반복된 실험들은 동일한 경향을 나타내었다. IgM 회수는 20g/L 알란토인으로 75%, 40g/L으로 55%였다. 이들 결과는 알란토인이 우선적으로 보다 큰 분자량의 종들을 유지하는 점을 보여준다. 이들은 또한 알란토인이 그 표면의 산화환원 특성을 약간 감소시킴에 의해 가능하게 이루어지는 응집-억제 효과를 가질 수 있는 점을 제시한다.
실험예 3: 정제 IgM의 정제
1x, 2x, 4x의 IgM 세포 배양 상등액의 세 가지 희석액들이 제조되었다. 4그램의 감자 전분이 100mL의 각각의 용액에 첨가되었고, 10% PEG-6000(50mM 헤페스, 100mM NaCl, pH 7.0의 희석액)으로 공침되었다. 항체 회수는 2개의 보다 낮은 희석액들에서 약 80%였지만, 4-폴드 희석액으로부터는 단지 25%였다.
실험예 4: 바이러스의 정제
일련의 실험들이 박테리오파지(bacteriophage) M13을 함유하는 E. coli 세포 배양 상등액의 샘플에 대해 수행되었다. 실험예 1의 조건들이 4% 및 8% PEG-6000의 PEG 농도에서를 제외하고는 반복되었다. 분적석 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)는 모든 침전물들이 약 90% 순도의 파지를 생성하였던 점을 나타내었다. 회수는 8% PEG로 75%이지만, 4% PEG에서 25% 이하로 평가되었다. 다른 일련의 실험들이 6% PEG에서 30% 및 40% 전분으로 수행되었다. 회수는 30% 전분에서 약 80%였고, 40% 전분에서 적어도 90%였다. 다른 일련의 실험들이 6% PEG, 20% 전분이지만, 400mM, 600mM 및 800mM NaCl에서 수행되었다. 회수는 600mM의 염 농도 및 600mM NaCl 이상에서 적어도 90%까지 추산되었다. 다른 일련의 실험들이 6% PEG, 20% 전분, 600mM NaCl이지만 5, 6, 7, 8 및 9의 pH 값들에서 수행되었다. 회수는 pH 6 및 그 아래에서 적어도 90%까지 추산되었으며, pH의 증가와 함께 감소하였다. 40% 전분, 6% PEG, 600mM NaCl, pH 6.0의 최종 동작 조건들은 90% 순도 및 90% 회수를 산출하였다.
실험예 5
일련의 실험들이 5.5의 등전점(isoelectric point)을 갖는 정제된 IgM 단일 클론 항체(monoclonal antibody)의 결합 특성들이 다른 pH 값들 및 다른 PEG-6000의 농도들에서 평가되도록 수행되었다. 이들 모든 실험들은 4mL/분의 유량에서 334μL OH 모노리스(monolith)로 수행되었다. 결과들은 도 1에 도시된다. 상기 IgM의 100% 결합은 pH 5.0에서 10% PEG 내에서 이루어졌다. 도 1은 9.5의 pH가 100% 결합을 구현하기에 충분할 수도 있었던 점을 보여준다. 100% 결합은 pH 6.0에서의 11% PEG 및 pH 7.0에서의 12% PEG에서 이루어졌다. 이들 결과들은 결합이 종들의 등전점 부근에서 가장 강한 점을 나타낸다. 상기 실험은 9.0 이상의 등전점을 갖는 IgM 및 약 7.0에서 산출된 등전점을 갖는 다른 것으로 반복되었다. 양자의 경우들에 있어서, 가장 강한 결합은 가장 낮은 pH 조건들 하에서 관찰되었다. 이러한 실험예는 IgG처럼, IgM의 용해도가 등전점과 관계없이 낮은 pH에서 가장 낮은 점을 제시한다. 상기 IgM의 등전점도 낮은 pH에 있는 경우들에 있어서, 그래프 내에 도시된 패턴이 관찰될 것이다.
실험예 6
일련의 실험들이 IgM의 결합 특성들 NaCl 농도의 함수로서 IgM의 결합 특성들이 평가되도록 수행되었다. 모든 실험들은 4mL/분의 유량에서 334μL OH 모노리스 상의 PEG-6000으로 수행되었다. 결과들은 도 2에 도시된다. 결합 효율은 염 농도를 증가시킴과 함께 급격히 감소되었고, 보다 높은 염 농도들에서 결합을 이루도록 PEG-6000 농도의 증가를 요구하였다. 실험들은 다른 염의 종들, 예를 들면, 황산암모늄(ammonium sulfate) 및 티오시안산 나트륨(sodium thiocyanate)으로 수행되었다. 티오시안산염은 NaCl과 대체로 동일한 효과를 가졌던 반면, 황산암모늄은 NaCl 보다 결합에 대해 매우 큰 효과를 가졌다. 이들 결과들은 전체적으로 염의 효과가 상기 PEG의 유효 사이즈의 압축하게 되는 점을 제시한다.
실험예 7: PEG 크기의 영향
일련의 실험들이 PEG 사이즈의 함수로서 IgM 결합이 평가되도록 수행되었다. 모든 실험들은 4mL/분의 유량에서 334μL OH 모노리스 상에서 수행되었다. 결과들은 도 3에 도시되며, 보다 큰 PEG들이 보다 낮은 농도들에서 결합이 이루어질 수 있도록 되는 점을 보여준다.
실험예 8: 전분-변성된 자기 나노입자들 상의 제한된 공수화(cohydration)에 의한 단일 클론 IgG 의 정제
IgG-함유 세포 배양 상등액이 전분-변성된 자기 입자들과 결합되었다. 50mM 헤페스, 50mM NaCl, pH 7.0 내에 50% PEG-6000이 15% PEG의 최종 농도까지 30분의 주기에 대해 연동 펌프로 주입되었으며, 이후에 상기 입자들은 자기장 내에서 포획되었고 상기 상등액이 제거되었다. 상기 입자들은 이들을 15% PEG-6000, 50mM 헤페스, 50mM NaCl, pH 7.0 내에 재분산시킴에 의해 세척되었으며, 이후에 상기 자기장 내에서 이들을 다시 수집하였고 상기 상등액을 제거하였다. 상기 입자들은 50mM 헤페스, 50mM NaCl, pH 7.0의 5 입자 부피들 내에 재분산되었고, 상기 입자들은 자기장 내에서 수집되었으며, 상기 IgG를 함유하는 상등액이 회수되었다. 실험예 4는 이러한 과정에 의해 얻어지는 정제의 정도를 예시한다. 회수는 90%에서 평가되었다. 일련의 추가적인 실험들은 90% 회수 및 유사한 정제 성능이 동일한 조성물의 단백질 A 친화 나노입자들 보다 약 30배 큰 용량들에서 얻어질 수 있는 점을 나타내었다. 이들 결과들은 제한된 공수화 크로마토그래피(constrained cohydration chromatography)가 나노입자들의 표면상에 다중 생성물 층들의 축적을 허용하는 반면에 종래의 흡착성 나노입자들은 항체의 단일층의 결합만을 허용하는 점을 나타내는 것으로 해석되었다.
실험예 9: PEG 농도의 영향
일련의 실험들이 생체 분자 사이즈의 상대적인 기여를 평가하도록 다양한 PEG 농도들에서 바이러스(질량 16.7MDa), IgM(질량 960kDa), IgG(mass 160kDa) 및 소 혈청 알부민(BSA)(질량 67kDa)으로 수행되었다. 모든 실험들은 334μL OH 모노리스 상의 PEG-6000으로 수행되었다. 결과들은 도 5에 도시된다. 가장 큰 질량을 갖는 종들이 동등한 결합을 이루도록 보다 높은 PEG 농도들을 요구하는 보다 작은 종들과 가장 낮은 PEG 농도에서 결합되었다. BSA은 15% PEG-6000에서 간신히 결합되기 시작하였다. 이들 결과들은 사이즈 선택의 기술을 강조한다. OH 모노리스를 대신하여 기재로서 불용성 전분 또는 알란토인을 사용하여 수행되었던 병렬 실험들은 고수화된(친수성) 기재가 적용되는 점에 관계없이 동일한 관련성이 계속되었던 점을 보여주었다.
실험예 10: IgM의 유동 결합용량(dynamic binding capacity)
IgM 단일 항체의 유동 결합용량은 UV 흡수의 증가에 의해 나타나는 바와 같이 IgM가 334μL OH 모노리스 칼럼을 통해 흐르기 시작하였을 때까지 12% PEG에서 일정한 농도로 IgM를 공급함에 의해 결정되었다. 이는 39㎎의 IgM이 적재되었던 시점에서 일어났다. 다양한 조건들 하에서 다른 IgM들로의 초기 실험들은 대체로 20㎎/mL을 초과하는 유동 결합용량들을 나타내었다.
실험예 11: 바이러스의 유동 결합용량
박테리오파지 M13의 유동 결합용량은 UV 흡수의 증가에 의해 나타내었던 바와 같이 파지가 334μL OH 모노리스 칼럼을 통해 흐르기 시작하였던 때까지 6% PEG에서 일정한 농도로 파지를 공급함에 의해 결정되었다. 이는 9.9ㅧ1012 바이러스 입자들이 적재되었던 시점에서 일어났다.
실험예 12: 바이러스 감염성의 보존
6% PEG-6000 내의 OH 모노리스 상의 제한된 공수화 크로마토그래피에 의해 정제된 박테리오파지 M13을 상대적 생리 활성을 측정하도록 정제되지 않은 파지와 비교하였다. 정제된 파지의 감염성은 약 95%였다. 이러한 유형의 분석에 고유한 오차율의 상황에 있어서, 이는 대게 바이러스 활성의 완전한 보존을 반영하는 것으로 이해된다.
실험예 13: 바이러스의 결합 효율 및 회수
감염성 및 크로마토그래피에 의한 분석은 전술한 바와 같은 박테리오파지 M13의 제한된 공수화 크로마토그래피가 그대로의 정제되지 않은 공급 흐름으로부터 90% 이상의 결합 효율을 구현하였고 근본적으로 그 모두가 용리(eluate) 내에 회수되었다.
실험예 14
E. coli 호스트 단백질들을 위한 ELISA에 의한 바이러스 분석의 정제 효율은 제한된 공수화 크로마토그래피에 의한 정제가 이러한 단일 정제 단계에서 박테리오파지 M13으로부터 단백질 오염물들의 99.8%를 제거하였던 점을 나타내었다. 속행된 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 의한 후속 정제는 99.99%의 결합된 전체로 호스트 단백질을 감소시켰다. AccuBlue 분석은 DNA의 90% 이상을 제거하였고, 후속되는 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 이를 다른 10 폴드로 감소시켰던 점을 보여준다.
실험예 15: 단일 클론 IgG의 정제
약 2미크론의 평균 채널 사이즈를 갖는 0.34mL 히드록실 모노리스(hydroxyl monolith)를 크로마토그래프에 부착시켰다. 이를 4mL/분의 유량에서 50mM 헤페스, 300mM 염화나트륨, 15% PEG-6000, pH 7.0의 용액으로 평형시켰다. 125mL의 샘플이 이후에 인라인 희석(inline dilution), 20% 샘플, 80% 희석 완충제에 의해 15%의 최종 PEG 농도를 생성하도록 칼럼에 공급되었다. 적재가 완료된 후, 베드(bed)는 결합되지 않은 오염물들을 제거하도록 평형 완충제로 세척되었다. 상기 베드는 이후에 감소하는 PEG 변화(gradient)로 용리되었다. IgG는 상기 변화의 마지막 4분 1에서 용리되었다. 분석적 사이즈 배제 크로마토그래피는 항체가 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의해 정제된 기준(reference) IgG와 유사한 응집 내용물들을 갖는 95% 이상으로 순수하였던 점을 보여준다.
실험예 16: 다른 고수화된 모노리스들과 단일 클론 IgM의 비교
별도의 실험들에 있어서, 히드록시 기들, 양이온 교환 기들((SO3) 및 음이온 교환기들(QA)로 코팅된 0.34mL 모노리스들이 비교되었다. 각각을 4mL/분이 유량에서 50mM 헤페스, 1M 염화나트륨, 12.5% PEG-6000, pH 7.0의 용액으로 평형시켰다. 125mL의 샘플이 이후에 인라인 희석, 20% 샘플, 80% 희석 완충제에 의해 12.5%의 최종 PEG 농도를 생성하도록 칼럼에 공급되었다. 적재가 완료된 후에, 베드는 결합되지 않은 오염물들을 제거하도록 평형 완충제로 세척되었다. 상기 베드는 이후에 감소하는 PEG 변화로 용리되었다. 종말점 완충제(endpoint buffer)도 1M NaCl를 함유하였으므로 염 농도가 상기 실험들 전체에서 조절될 수 있으며, 이에 따라 전하 상호작용들(charge interaction)의 효과들을 제거하였다.
실험예 17: 세포 배양 상등액(클론 A3, 20g/mL IgM, 20% 혈청이 추가됨)으로부터의 단일 클론 IgM의 정제
약 2미크론의 평균 채널 사이즈를 갖는 8mL 히드록실 모노리스가 크로마토그래프에 부착되었다. 이를 75mL/분의 유량에서 50mM 헤페스, 300mM 염화나트륨, 12.5% PEG-6000, pH 7.0의 용액으로 평형시켰다. 1250mL의 IgM-함유 세포 배양 상등액이 이후에 인-라인 희석, 20% 샘플, 80% 희석 완충제에 의해 12.5%의 최종 PEG 농도를 생성하도록 칼럼에 공급되었다. 적재가 완료된 후, 베드는 결합되지 않은 오염물들을 제거하도록 평형 완충제로 세척되었다. 상기 베드는 이후에 감소하는 PEG 변화로 용리되었다. IgM은 상기 변화의 마지막 4분의 1에서 용리되었다. 분석적 사이즈 배제 크로마토그래피는 항체가 63%의 회수와 함께 95% 이상으로 순수하였던 점을 보여준다.
실험예 18: 세포 배양 상등액으로부터 단일 클론 IgM의 정제
약 2미크론의 평균 채널 사이즈를 갖는 8mL 히드록실 모노리스가 크로마토그래프에 부착되었다. 이를 75mL/분의 유량에서 50mM 헤페스, 300mM 염화나트륨, 12.5% PEG-6000, pH 7.0의 용액으로 평형시켰다. 1250mL의 다른 IgM-함유 세포 배양 상등액이 이후에 인-라인 희석, 20% 샘플, 80% 희석 완충제에 의해 12.5%의 최종 PEG 농도를 생성하도록 칼럼에 공급되었다. 적재가 완료된 후, 베드는 결합되지 않은 오염물들을 제거하도록 평형 완충제로 세척되었다. 상기 베드는 이후에 감소하는 PEG 변화와 함께 용리되었다. IgM는 상기 변화의 마지막 4분의 1에서 용리되었다. 분석적 사이즈 배제 크로마토그래피는 항체가 95% 이상으로 순수하였던 점을 보여준다. IgM 부분이 수산화 인회석(hydroxy apatite)(CHT 타입 II, 40미크론)의 10mL 칼럼에 적용되었고 300mM 인산나트륨(sodium phosphate)까지의 선형 변화로 용리되었다. 상기 IgM 부분은 물로 1:1로 희석되었고 75mL/분의 유량으로 50mM 헤페스, pH 7.0 내의 8mL QA 음이온 교환 모노리스 상으로 적재되었으며, 이후에 350mM 헤페스, pH 7.0 내의 300mM 염화나트륨에 대해 10 칼럼 부피 선형 변화로 용리되었다. 분석적 사이즈 배제 크로마토그래피는 3-단계 과정이 검출 가능한 응집체들이나 부분들 없이 99% 이상으로 순수한 IgM을 생성하는 반면에 60%의 전체적인 회수를 지지하는 점을 나타내었다. 이러한 실험예는 완전한 정제 과정을 생성하는 다른 정제 방법들과 본 발명의 통합을 입증한다. 상기 실험은 200mM NaCl에서 반복되었다. 회수 및 순도는 300mM과 비교하여 근본적으로 변화되지 않았다.
실험예 19: 피브리노겐(fibrinogen)의 분별
0.34mL 히드록실 모노리스를 50mM 헤페스, 2.0M 글리신(glycine), 10mM EDTA, pH 7.0으로 평형시켰다. 125mL의 부분적으로 정제된 인간 피브리노겐이 인-라인 희석, 20% 샘플, 80% 희석 완충제에 의해 2.0M의 최종 글리신 농도를 생성하도록 칼럼에 공급되었다. 일부 오염물들이 샘플 적용 동안에 상기 칼럼을 통해 흘렀다. 적재가 완료된 후, 베드는 결합되지 않은 오염물들을 제거하도록 평형 완충제로 세척되었다. 상기 베드는 이후에 감소하는 글리신 변화와 함께 용리되었고, 폭넓은 이종의 피브리노겐 피크를 생성하였다. 동작 압력은 진행 동안에 증가하였지만, 효과는 3M 구아니딘(guanidine)으로 상기 칼럼을 세척함에 의해 반전되었다.
실험예 20: 항혈우병 인자(antihemophiliac factor)(인자 VIII-vWF 복합체)의 정제
0.34mL 히드록실 모노리스를 8% PEG-6000, 50mM 헤페스, 200mM NaCl, pH 7.0으로 평형시켰다. 인간 혈청 알부민(HSA) 내의 항혈우병 인자의 혼합물이 PEG-6000의 동일한 농도에서 적용되었다. HSA는 결합에 실패하였으며 적재 동안에 소거되었다. 칼럼은 평형 완충제로 간단히 세척되었고 상기 항혈우병 인자는 50mM 헤페스, 200mM NaCl, pH 7.0까지 10mL 선형 변화 내에서 용리되었다.
실험예 21: 바이러스 정제
그리고 1mL OH-모노리스를 6% PEG-6000, 50mM 헤페스, 600mM NaCl, pH 7.0로 평형시켰다. 이는 12% PEG-6000, 50mM 헤페스, 600mM NaCl, pH 7.0 내지 50mM 헤페스, 600mM NaCl, pH 7.0의 50:50 혼합물로 평형시킴에 의해 이루어졌다. 100mL의 박테리오파지 M13이 12% PEG 완충제로 인-라인 희석에 의해 적재되었고, 6% PEG 내에 200mL의 바이러스 샘플을 산출하였다. 오염물들의 대다수는 상기 모노리스를 통과하였고 나머지는 평형 완충제로 세척되었다. 칼럼은 이후에 50mM 헤페스, 600mM NaCl, pH 7.0에 대해 10mL 선형 변화로 용리되었다. 분석적 음이온 교환 크로마토그래피는 DNA의 90% 제거와 함께 90% 순수한 바이러스의 90% 회수를 입증하였다. 후속 분석은 바이러스가 감염으로 남아있는 점을 보여주었다. 음이온 교환 모노리스 상의 제2의 정제 단계는 80%의 화합물 회수 및 추가적인 1000-폴드 DNA 감소와 함께 99% 이상의 순도를 구현하였다. 전체 2-단계 과정은 2시간 이내에 완료되었다.
실험예 22: 엑소좀(exosomes)의 우선 배제 크로마토그래피 정제
1mL 히드록실 모노리스를 8mL/분에서 6% PEG 6000, 50mM 헤페스, 200mM NaCl pH 7.0으로 평형시켰다. 중간엽 줄기세포들(mesenchymal stem cells)에 의해 분비된 엑소좀의 프레파라트가 8% PEG 6000, 50mM 헤페스, 200mM NaCl pH 7.0으로 인-라인 희석에 의해 6%의 등가 PEG 6000이 주어지도록 상기 모노리스 상으로 적재되었다. 상기 모노리스는 다음에 6% PEG 6000으로 세척되었고 50mM 헤페스, 200mM NaCl pH 7.0에 대해 8mL 선형 변화로 용리되었다. 엑소좀의 존재는 600㎚에서 흡수를 관찰함에 의해 온-라인으로 검출되었다. 유동 광 산란은 오프라인 검출을 위해 사용되었다. 양자의 검출 방법들은 세포 기관들을 정제하는 방법의 유용성을 강조하는 용리 내의 엑소좀의 존재를 보여주었다.
실험예 23: 히드록실 기공성 미소구체들 상의 단일 클론 IgM의 정제
10mL의 토요퍼얼(Toyopearl) HW75M 입자들이 100mL의 IgG-함유 세포 배양 상등액 내에 분산되었다. 포화된 황산암모늄이 1시간의 과정으로 1.5M의 최종 농도까지 첨가되었다. 상기 입자들은 필터 상에 배치되었으며 액체는 흡입 제거되었다. 상기 입자들은 이후에 칼럼 내에 포장되었고, 12.5% PEG-6000 50mM 헤페스, 300mM NaCl, pH 7.0으로 세척되었으며, 이후에 10 칼럼 부피 강하 PEG 변화로 용리되었다. 응집체들이 응집되지 않은 항체 보다 후에 용리되는 점이 관찰되었다. 분석적 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)는 IgG가 95% 이상으로 순수하게 되는 점을 보여주었다.
실험예 24: 비기공성 실리콘 입자들 상의 단일 클론 IgG의 정제
5mL의 비기공성 실리카 10미크론 미소구체들(microspheres)이 100mL의 IgG-함유 세포 배양 상등액 내에 분산되었다. 포화된 황산암모늄이 30분의 과정에 대해 1.5M의 최종 농도까지 첨가되었다. 상기 입자들은 필터 상에 배치되었고 액체는 흡입 제거되었다. 아직 여과 장치 내의 상기 입자들은 1.5M 황산암모늄으로 세척되었고, 이는 이후에 흡입 제거되었다. 여과액 리셉터클(filtrate receptacle)이 변경되었고, 상기 IgG는 50mM 헤페스, 0.3M 염화나트륨, pH 7.0의 2 베드 부피들의 첨가에 의해 상기 입자들로부터 분리되었고, 이후에 상기 필터를 통해 흡입되었다. 분석적 SEC는 항체가 95% 이상으로 순수한 점을 보여주었다.
실험예 25: 비기공성 실리카 미소구체들 상의 단일 클론 IgG의 2-단계 정제
5mL의 비기공성 실리카 10미크론 미소구체들이 100mL의 IgG-함유 세포 배양 상등액 내에 분산되었다. 50mM 헤페스, pH 7.0 내의 30% PEG-6000이 30분의 과정에 대해 15%의 최종 농도까지 첨가되었다. 상기 입자들은 필터 상에 배치되었고 액체가 흡입 제거되었다. 아직 여과 장치 내의 상기 입자들은 15% PEG, 300mM 염화나트륨, 50mM 헤페스, pH 7.0으로 세척되었고, 이는 이후에 흡입 제거되었다. 여과액 리셉터클은 변경되었고, 상기 IgG는 50mM 헤페스, 0.3M 염화나트륨, pH 7.0의 2 베드 부피들의 첨가에 의해 상기 입자들로부터 분리되었으며, 이후에 상기 필터를 통해 흡입되었다. 분석적 SEC는 항체가 95% 이상으로 순수한 점을 보여주었다. 이러한 물질은 수산화 인회석(CHT 타입 I, 40미크론)의 칼럼 상에서 IgG 부분들 및 응집체들을 제거하도록 분별되었다. 분석적 SEC는 상기 물질이 약 99%의 순도로 응집이 없는 점을 보여주었다.
실험예 26: 히드록실 기공성 마이크로입자들 상의 IgM의 단일 클론 항체의 정제
5mL의 세파덱스(Sephadex) G25 정선(superfine)이 100mL의 IgM-함유 세포 배양 상등액 내에 분산되었다. 포화된 황산암모늄이 15분의 과정에 대해 1.2M의 최종 농도까지 첨가되었다. 현탁액은 0.22미크론 필터 멤브레인에 적용되었고 액체는 흡입 제거되었다. 상기 입자들은 1.2M 황산암모늄 내에 재현탁되었고, 상기 액체는 다시 흡입 제거되었다. 상기 입자들은 12.5% PEG-6000, 100mM 염화나트륨, 50mM 헤페스, pH 7.0 내에 재현탁되었다. 여과액 리셉터클이 변경되었고, 상기 입자들은 50mM 헤페스, 100mM 염화나트륨, pH 7.0으로 재현탁되었으며, 항체-함유 액체는 상기 필터를 통해 흡입되었다. 분석적 SEC는 물질이 95% 이상으로 순수한 점을 보여주었다.
실험예 27: 단일 클론 IgM의 3-단계 정제
10mL의 비기공성 10미크론 실리카 미소구체들이 100mL의 IgM-함유 세포 배양 상등액 내에 분산되었다. 30% PEG-6000, 50mM 헤페스, pH 7.0이 30분의 과정에 대해 10% PEG의 최종 농도까지 첨가되었다. 현탁액은 0.22미크론 필터 멤브레인에 적용되었고 액체는 흡입 제거되었다. 상기 입자들은 10% PEG-6000, 1M NaCl, 50mM 헤페스, pH 7.0 내에 재현탁되었으며, 액체는 흡입 제거되었다. 여과액 리셉터클이 변경되었고, 상기 IgM은 25mL 50mM 헤페스, 1M NaCl, 0.1% 폴리소르베이트(polysorbate)-20의 첨가에 의해 상기 입자들로부터 분리되었으며, 상기 IgM은 상기 필터를 통해 흡입되었다. 상기 IgM은 이후에 수산화 인회석(CHT 타입 II, 40미크론)의 칼럼에 적용되었고 인산염(phosphate) 변화로 용리되었다. 상기 IgM 부분들은 응집체들 및 조각들이 없었다. 수산화 인회석 용리물은 물로 1:1로 희석되었고 50mM 헤페스, pH 7.0로 평형시킨 음이온 교환 모노리스(QA, 8mL)에 적용되었으며, 이후에 300mM 염화나트륨, 50mM 헤페스, pH 7.0에 대해 선형 변화로 용리되었다. 상기 IgM은 99% 이상으로 순수하였고 응집체들이 없었다.
실험예 28: 항혈우병 인자(인자 VIII-vWF 복합체)의 정제
1mL의 10m 비기공성 실리카 미소구체들이 1㎎/mL의 농도에서 인간 재조합 항혈우병 인자의 10mL 용액 및 10㎎/mL에서 인간 혈청 알부민(HSA) 내에 분산되었다. 30% PEG-6000이 50mM 헤페스, 100mM NaCl, pH 7.0 내에 10%의 최종 농도까지 첨가되었다. 현탁액은 0.22㎛ 필터에 적용되었으며 액체는 흡입 제거되었다. 상기 입자들은 10mL 50mM 헤페스, 100mM NaCL, 10% PEG-6000, pH 7.0 내에 재현탁되었고, 액체가 제거되었다. 필터 리셉터클이 변화되었으며 상기 항혈우병 인자는 이들을 50mM 헤페스, 100mM NaCl, pH 7.0 내에 재현탁시킴에 의해 상기 입자들로부터 용리되었다. HSA는 67%가 회수되었던 상기 항혈우병 인자로부터 없었다.
실험예 29: 바이러스 정제
1mL의 10㎛ 비기공성 실리카 미소구체들이 20mL의 박테리오파지 M13 내에 분산되었다. 50mM 헤페스, 600mM NaCl, pH 7.0 내에 12% PEG-6000이 6%의 최종 PEG 농도까지 첨가되었다. 현탁액은 0.22㎛ 필터에 적용되었고 액체가 흡입 제거되었다. 상기 입자들은 10mL의 50mM 헤페스, 600mM NaCl, 6% PEG-6000, pH 7.0 내에 재현탁되었고, 상기 액체가 제거되었다. 필터 리셉터클이 변경되었고 바이러스는 이들을 50mM 헤페스, 50mM NaCl, pH 7.0 내에 재현탁시킴에 의해 상기 입자들로부터 용리되었다. 분석적 음이온 교환 크로마토그래피는 DNA의 90% 제거와 함께 80%의 순수한 바이러스의 30% 회수를 입증하였다. 후속 분석은 상기 바이러스가 감염성으로 잔류하는 점을 보여주었다.
실험예 30: 엑소좀의 정제
10mL의 10㎛ 비기공성 실리카 미소구체들이 100mL의 인간 줄기 세포들에 의해 분비된 엑소좀의 프레파라트(preparation) 내에 분산되었다. 50mM 헤페스, 200mM NaCl, pH 7.0 내에 30% PEG-6000가 6%의 최종 PEG 농도까지 첨가되었다. 현탁액은 0.22㎛ 필터에 투여되었고 액체는 흡입 제거되었다. 상기 입자들은 10mL의 50mM 헤페스, 200mM NaCl, 6% PEG-6000, pH 7.0 내에 재현탁되었고, 상기 액체가 제거되었다. 필터 리셉터클이 변경되었고, 상기 엑소좀이 이들을 50mM 헤페스, 50mM NaCl, pH 7.0 내에 재현탁시킴에 의해 상기 입자들로부터 용리되었다. 차동 광 산란(differential light scattering) 및 다중 파장 모니터링으로 상기 용리 내의 엑소좀의 존재를 확인하였다.
실험예 31: 전분-코팅된 자기 나노입자들을 이용한 IgG의 정제
Her2 세포 배양 상등액의 1mL 샘플들에, 5㎎의 200㎚ 또는 1미크론 자기 나노입자들이 첨가되었다. 50mM 헤페스, 100mM NaCl, pH 7.0 내의 45%(w/v) PEG 6000이 15% PEG 6000의 최종 농도까지 마이크로 원심 튜브에 첨가되었고 손으로 혼합되었다. 현탁액은 자기장의 인가에 의해 정화되었고, 상기 상등액은 마이크로 피펫(pipette)을 이용하여 제거되었다. 결합된 IgG는 비드들을 50mM 헤페스, 100mM NaCl, pH 7.0 내에 현탁하여 상기 입자들로부터 용리되었다. 분석적 SEC는 IgG이 95% 이상으로 순수한 점을 보여주었다.
실험예 32: 바이러스의 모노리스계(monolith-based) CCC 정제
수산화된(OH) 표면 및 평균 2㎛의 채널들을 갖는 폴리메타크릴레이트 모노리스들(polymethacrylate monoliths)이 바이러스의 선택적 유지를 구현하도록 제한된 공수화의 능력을 평가하는 데 사용되었다. 모노리스들 내의 질량 전달은 대류에 의해 일어나고, 이는 기공성 입자들로 포장된 칼럼들을 방해하는 확산성 제한들에 의해 영향을 받지 않는다[Hahn, R., Panzer, M., Hansen, E., Mollerup, J., Jungbauer, A.의 "Monoliths for separation of biomolecules"(Sep. Sci. Technol., 37 1545-1565(2002)); Strancar, A., Podgornik, A., Barut, M., Necina, R.의 "Short monolithic columns as stationary phases for biochromatography"(Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.7649-85(2002)); Jungbauer, A.의 "Chromatographic Media for Bioseparation"(J. Chromatogr. A, 1065 312(2005))]. 나아가, 크로마토그래피 성능은 점도에 의해 영향을 받지 않는다. 모노리스들은 또한 격변하는 전단력들(shear forces)이 입자 칼럼들 내에 주로 발생되는 보이드 공간이 결핍되며[Levy, M.S., O'Kennedy, R.D., Ayazi-Shamlou, P., Dunnill, P.의 "Biochemical engineering approaches to the challenges of producing pure plasmid DNA"(Trends Biotechnol., 18 296-305(2000)); Lendero-Krajnc, N., Smrekar, F., Strancar, A., Podgornik, A.의 "Adsorption behavior of large plasmids on the anion-exchange methacrylate monolithic columns"(J. Chromatogr. A., 1218 2413-2424(2011))], 이들의 큰 채널들은 베드를 가로질러 압력 강하를 감소시킨다. 박테리오파지 M13은 916㎚의 길이, 7.2㎚의 직경 및 약 16.7MDa24의 분자량을 갖는 약한 유연한 로드로서 일어난다. 여과된 E.coli 상등액이 하나의 펌프를 통해 적재되었고 동일한 유량에서 다른 펌프를 통해 전달된 12% PEG-6000으로 인-라인 희석되었다. 6% PEG 혼합 내의 바이러스의 프리-모노리스(pre-monolith) 체류 시간은 바이러스를 상기 모노리스 표면에 접촉시키기 이전에 일어나는 상당한 침전을 위해 불충분한 약 1초로 계산되었다. 유지되지 않은 물질들을 위한 상기 모노리스를 통한 전이 시간은 약 5초였다. 2.5L 샘플로부터의 90% 이상의 바이러스가 신속한 결합 운동과 고농도 인자가 강조되는 0.34mL 모노리스에 의해 유지되었다. 상기 모노리스는 후속하여 6% PEG, 600mM NaCl, 50mM 헤페스, pH 7.0로 세척되었고, 이후에 50mM 헤페스, 600mM NaCl, pH 7.0에 대해 비선형 변화로 용리되었다. 용리 프로파일은 상기 칼럼을 통해 흐르는 거의 모든 오염물들 및 2.5mL 부분 내에 회수된 바이러스와 함께 친화도 크로마토그래피를 연상시킨다(도 6). 유동 결합력은 정제된 파지와 함께 결정된 모노리스의 9.9×1012cfu/mL이었다. 호스트 세포 ELISA는 E.coli 단백질들의 99.8% 감소를 기록하였다. AccuBlue는 DNA의 92% 감소를 기록하였다. CCC-정제된 바이러스의 감염성은 분리 방법 및 조건들의 양성적 영향이 강조되는 정제되지 않은 바이러스와 동등하였다(도 6 참조).
실험예 33: IgM의 모노리스계 CCC 정제
OH 모노리스들도 IgM의 선택적 보유를 구현하는 제한된 공수화 능력을 평가하기 위해 사용되었다. 이러한 클래스의 항체들은 약 1MDa25의 분자량으로 주지되는 바와 같이 불안정하다. 20% 혈청-보충 세포 배양 매체 내에 성장된 단일 클론 IgM은 인-라인으로 1 부분 상등액에서 4 부분 12.5% PEG-6000까지 적재되었고, 10%의 최종 PEG 농도를 산출하였다. 상기 모노리스는 10% PEG, 200mM NaCl, 50mM MES, pH 6.0으로 세척되었고, 이후에 50mM MES, 200mM NaCl, pH 6.0에 대해 선형 변화로 용리되었다. CCC는 초기 항체 농도가 단지 약 20g/mL임에도 불구하고 단일 클론 IgM의 90% 순도 및 70% 회수를 이룰 수 있었다(도 7). 본 발명자들은 이후로 동일한 조건들 하에서 성장된 20 이상의 IgM 클론들로 유사한 CCC 결과들을 구현하였다. 순도는 95%까지 증가하고 회수는 단백질이 없는 세포 배양 매체 내에 성장된 고생산성 클론들과 함께 90%까지 증가한다. 다른 클론들을 위한 유동 결합력들은 20㎎부터 38㎎까지의 IgM/mL 모노리스 범위이다. 압력이 샘플 적재 과정 전체에서 선형적으로 증가하기 때문에 실용 용량(practical capacity)은 가끔 압력 보다는 표면 유용성에 의해 결정된다. 이는 이들의 표면들 상의 단백질의 부착에 의하거나, 도 6에 도시한 바와 같이, 바이러스에 의해 영향을 받는 모노리스들의 채널들의 점진적인 협소화로부터 유래되는 것으로 여겨진다(도 7 참조).
본 발명은 보다 높은 레벨들의 정제를 구현하도록 다른 정제 방법들과 결합될 수 있다. 실시예들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 다른 침전 방법들, 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 고정 금속 친화도 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography) 및 추가적인 혼합 모드 크로마토그래피 방법들과 같은 단백질들이나 바이러스의 정제를 위해 공통적으로 사용되는 다른 방법들을 포함한다. 특정한 항체의 필수적인 정제를 구현하도록 다양한 방법들을 위한 적절한 조건들을 개발하는 점과 이들을 여기서 본 발명에 통합하는 점은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 이해 범위 내에 있게 된다.
여기에 언급된 모든 참고 문헌들은 전체적으로 및 각각의 개별 공보나 특허 또는 특허 출원이 모든 목적들을 위해 전체적으로 참조로 포함되는 것을 구체적으로 및 개별적으로 나타내는 바와 같은 동일한 정도까지 모든 목적들을 위해 참조로 포함된다. 참조로 포함되는 공보들 및 특허들 또는 특허 출원들이 본 명세서에 포함된 개시 사항과 반대되는 정도까지에서 본 명세서가 대체되거나 및/또는 임의의 이러한 반대되는 물질들에 대해 우선하는 것으로 의도된 것이다.
명세서와 특허청구범위에 사용되는 성분들의 양들, 작동 조건들 등을 나타내는 모든 숫자들은 모든 예들에서 "약"이라는 표현에 의해 변경될 수 있는 점이 이해될 것이다. 이에 따라, 반대로 나타내지 않는 한, 명세서와 첨부된 특허청구범위에 기재되는 수치적인 한도들은 본 발명에 의해 수득되는 것으로 여겨지는 원하는 성능에 따라 변화될 수 있는 근사치들이다.
본 발명의 많은 변형들과 변경들이 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 바와 같이 그 범주 및 범위를 벗어나지 않고 이루러질 수 있다. 여기에 기재된 특정한 실시예들은 단지 예로서 제시된 것이며, 어떠한 방식으로도 한정하려는 것은 아니다. 명세서와 실험예들은 다음 특허청구범위에 의해 나타나는 본 발명의 사실상의 범위와 범주 내에서 예시적인 것만으로써 이해된다.

Claims (94)

  1. (a) 수화된 타겟 종과 비용해된 물질 사이의 직접적인 화학적 상호 작용을 억제하는 pH 또는 전도도의 조건에서, 샘플을 상기 비용해된 물질의 수화된 표면과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 타겟 종이 상기 비용해된 물질의 상기 수화된 표면에 유지되도록, 상기 샘플을 2% 내지 50%(w/v) 농도의 제한 제제와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 제한 제제는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는, 샘플 내의 생물학적 기원의 수화된 타겟 종의 정제 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 수화된 타겟 종의 50% 이상이 상기 비용해된 물질의 상기 수화된 표면에 유지되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 수화된 타겟 종의 전부가 상기 비용해된 물질의 상기 수화된 표면에 유지되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 수화된 타겟 종 중 적어도 하나의 개체가 적어도 하나의 제한 제제의 존재에 기인하여 제한된 공수화에 의해 배타적으로 상기 수화된 표면에 유지되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타겟 종은 단백질, 항체, 응고 인자, 세포 기관, 바이러스, 바이러스-유사 입자, 유전자 치료 벡터 또는 세포인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 세포 배양 산물, 세포 배양 상등액, 세포 배양으로부터 유래한 단백질-함유 용액, 세포 배양으로부터 유래한 항체-함유 용액, 세포 배양으로부터 유래한 바이러스-함유 용액, 또는 정제 전 단계로부터의 타겟 종-함유 용액인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 타겟 종은 단백질인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 타겟 종은 응고 인자인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 타겟 종은 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM 클래스의 폴리클로날 혹은 모노클로날 항체, 또는 이들의 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  10. 제 5 항에 있어서, 상기 타겟 종은 원핵 세포, 진핵 세포 또는 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  11. 제 5 항에 있어서, 상기 타겟 종은 바이러스, 지질 외피 바이러스, 단백질 캡시드 바이러스 혹은 바이러스 유사 입자인 것을 특징으로 하는 정제 방법,
  12. 제 5 항에 있어서, 상기 타겟 종은 엑소좀, 리포좀, 미토콘드리아, 엽록체, 리소좀 혹은 다른 세포 기관인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비용해된 물질의 상기 표면은 일 이상의 극성 화학적 잔기를 갖는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 극성 화학적 잔기는 히드록실, 아민, 이민, 우레이드, 카르보하이드레이트, 아미노산, 펩티드, 양이온 하전 그룹 및 음이온 하전 그룹을 포함하는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 극성 화학적 잔기는 글루코스, 만노스, 갈락토스, 락토스, 모노사카라이드, 디사카라이드 및 폴리사카라이드로 구성된 그룹에서 선택되는 카르보하이드레이트인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 극성 화학적 잔기는 우레아, 요산, 알란토인, 히단토인으로 구성된 그룹에서 선택되는 우레이드인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 극성 화학적 전기는 히스티딘, 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민, 리신, 아르기닌 또는 셀레노시스테인인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 100 및 10,000D 사이의 평균 고분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 3,000 및 8,000D 사이의 평균 고분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 5% 및 25%(w/v) 사이의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  26. 제 23 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 2% 및 25%(w/v) 사이의 농도로 제공되며, 약 6,000D 이상의 평균 고분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  27. 제 23 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 15% 및 50%(w/v) 사이의 농도로 제공되며, 약 6,000D 이하의 평균 고분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 약 2% 및 25%(w/v) 사이의 농도로 제공되며, 약 4,000D 및 약 8,000D 사이의 평균 고분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비용해된 물질은 유기 핵형성 중심을 형성하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 유기 핵형성 중심은 카르보하이드레이트, 우레이드 또는 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 우레이드는 알란토인이며, 상기 카르보하이드레이트는 전분 또는 셀룰로스인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 유기 핵형성 중심은 상기 타겟 종의 외측면이 화학적 또는 정전기력의 인력에 의해 결합되거나, 타겟 종의 상기 외측면이 상기 비용해된 물질의 상기 수화된 표면을 제공하는 제한된 공수화에 의해 유지되는 코어를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 유기 핵형성 중심은 오로지 제한된 공수화에 의해 상기 타겟 종의 복수의 층들을 유지하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  34. 제 31 항에 있어서, 상기 샘플은 상기 샘플을 상기 제한 제제와 접촉시키는 단계 이전에 상기 유기 핵형성 중심과 접촉되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 유기 핵형성 중심의 수화된 표면 상에 유지되는 상기 타겟 종을 갖는 상기 유기 핵형성 중심으로부터 오염물을 함유하는 상등액을 분리시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 유기 핵형성 중심을 상기 유기 핵형성 중심으로부터 상기 타겟 종의 분리를 촉진하는 조건에 노출시킴으로써 상기 유기 핵형성 중심으로부터 상기 타겟 종을 회수하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 타겟 종은 상기 제한 제제의 농도를 감소시킴으로써 상기 유기 핵형성 중심으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 유기 핵형성 중심을 상기 제한 제제가 함유되지 않은 용액과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  39. 제 37 항에 있어서, 상기 유기 핵형성 중심의 수화된 표면에 상기 타겟 종을 유지하는 상기 제한 제제의 효율을 감소시키기에 충분하도록 염 농도가 증가되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  40. 제 37 항에 있어서, 상기 유기 핵형성 중심의 수화된 표면에 상기 타겟 종을 제한하는 상기 제한 제제의 능력을 감소시키기에 충분하도록 당 농도가 증가되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 당은 소르비톨, 자일리톨 및 수크로스로 구성된 그룹에서 선택되며, 상기 제한 제제는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  42. 제 37 항에 있어서, 상기 유기 핵형성 중심으로부터 상기 타겟 종을 분리하는 단계 이전에 상기 유기 핵형성 중심을 세척하는 일 이상의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  43. 제 37 항에 있어서, 상기 유기 핵형성 중심으로부터 상기 타겟 종을 분리하는 단계에서 사용되는 용액은 상기 타겟 종의 회수를 위해 사용되는 용액과 동일한 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  44. 삭제
  45. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비용해된 물질은 입자들을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 입자들은 나노입자들, 마이크로입자들인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  47. 제 45 항에 있어서, 상기 입자들은 자성, 상자성 또는 고밀도인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  48. 제 45 항에 있어서, 상기 입자들은 고분자 코팅된 금속-코어 입자들, 셀룰로스 코팅된 금속 코어 입자들, 유리 입자들, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 스티렌디비닐벤젠, 티오필릭 자성 입자들, 셀룰로스 코팅된 텅스텐 카바이드 입자들, 실리카 입자들, 아가로스 입자들, 셀룰로스 입자들 및 복합체(composite) 입자들로 구성된 그룹에서 선택되는 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  49. 제 46 항에 있어서, 상기 입자의 사이즈는 약 100nm 및 약 500㎛ 사이인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 입자의 사이즈는 약 100nm 및 약 50㎛ 사이인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  51. 제 49 항에 있어서, 상기 입자의 사이즈는 약 100nm 및 약 4㎛ 사이인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  52. 제 49 항에 있어서, 상기 입자의 사이즈는 약 100nm 및 약 3㎛ 사이인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  53. 제 49 항에 있어서, 상기 입자의 사이즈는 약 100nm 및 약 1㎛ 사이인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  54. 제 49 항에 있어서, 상기 입자의 사이즈는 약 200nm 및 약 2㎛ 사이인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  55. 제 49 항에 있어서, 상기 입자의 사이즈는 약 200nm 및 약 500nm 사이인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  56. 제 49 항에 있어서, 상기 입자의 사이즈는 약 500nm 및 약 1㎛ 사이인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  57. 제 49 항에 있어서, 상기 입자의 사이즈는 약 5㎛ 및 약 50㎛ 사이인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  58. 제 45 항에 있어서, 샘플을 상기 입자들과 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 상기 제한 제제와 접촉시키는 단계 이전에 일어나는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  59. 제 45 항에 있어서, 액상으로부터 상기 입자들의 수화된 표면과 연관된 상기 타겟 종을 갖는 상기 입자들을 분리하는 단계 및 상기 입자들로부터 상기 타겟 종을 분리시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  60. 제 58 항에 있어서, 상기 입자들의 표면이 하전된 잔기를 포함하는 경우, 칼럼에 전달된 버퍼의 pH, 전도도 및 염 농도가 상기 타겟 종 및 하전된 잔기 사이의 직접적 상호작용을 억제하도록 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  61. 제 58 항에 있어서, 대류성 크로마토그래피 물질 표면이 하전된 잔기들을 포함하는 경우, 칼럼에 전달되는 버퍼의 pH, 전도도 및 염 농도는 상기 샘플을 상기 제한 제제와 접촉시켜 상기 타겟 종의 일부가 제한된 공수화에 의해 배타적으로 상기 수화된 표면에 유지되도록 하는 단계의 적어도 일부 동안 상기 타겟 종 및 상기 하전된 잔기 사이의 직접적인 상호 작용을 억제하도록 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  62. 제 59 항에 있어서, 상기 타겟 종을 분리시키는 단계는 용액으로 상기 입자들을 세척하는 단계를 포함하며, 상기 용액은 (i) 상기 제한 제제를 포함하지 않거나, (ii) 상기 입자들의 상기 수화된 표면에 상기 타겟 종을 유지하기에 불충분한 양으로 상기 제한 제제를 함유하거나, 또는 (iii) 상기 입자들의 상기 수화된 표면으로부터 상기 타겟 종의 분리를 일으키는 제제를 함유하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  63. 제 62 항에 있어서, 제한 제제의 존재 하에 상기 입자들의 상기 수화된 표면으로부터 상기 타겟 종의 분리를 일으키는 상기 제제는 계면활성제, 우레이드, 당, 염, 킬레이트제 또는 카오트로프로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  64. 제 45 항에 있어서, 상기 제한 제제는 상기 샘플 및 상기 입자들에 약 1분 내지 약 5시간; 2분 및 15분 사이; 2분 및 30분 사이; 10분 및 30분 사이; 2분 및 2시간 사이; 또는 2분 및 1시간 사이의 시간 동안 첨가되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  65. 제 45 항에 있어서, 상기 입자들은 혼합물의 액체 성분으로부터 원심분리, 침전, 디캔테이션, 자기장에의 노출 또는 여과에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  66. 제 65 항에 있어서, 분리된 상기 입자들은 상기 제한 제제를 포함하는 용액으로 세척되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  67. 제 59 항에 있어서, 상기 분리 단계는 분리 버퍼를 상기 입자들에 첨가하는 단일 단계로 수행되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  68. 제 59 항에 있어서. 상기 타겟 종을 분리시키는 단계는 상기 제한 제제 농도의 감소를 통해 점증적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  69. 제 45 항에 있어서, 상기 방법은 상기 타겟 종을 다른 물질들로부터 분류하는 방법 이전 또는 이후에 수행되며, 상기 분류 방법은 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 단백질 A 크로마토그래피. 단백질 G 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피, 침전 법, 폴리에틸렌 글리콜 침전, 옥탄산 침전, 원심분리 및 초원심분리로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  70. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비용해된 물질은 대류성 크로마토그래피 물질인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  71. 제 70 항에 있어서, 상기 대류성 크로마토그래피 물질은 모노리스, 멤브레인 및 비기공성 입자들로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  72. 제 71 항에 있어서, 상기 대류성 크로마토그래피 물질은 칼럼 내에 충전된 비기공성 실리카 입자들을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  73. 제 71 항에 있어서, 상기 대류성 크로마토그래피 물질은 모노리스인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  74. 제 73 항에 있어서, 상기 모노리스는 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 스티렌디비닐벤젠 및 실리카로 구성된 그룹에서 선택된 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  75. 제 73 항에 있어서, 상기 모노리스는 1미크론 및 200미크론 사이의 평균 채널 사이즈를 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  76. 제 75 항에 있어서, 상기 채널 사이즈는 1미크론 및 5미크론 사이인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  77. 제 75 항에 있어서, 상기 채널 사이즈는 10미크론 및 20미크론 사이인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  78. 제 75 항에 있어서, 상기 채널 사이즈는 50미크론 및 200미크론 사이인 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  79. 제 73 항에 있어서, 상기 모노리스는 고분자로 코팅된 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  80. 제 73 항에 있어서, 상기 모노리스는 표면의 수화 용량을 증가시키도록 화학적으로 변성된 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  81. 제 70 항에 있어서, 상기 대류성 크로마토그래피 물질 표면은 히드록실화, 글리코실화 혹은 폴리히드록실화된 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  82. 제 70 항에 있어서, 상기 대류성 크로마토그래피 물질 표면이 하전된 잔기를 포함하는 경우, 칼럼에 전달되는 버퍼의 pH, 전도도 및 염 농도는 상기 타겟 종 및 상기 하전된 잔기 사이의 직접적 상호작용을 억제시키도록 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  83. 제 70 항에 있어서, 상기 대류성 크로마토그래피 물질 표면이 하전된 잔기를 포함하는 경우, 칼럼에 전달되는 버퍼의 pH, 전도도 및 염 농도는 상기 샘플을 상기 제한 제제와 접촉시켜 상기 타겟 종의 일부가 제한된 공수화에 의해 배타적으로 상기 수화된 표면에 유지되도록 하는 단계의 적어도 일부 동안 상기 타겟 종 및 상기 하전된 잔기 사이의 직접적인 상호 작용을 억제하도록 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  84. 제 70 항에 있어서, 상기 샘플을 상기 대류성 크로마토그래피 물질의 수화된 표면과 접촉시키는 단계는 제한 제제의 존재 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  85. 제 70 항에 있어서, 상기 샘플을 상기 대류성 크로마토그래피 물질의 수화된 표면 상에 접촉시키는 단계는 하나의 입구 라인을 통해 상기 샘플을 적용시키는 단계, 또 다른 라인을 통해 농축된 제한 제제를 동시에 적용시키는 단계, 혼합물의 프리-칼럼 체류 시간이 상기 대류성 크로마토그래피 물질을 막는 충분한 침전물을 형성하거나 상기 방법을 방해하기에는 부족하도록 상기 대류성 크로마토그래피 물질의 직전에 위치한 믹서에서 두 유체 스트림을 혼합하는 단계에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  86. 제 84 항에 있어서, 상기 샘플은 상기 샘플의 상기 대류성 크로마토그래피 물질로의 전달 전에 적어도 하나의 제한 제제를 함유하는 버퍼와 결합되며, 상기 대류성 크로마토그래피 물질은 상기 타겟 샘플의 전달 전에 상기 제한 제제와 평형을 이루는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  87. 제 84 항에 있어서, 수화된 상기 대류성 크로마토그래피 물질을 상기 비용해된 물질의 수화된 표면에 유지되지 못한 오염물들을 제거하기에 충분한 양의 상기 제한 제제를 포함하는 용액으로 세척하는 단계, 및 이어서 상기 대류성 크로마토그래피 물질로부터 상기 타겟 종을 분리시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  88. 제 87 항에 있어서, 상기 타겟 종을 분리시키는 단계는 상기 대류성 크로마토그래피 물질을 용액으로 세척하는 단계를 포함하며, 상기 용액은 (i) 상기 제한 제제를 포함하지 않거나, (ii) 상기 대류성 크로마토그래피 물질의 수화된 표면에 상기 타겟 종을 유지하기에 불충분한 양으로 상기 제한 제제를 함유하거나, 또는 (iii) 상기 대류성 크로마토그래피 물질의 상기 수화된 표면으로부터 상기 타겟 종의 분리를 일으키는 제제를 함유하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  89. 제 70 항에 있어서, 상기 방법은 상기 타겟 종을 다른 물질들로부터 분류하는 방법 이전 또는 이후에 수행되며, 상기 분류 방법은 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 단백질 A 크로마토그래피. 단백질 G 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피, 침전 법, 폴리에틸렌 글리콜 침전, 옥탄산 침전, 원심분리 및 초원심분리로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  90. 제 88 항에 있어서, 제한 제제의 존재 하에 상기 대류성 크로마토그래피 물질의 상기 수화된 표면으로부터 상기 타겟 종의 분리를 일으키는 상기 제제는 계면활성제, 우레이드, 당, 염, 킬레이트제 또는 카오트로프로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  91. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비용해된 물질은 제1 조건 세트에서는 상기 타겟 종과 결합할 수 있으며, 제2 조건 세트에서는 상기 타겟 종과 결합하지 않는 화학적 또는 관능적 잔기들을 보유하며, 상기 방법은 상기 제2 조건 세트 하에서 상기 제한 제제의 존재 하에 상기 비용해된 물질의 상기 수화된 표면에 상기 타겟 종을 유지시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  92. 제 91 항에 있어서, 상기 제1 조건 세트 및 상기 제2 조건 세트는 상기 제2 조건 세트 하에서의 상기 제한 제제의 존재에 의해서만 차이가 있는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  93. 제 91 항에 있어서, 상기 제2 조건 세트 하에서 상기 비용해된 물질의 상기 수화된 표면에 상기 타겟 종을 유지시키는 단계 전에 상기 타겟 종이 상기 비용해된 물질에 결합된 상태에서 상기 제1 조건 세트 하에서 상기 샘플을 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
  94. 제 93 항에 있어서, 상기 제1 및 상기 제2 조건 세트들은 pH, 전도도 및 염 농도 중 적어도 하나에서 차이가 있는 것을 특징으로 하는 정제 방법.
KR1020137032610A 2011-06-08 2012-06-01 제한된 공수화 크로마토그래피를 통한 생물학적 산물의 정제 KR101901830B1 (ko)

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