CN103717284B - 通过约束共水合色谱纯化生物制品 - Google Patents

Abstract

使用约束共水合剂纯化诸如抗体、病毒、细胞或细胞器的生物材料的材料和方法，其与对流色谱、流化床或共沉淀应用有关。

Description

通过约束共水合色谱纯化生物制品

本申请要求2011年6月8日提交的美国临时申请61/494,669、2011年6月8日提交的美国临时申请61/494,687、2011年11月14日提交的新加坡专利申请第201108397-9号和2012年5月21日提交的美国临时申请61/653,950的优先权，它们各自通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及改善生物制品纯化方法。其具体涉及改善病毒纯化和抗体纯化方法。

发明背景

色谱法通常依赖于开发携带至少一种化学性能的固体表面，以活性地参与和生物分子的相互作用，从而根据该化学性能把复合样品的组分分类。这些方法被称为吸附色谱法。吸附方法以及释放结合的组分的化学手段之间的表面化学不同，但操作模式相同。一个实例是生物亲和色谱，其中使用生物配体取代惰性表面，所述生物配体对来自复合样品的目标组分具有特异性。目标组分结合而其他组分不结合，随后通过改变化学条件释放目标组分。离子交换色谱是更多样化的方法的代表。惰性表面被带电化学基团共价取代。对于阴离子交换色谱，化学基团带正电。具有足够负电荷的样品组分结合，带最多负电荷的组分结合得最坚固。缺乏足够负电荷的样品组分未能结合。通过使用渐增梯度的盐，结合的组分按其结合强度的顺序释放，渐增梯度的盐对电相互作用逐渐增加破坏度，按照结合的组分与阴离子交换剂相互作用的强度顺序释放它们。除了化学差异，同样的操作模式被应用于阳离子交换色谱、疏水作用色谱、反相色谱以及所谓的混合模式色谱的多种实例，包括羟基磷灰石。

依赖于化学性能的吸附法的例外为尺寸排阻色谱(SEC)，也被称为凝胶过滤和凝胶渗透色谱。在这类应用中，分子与介质表面的化学相互作用实际上为零。SEC通过样品组分向柱中填充的颗粒的孔中差异扩散工作。特别大的组分被排阻在孔外并仅穿过颗粒之间的空间。(任选地)中等尺寸的分子扩散进较大的孔中。这使得它们进入比被排阻的分子更大的液相体积，被排阻的分子仅进入颗粒之间的空间。(任选地)小分子可以扩散进所有的孔中，这使得它们进入更大的液相体积。用于平衡指定尺寸的分子类型的液相体积越大，将它们从柱中移走所需的液相体积越大。因此，大分子首先从SEC柱洗脱，然后按递减尺寸的分子的顺序。

在生物领域内沉淀法是公知的，包括用于纯化蛋白和病毒。两种最常用的方法，即所谓的盐沉淀和PEG沉淀，利用被称为优先排斥(preferentialexclusion)的力。这个词在20世纪80年代初开始被广泛应用，并从此成为了公认的术语，用于描述溶解的分子(溶质)与蛋白质的相互作用[1-5]。优先排斥的溶质与蛋白质以这样一种方式相互作用，其让蛋白质由一层水包围，而在优先排斥的溶质中缺乏水。这种溶质缺乏区被称为优先水合区域，或者优先水合层或鞘。当优先水合的蛋白质在溶液中彼此相遇时，它们的优先水合鞘合并。排斥的溶质浓度越高，两个蛋白质保持结合越强烈。所谓的亲液盐(kosmotropicsalt)，如硫酸铵、柠檬酸钠和磷酸钾被蛋白质表面强烈排斥。也已知非离子型有机聚合物如聚乙二醇(PEG)被蛋白质表面强烈排斥[3-5]。这些沉淀方法是通过将大量的优先排斥剂溶解于含有待沉淀的物质种类(species)的样品中进行的。由于优先排斥剂朝着阈值水平上升，其导致随机彼此接触的目标物(targetspecies)通过共享它们各自的优先水合鞘的水保持结合。这导致形成大的不溶性聚集体，其最终沉淀，之后可以通过离心或过滤来回收它们。然而，沉淀法强加了不希望的限制，这主要是其纯化性能被认为普遍不如色谱方法，以及还在批次之间具有高度变异性，特别是结合待沉淀产物的浓度变化时。回收同样是可变的，并且当目标产物以低浓度存在时，回收可能极其低。已知这些问题来自于沉淀方法对高度异质表面(即待沉淀蛋白质)的相互作用的依赖性。商业应用仍然存在，但大部分已被色谱法替换，因为后者通常提供更好的回收和更高的纯度。然而人们仍然对沉淀法保持着兴趣，因为它们可能提供了比色谱法更高的生产率，材料更便宜，并且设备更易于操作。

优先排斥的力已经被用来提高蛋白质和吸附性色谱介质表面之间存在的相互作用。众所周知，盐提高疏水作用色谱(HIC)中的结合。这是这类技术中实现结合的标准方法。它们也被用于提高某些亲和方法的结合，例如蛋白A亲和色谱(6)。据20世纪70年代的报道，硫酸铵引起蛋白质与非官能化多孔颗粒色谱支持物(support)结合(7)，但没有继续，可能是由于样品制备方法和柱应用的限制。向样品中直接加入过量的硫酸铵产生了堵塞色谱柱的沉淀。加入非沉淀量的盐预计支持低容量，如参考文献7中显然经历的。

优先排斥的力也已用于以非离子聚合物如PEG来提高吸附性色谱方法的结合。不同于盐，其对HIC不起作用，因为PEG的固有疏水性直接干扰了结合机制。PEG可用于沉淀HIC柱内的蛋白质，并且所述蛋白质可随后再溶解，但这不是吸附性色谱且其缺乏实用性：容量和分辨率过于有限[6]。PEG已被用于增强与亲和色谱法[6]，离子交换色谱[8]和羟基磷灰石色谱[9]的结合，并且已知其干扰在SEC中实现的分离[10]。在所有这些情况下，其延缓了特别大的分子如聚集体的洗脱，这有时有助于它们的分离[9]，但其用途受限于其高粘度。高粘度是所有多孔颗粒色谱法的特殊问题，因为多孔颗粒色谱法依赖于扩散以将蛋白质运输至孔、运输进孔、或从孔中运输出。扩散系数与粘度成正比，所以柱性能随PEG浓度成正比地下降。粘度也增加了发生在色谱柱中颗粒之间空间的剪切力。在某些情况下这些限制被容忍，因为已经证明，与小分子相比，PEG更强烈地影响大分子的结合，从而提高了羟基磷灰石改善分级分离抗体聚集体与非聚集抗体的能力[7,8]。由于这两种倾向随PEG浓度成正比增加，PEG没有被更广泛地应用并不奇怪。

流化颗粒床提供了在填充床中进行色谱法的备选方案。在流化床中，颗粒全面分散于含有目标分子的样品。结合目标分子后，浓缩颗粒，使得未结合的污染物可被洗掉，并因此以高浓度洗脱结合的产物。可以通过多种方法实现颗粒的浓缩。比水密度大的颗粒可被沉淀。铁芯的颗粒可以在磁场中浓缩。还可以在过滤膜上浓缩颗粒。颗粒尺寸可以在小于100nm至大于100μm之间变化。用于扩展床色谱的颗粒表面通常用与预期目标分子强烈相互作用的化学基团进行官能化。例如，许多出版物报道将蛋白A固定在流化颗粒上以捕获和纯化IgG。其他出版物描述了用带电荷基团、疏水基团、金属亲和基团、以及利用多化学作用的基团的官能化。这些多样的官能化允许流化床形式提供相同的化学选择性范围，其通过在固化床色谱法中进行相同的官能化来提供。

流化床的重要性在于它们提供物理操作特性，以克服填充床的一个最严重限制：生产率低。常规多孔颗粒柱需要慢流速，这强加了过多的总过程时间间隔。当色谱介质昂贵到足以迫使用户在减小体积的柱运行多个周期时，这些时间间隔增加，因为足以在单个周期内运行过程的色谱材料的价格令人望而却步。然而，对于满足从粗制生物样品得到初始产物的需求的任何方法，也要求其能够在接近生理pH值和盐浓度下实现良好的结合能力。对于此应用，已经评价了所有已知的色谱法，但迄今为止只有生物亲和色谱满足这一要求。所有其他方法需要大量修改条件和/或由于细胞培养物上清液组分而导致失效。

参考文献：

(1)Arakawa,T.andTimasheff,S.N.(1982).Preferentialinteractionsofproteinswithsaltsinconcentratedsolutions.Biochemistry21,6545-6552

(2)Arakawa,T.andTimasheff,S.N.(1984).Mechanismofproteinsaltinginandsaltingoutbydivalentcationsalts:balancebetweenhydrationandsaltbinding.Biochemistry23,5912-5923.

(3)Arakawa,T.andTimasheff,S.N.(1983).Preferentialinteractionsofproteinswithsolventcomponentsinaqueousaminoacidsolutions.Arch.Biochem.Biophys.224,169-177.

(4)Arakawa,T.andTimasheff,S.N.(1985).Mechanismofpoly(ethyleneglycol)interactionwithproteins.Biochemistry24,6756-6762.

(5)Bhat,R.,Timasheff,S.,Stericexclusionistheprincipalsourceofpreferentialhydrationofproteinsinthepresenceofpolyethyleneglycols.Prot.Sci.,1,113-1143(1992).

(6)P.Gagnon,(1996)PurificationToolsforMonoclonalAntibodies,ValidatedBiosystems,Tucson.

(7)vonderHaar,F.,(1976)Purificationofproteinsbyfractionalinterfacialsaltingoutonunsubstitutedagarosegels.Biochem.Biophys.Res.Comm.,70(3)1009-1013.

(8)P.Gagnon,B.Godfrey,D.Ladd,(1996)Methodforobtaininguniqueselectivitiesinion-exchangechromatographybyadditionoforganicpolymerstothemobilephase,J.Chromatogr.A74351-55

(9)P.Gagnon(2008)Improvedantibodyaggregateremovalbyhydroxyapatitechromatographyinthepresenceofpolyethyleneglycol,J.Immunol.Met.336222-228

(10)T.Arakawa(1985)Themechanismofincreasedelutionvolumeofproteinsbypolyethyleneglycol,Analyt.Biochem.,144267-268.

发明概述

提供了适用于执行本发明的方法、组合物和试剂盒。在某些实施方案中，本发明提供了用于纯化样品中生物来源的目标物的方法，其包括以下步骤：(i)使所述样品与不溶材料的水合表面接触，和(ii)使所述样品和不溶材料与优先排斥剂接触，所述优先排斥剂的量足以使得至少一部分的当前优先水合的目标物保留在所述不溶材料的当前优先水合的表面。这种形式的结合在本文也被称为约束水合，优先排斥剂有时被称为约束剂，为了简洁，优先水合的分子和表面被简称为“水合的”。在某些这类实施方案中，多于50%的水合目标物通过约束剂被保留在不溶材料的水合表面上，在一些实施方案中，基本上所有的目标物被保留。在某些这类实施方案中，水合目标物的至少一个个体仅通过约束剂的存在所引起的约束共水合而被保留在水合表面上。在某些这类实施方案中，在这类条件下，基本上所有的目标物仅通过约束剂的存在所引起的约束共水合被保留在水合表面上。在某些这类实施方案中，通过约束剂的存在所引起的约束共水合而仅将水合目标物保留在水合表面上可以通过以下证明：通过移除约束剂或降低约束剂的浓度可以终止这类保留。

在本发明的某些实施方案中，提供了方法和相关组合物以及试剂盒，用于在三方系统分离、沉淀法、流化床法或对流色谱法的环境下执行本发明。

附图说明

图1显示了实施例5中所描述的对于优先排斥剂PEG-6000的不同百分比(8%、9%、10%、11%和12%)，通过约束共水合而保留在水合整料的表面上的IgM百分比与pH值之间的关系。

图2显示了实施例6中所描述的对于优先排斥剂PEG-6000的不同百分比(8%、9%、10%)，通过约束共水合而保留在水合整料的表面上的IgM百分比与NaCl浓度之间的关系。

图3显示了实施例7中所描述的通过约束共水合而保留在水合整料的表面上的IgM百分比与优先排斥剂、不同分子量的PEG(6000、4000、和2000)的百分比之间的关系。

图4显示了实施例8中所描述的在PEG-6000的存在下用于纯化IgG的具有有机成核中心的约束共水合的效率。

图5显示了实施例9中所描述的对于三种目标物(噬菌体M13、IgM和IgG)，通过约束共水合而保留在水合整料的表面上的目标物百分比与优先排斥剂PEG6000百分比之间的关系。

图6显示了实施例32中所描述的单克隆IgM的约束共水合对流色谱的表现，包括优先剂PEG-6000对于污染物和目标IgM的洗脱时间的影响。

图7A和7B显示实施例33中所描述的单克隆IgM的约束共水合对流色谱的表现。

发明详述

提供了适用于执行本发明的方法、组合物和试剂盒。在某些实施方案中，本发明提供了用于纯化样品中生物来源的目标物的方法，其包括以下步骤：(i)使所述样品与不溶材料的水合表面接触，和(ii)是使所述样品和不溶材料与优先排斥剂接触，所述优先排斥剂的量足以使得至少一部分当前优先水合的目标物保留在所述不溶材料的当前优先水合的表面。在某些这类实施方案中，多于50%的水合目标物通过约束剂被保留在不溶材料的水合表面上，在一些实施方案中，基本上所有的目标物被保留。在某些这类实施方案中，水合目标物的至少一个个体仅通过约束剂的存在所引起的约束共水合被保留在水合表面上。在某些这类实施方案中，在这类条件下，基本上所有的目标物仅通过约束剂的存在所引起的约束共水合而被保留在水合表面上。在某些这类实施方案中，通过约束剂的存在所引起的约束共水合而仅将水合目标物保留在水合表面上可以通过以下证明：通过移除约束剂或降低约束剂的浓度可以终止这类保留。

在某些实施方案中，目标物是蛋白质、抗体、凝血因子、细胞器、病毒、病毒样颗粒、基因治疗载体或细胞。在某些这类实施方案中，样品是细胞培养物收集物、细胞培养物上清液、来自细胞培养物的含蛋白质的溶液、来自细胞培养物的含抗体的溶液、来自细胞培养物的含病毒的溶液，或来自纯化前期的包含目标物的溶液。在某些这类实施方案中，目标物是蛋白质。在其他实施方案中，目标物是IgA、IgD、IgE、IgE或IgM类型的多克隆或单克隆抗体，或其片段。在其他实施方案中，目标物是原核细胞、真核细胞、干细胞。在其他实施方案中，目标物是病毒、脂质包膜病毒、蛋白质衣壳病毒或病毒样颗粒。在其他实施方案中，目标物是外来体、脂质体、线粒体、叶绿体、溶酶体或其他细胞器。在其他实施方案中，目标物是凝血因子。通过上文指定的目标物所暗示，本发明提供用于纯化在自然界中大规模的目标物的具体应用。

在某些实施方案中，不溶材料的表面具有一个或多个极性的化学部分。在某些实施方案中，极性的化学部分可以是羟基、多羟基、胺、亚胺、酰脲、碳水化合物、氨基酸、肽、阳离子带电基团或阴离子带电基团。在某些这类实施方案中，极性的化学部分是选自葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、单糖、二糖和多糖中的碳水化合物。在其他实施方案中，极性的化学部分为选自尿素、尿酸、尿囊素、乙内酰脲中的酰脲。在其他实施方案中，极性的化学部分是组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸或硒代半胱氨酸。在某些实施方案中，所述表面可以包含这些基团的组合。

在某些实施方案中，约束剂是盐、多糖、非离子有机聚合物、无机聚合物、亲液盐(kosmotropicsalt)、具有多个正电荷和负电荷的两性聚合物或氨基酸中的一种或多种。在某些这类实施方案中，约束剂是硫酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾、磷酸钾和氯化钠。在某些这类实施方案中，约束剂是水溶性不带电的直链或支链的非离子有机聚合物。约束剂可以是聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、淀粉、纤维素。在某些情况下，约束剂是聚乙二醇，并且PEG可以具有100至10,000D的平均聚合物重量。在某些实施方案中，PEG的平均聚合物重量为600至8,000D，或为约200、300、400、600、1,000、1,500、1,540、4,000、6,000、或20,000中的任意一个。在某些实施方案中，以约5％至约25％(w/v)的浓度提供聚乙二醇。在某些这类实施方案中，PEG的浓度为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，或两个这些值之间的范围。

在某些实施方案中，不溶材料是有机成核中心的集合。在某些实施方案中，有机成核中心由过饱和浓度的天然存在的无毒有机化合物构成，其不溶残余物处于具有水合表面的纳米颗粒和/或微颗粒的形式。在某些这类实施方案中，有机成核中心可以包括碳水化合物、酰脲或肽，或更复杂的组合物。在某些这类实施方案中，在约束剂的存在下具有水合表面的有机成核中心可保留一层或更多层目标物。在某些实施方案中，有机成核中心的表面可以含有结合单层目标物的反应性元件，所述单层目标物在约束剂的存在下变成水合表面，在水合表面上部通过约束共水合保留另外多层的目标物。用天然存在的有机成核中心执行本发明的特别优势在于，它们比合成颗粒相对廉价，并且它们通常是可生物降解的，从而降低了加工成本和环境影响。

在某些实施方案中，在将所述样品与所述约束剂接触的步骤之前，将所述样品与所述有机成核中心接触。在某些这类实施方案中，该方法还包括以下步骤：将含有污染物的上清液从有机成核中心分离，所述有机成核中心具有保留在其表面上的目标物。

在某些实施方案中，本发明还提供了以下步骤：通过将所述有机成核中心暴露于促进目标物从有机成核中心解离的条件下，以从有机成核中心解离所述目标物，并从所述有机成核中心回收再溶解的目标物。在某些这类实施方案中，通过充分地降低约束剂的浓度从所述有机成核中心解离所述目标物。在某些这类实施方案中，盐的浓度增大到足以减少约束剂的有效性，从而将所述目标物保留在所述有机成核中心的水合表面。在某些这类实施方案中，糖的浓度增大到足以减少约束剂的有效性，从而将所述目标物保留在所述有机成核中心的水合表面。在某些实施方案中，在从有机成核中心解离目标物之前，所述方法还包括一个或多个洗涤有机成核中心的步骤。在某些这类实施方案中，所述洗涤溶液包含足够浓度的一种或多种约束剂，从而保持目标物保留在有机成核中心的水合表面上。在某些这类实施方案中，在从所述有机成核中心解离所述目标物的步骤中使用的溶液与用于回收目标物的溶液是基本相同的。

在某些实施方案中，本发明提供了包含有机成核中心和约束剂的试剂盒，其配置用于方便执行本发明的方法。

在某些实施方案中，不溶材料包含合成颗粒。在某些实施方案中，这类颗粒是纳米颗粒或微颗粒。在某些实施方案中，颗粒是磁性的、顺磁性的或高密度的。在某些实施方案中，颗粒是具有聚合物涂层的金属芯颗粒、具有纤维素涂层的金属芯颗粒、玻璃颗粒、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯二乙烯基苯、亲硫的磁性颗粒、纤维素涂覆的碳化钨颗粒、二氧化硅颗粒、琼脂糖颗粒、纤维素颗粒或复合颗粒。在某些实施方案中，颗粒尺寸为约100nm至约500μm；或约10nm至500nm；或约100nm至约50μm；或约100nm至约4μm；或约100nm至约3μm；或约100nm至约1μm；或约200nm至约2μm；或约200nm至约500nm；或约500nm至约1μm；或约5μm至约50μm。

在某些实施方案中，将靶样品与颗粒接触的步骤发生在将样品与约束剂接触的步骤之前。在某些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(i)从液相中分离具有与其水合表面结合的目标物的颗粒，和(ii)从所述颗粒解离目标物。在某些这类实施方案中，解离所述目标物的步骤包括用溶液洗涤所述颗粒，其中所述溶液：(i)不包含所述约束剂，(ii)包含所述约束剂，所述约束剂的量足以将所述目标物保留在所述颗粒的水合表面，(iii)包含引起所述目标物从所述颗粒的水合表面解离的试剂，(iv)(i)和(iii)的组合，或(iv)(ii)和(iii)的组合。

在某些实施方案中，如果所述颗粒的表面包括许多或较强的反应性化学部分，则选择输送到柱的缓冲液的pH值、盐浓度和其他要素(component)以在所述方法的至少第一步骤期间阻止目标物与所述化学反应性部分之间的直接相互作用，从而仅通过由约束剂的作用介导的约束共水合使目标物保持被保留。在某些这类实施方案中，阻止目标物与颗粒表面上的化学反应性部分之间相互作用的试剂选自：螯合剂、表面活性剂、盐、离液剂(chaotrope)、pH值调节剂、或试剂与条件的组合。在某些这类实施方案中，从颗粒解离目标物的步骤还可以包括螯合剂、表面活性剂、盐、离液剂、pH调节剂、或试剂与条件的组合，从而改善目标物从所述颗粒的回收。

在某些实施方案中，如果所述颗粒的表面包括较少或较弱的反应性化学部分，则选择输送到柱的缓冲液的pH值、盐浓度和其他要素以减弱或阻止目标物与所述化学反应性部分之间的直接相互作用，特别是在解离步骤期间，从而增加目标物的回收。在某些这类实施方案中，减弱或阻止目标物与颗粒表面上的化学反应性部分之间相互作用的试剂选自：螯合剂、表面活性剂、盐、离液剂、pH值调节剂、或试剂与条件的组合。

在某些实施方案中，在约1分钟至约5小时、2分钟至15分钟、2分钟至30分钟、10分钟至30分钟、2分钟至2小时或约2分钟至2小时的时间段内，将所述约束剂加入到所述样品和颗粒中。在某些实施方案中，通过离心、沉淀、倾滤、使混合物接受磁场或通过过滤，从混合物的液体组分中分离所述颗粒。在某些实施方案中，用包含约束剂的溶液洗涤分离的颗粒。

在某些实施方案中，解离步骤以将解离缓冲液加入到所述颗粒中的单独步骤进行。在其他实施方案中，解离目标物的步骤是通过降低所述约束剂的浓度来递增进行的。

在某些实施方案中，所述方法在执行用于从其他材料分级分离所述目标物的方法之前或之后执行，并且所述用于分级分离的方法选自：高效液相色谱、亲和色谱、蛋白A色谱、蛋白G色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、固定化金属亲和色谱、沉淀法、聚乙二醇沉淀、辛酸沉淀、离心和超速离心。

在某些实施方案中，不溶材料是固化床对流色谱材料。在某些这类实施方案中，对流色谱材料选自：整料、膜和用无孔的颗粒填充的柱。在某些这类实施方案中，对流色谱材料是无孔二氧化硅颗粒。在某些实施方案中，对流色谱材料是整料。在某些实施方案中，整料是由聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯二乙烯基苯和二氧化硅制成。在某些这类实施方案中，整料具有约1μm至200μm的平均通道尺寸。在某些实施方案中，通道尺寸为约1μm至2μm；约10μm至20μm；或约20μm至200μm。在某些实施方案中，所述整料涂有聚合物。在某些实施方案中，所述整料被化学修饰以增加表面水合度。在某些实施方案中，对流色谱材料表面是羟基化的。

在某些实施方案中，如果对流色谱材料表面包括带电荷部分，则选择输送到柱的缓冲液的pH值和盐的浓度，以在所述方法的至少一个步骤期间阻止所述目标物与所述带电荷部分之间的静电结合，在所述至少一个步骤期间所述目标物仅通过约束共水合被保留。

在某些实施方案中，在约束剂的存在下进行将所述样品与所述对流色谱材料的水合表面接触的步骤。在某些这类实施方案中，首先用含有足以保留目标物的约束剂浓度的溶液平衡所述对流色谱材料。在某些这类实施方案中，通过这样的方式施加样品：将样品与浓缩的约束剂溶液混合，紧接着将混合物与对流色谱材料接触，从而最小化或阻止样品组分在与对流色谱材料接触之前沉淀。在某些这类实施方案中，这是通过以下步骤实现的：通过一个泵装载样品，通过另一个泵装载浓缩约束剂，使系统垂直使得它们在即将接触对流色谱材料之前在混合器中相遇，并配比两个泵的流速以输送实现将目标物保留在对流色谱材料的水合表面上所需浓度的约束剂。该样品应用方法在下文被称为管道内稀释。在某些这类实施方案中，所述方法还提供以下步骤：用包含足够浓度的优先排斥剂的溶液洗涤水合的对流色谱材料，从而维持目标物的保留而冲洗掉未保留的污染物。在某些这类实施方案中，对流色谱材料可以与溶液接触，以从所述对流色谱材料解离目标物。在某些实施方案中，解离所述目标物的步骤包括用溶液洗涤所述对流色谱材料，其中所述溶液：(i)不包含所述约束剂，(ii)包含所述约束剂，所述约束剂的量足以将所述目标物保留在所述对流色谱材料的优先水合的表面，(iii)包含引起所述目标物从所述对流色谱材料的优先水合的表面解离的试剂，(iv)(i)和(iii)的组合，或(iv)(ii)和(iii)的组合。

在某些实施方案中，引起所述目标物从所述对流色谱材料的水合表面解离的试剂选自：表面活性剂、离液剂、盐、糖或氨基酸。

在某些实施方案中，本发明的方法在执行用于从其他材料分级分离所述目标物的方法之前或之后进行，并且所述用于分级分离的方法选自：高效液相色谱、亲和色谱、蛋白A色谱、蛋白G色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、固定化金属亲和色谱、沉淀法、聚乙二醇沉淀、辛酸沉淀、离心和超速离心。

在某些实施方案中，所述不溶材料具有在第一组条件下可与目标物结合，而在第二组条件下不与目标物结合的化学反应性能部分，并且其中所述方法包括在除了与上述第二组条件相同的条件之外还存在优先排斥剂的情况下，将目标物保留在不溶材料的水合表面上的步骤。在某些这类实施方案中，在所述第二组条件下将所述目标物保留在所述不溶材料的水合表面上的步骤之前，所述方法还包括在第一组条件下洗涤所述样品的步骤且同时所述目标物结合到不溶材料上。在某些这类实施方案中，所述第一组条件和第二组条件的pH值、导电率以及盐浓度中至少一项有差异。

在某些实施方案中，可以用非对流色谱材料如填充在色谱柱中的多孔颗粒执行本发明。在某些这类实施方案中，多孔颗粒应用的功效可以被扩展或改善超过缺乏多孔颗粒的本发明所可能达到的功效，但一般而言，性能将会逊色于通过对流色谱介质执行的本发明或本发明的其他形式。

在某些实施方案中，本发明可以用于所谓的负色谱应用，其中没有通过约束共水合来保留目标物而是保留了污染物，并因此与目标物分离。在使用有机成核中心和合成颗粒的某些这类实施方案中，可以理解，目标物将留在上清液中，而待除去的污染物将被颗粒保留。在使用固化床色谱介质(包括对流材料或多孔颗粒柱)的某些这类实施方案中，可以理解，目标物将流过色谱床，而待除去的污染物将被保留。除了术语“负色谱”，这类应用有时被称为“流过法”。

已经令人惊奇地发现，相比传统的两相沉淀系统，使用3-相系统产生了更短的孵育时间、更好的纯度、更好的回收以及更好的再现性，所述3-相系统是通过在加入约束剂之前将过量的固体有机成核中心分散至生物制剂中来制备。逐渐加入所述约束剂是本方法的一个要求，无论所述约束剂是盐还是非离子型有机聚合物。这表明，约束剂导致目标物与有机成核中心形成稳定的结合，而不是目标物彼此之间的结合。由于有机成核中心的水合化学表面比蛋白质和其它沉淀目标物的高度异质性表面的性质更均匀，这使得分配系数应该可以更明确地限定，从而导致更精细的分离，例如，更高的纯度。由于过量提供成核中心，其也使得大规模的作用应该更有效并且在更短的孵育时间支持更高的回收。尽管样品的组成发生变化，均匀性和过量的组合与较好的重现性一致。因此，在某些实施方案中，该方法克服了传统的两相沉淀系统中最不希望的限制。在目标物与有机成核中心共沉淀之后，可以通过离心或过滤除去上清液。然后可以通过将其暴露于缺乏约束剂的溶液中，以从有机成核中心回收目标物。随后可以通过离心或过滤除去仍然不溶的有机成核中心。

已经令人惊奇地发现，在某些实施方案中，将约束剂与分散在生物液体中的水合合成颗粒接触促进了大的蛋白质和其他大型生物制品选择性结合在颗粒的表面上，并且，随后通过降低约束剂的浓度可以意外地高纯度回收该生物制品。在某些实施方案中，不要求在颗粒表面上强烈的产品相互作用性化学官能度：既不是亲和配体、正电荷、负电荷、疏水性配体，也不是它们的任意组合。结合和洗脱可以发生在宽范围的pH值和电导率条件下，使该方法特别适用于从粗制细胞培养物上清液捕获产物。在某些实施方案中，本方法需要将颗粒分散在包含所关注的目标物的生物样品中，逐渐加入约束剂直到足以使颗粒与目标物之间产生稳定结合的浓度，然后从携带污染物的液体中分离颗粒。可以通过将颗粒重悬浮在含有足够浓度约束剂的干净缓冲液中，以保持目标物结合到颗粒上，来应用一个或多个洗涤步骤。这具有稀释可能已被截留在颗粒中或颗粒之间的携带杂质的液体的作用。通过将颗粒暴露于具有浓度降低的约束剂溶液中来从颗粒最终解离产物。实验结果表明，某些这类实施方案中的方法支持与生物亲和方法如IgG抗体的蛋白A亲和纯化非常类似的产品纯度，并且还克服了沉淀方法典型的可变纯度和回收率。实验数据进一步表明，更好性能的原因来自于，特别过量的均匀水合表面作为系统中的优先共水合伴侣起作用。也许该方法最令人惊讶的和显著的特点例证如下：淀粉改性磁性纳米颗粒支持90％以上的纯度和90%的回收率，容量比相同架构的蛋白A亲和纳米颗粒高30倍。这些结果表明，相比仅依赖于反应性表面化学基团的颗粒(仅可积累单层的目标物)，本发明的颗粒能够积累多层所选择的目标物。

还已经令人惊奇地发现，约束剂，尤其包括非离子型有机聚合物，可以用在某些实施方案中，以在生物产品与对流色谱介质的水合表面之间不存在显著化学吸引的情况下，实现将生物制品保留在对流色谱介质的水合表面上。在某些实施方案中，通过以下步骤实现高容量的样品装载：通过色谱仪上的一个泵线路装载样品，同时通过第二泵线路装载高浓度的优先排斥剂，以及在紧邻对流色谱支持物之前混合两股液流。这将混合物的柱前停留时间限制在短的时间间隔，以至于不会发生其程度足以干扰过程的沉淀。因而尽管优先排斥溶质的粘度高，可以实现高容量和高分辨率，并且可以在比多孔颗粒柱所实现的流速高10倍以上的流速维持它们。这具有使色谱支持物之前样品沉淀最小化的综合有利效果，因为样品的柱前停留时间与流速成反比。这使得能够使用较高浓度的优先排斥剂，这有利于较高的结合容量。目标产物结合到色谱支持物上之后，可以用清洁的缓冲液冲洗床以洗掉未结合的污染物。应当理解，在某些实施方案中，洗涤缓冲液将包含足够浓度的约束剂以保持目标产物与该表面的结合。此步骤之后是解离和回收目标产物。这可以通过降低用来实现保留的约束剂浓度来实现。在整料和膜上实行所述方法的另一个有价值的区别在于，无论被纯化产品的尺寸如何，维持了高容量和高分辨率的分级分离，所以本发明对于病毒颗粒和对于蛋白一样有效。多孔颗粒介质对于大的生物制品产生特别差的表现。另一种有价值的区别在于，本发明比其他方法在化学上更温和，这是因为约束剂的稳定结构能力以及整料内颗粒间缺乏剪切力。另一种有价值的区别是，用非离子有机聚合物实施本发明阻止非特异性疏水相互作用，非特异性疏水相互作用可以导致小的疏水污染物污染色谱表面，如大量存在于细胞培养物上清液的污染物。优异的总结果是，机制、方法和材料的该独特组合建立了运作良好的系统，以提供替代现有吸附色谱法的极具竞争力的方法，提供了所有其他方法难以实现的优异结果。另外，本发明的某些实施方案的分级分离机制与现有方法互补，以形成对于工艺开发者和制造商可用的工具组有价值的新补充。

定义和术语

定义和解释了术语使得可以更容易地理解本发明。其他定义在详述中陈述。

“氨基酸”是指天然或合成来源的一类有机分子，其含有排列方式包括氨基、羧基和侧链的碳、氢、氧和氮。适合作为有机成核中心的实例青睐溶解度低的物质种类。这类试剂的有效浓度随氨基酸的特性和由本发明所处理的生物产品的特性而变化。小肽也可以通过延长而被用作有机成核中心。氨基酸的实例包括但不限于，甘氨酸，其在高达约2.5M的浓度可溶。

“聚集体”是指两个或更多个分子相结合(association)，其在生理条件下稳定，并可能在宽范围的pH值和电导率条件下保持稳定。聚集体通常包含至少一种生物分子如蛋白、核酸或脂类，以及其他分子或金属离子。结合可以通过任意类型或任意化学相互作用的组合发生。例如，抗体的聚集体可以分为两类：“同型聚集体”是指两个或更多个抗体分子的稳定结合；“异型聚集体”是指一个或多个抗体分子与一个或多个非抗体分子的稳定结合。非抗体组分可以由选自以下的一种或多种物质组成：核酸、内毒素、金属离子、蛋白、脂类或细胞培养基组分。

“抗体”是指免疫球蛋白、复合物或其片段。该术语可以包括但不限于，IgA，IgD，IgE，IgG和IgMl类型的多克隆或单克隆抗体，其来自于人或其他哺乳动物细胞系，包括天然或基因修饰形式如人源化的、人的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的、移植的和体外产生的抗体。“抗体”还可以包括复合物形式，包括但不限于，包含免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗体”还可以包括抗体片段如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、Dab、Fc和其他成分，无论他们是否保持抗原结合功能。“抗体”还可以包括化合物重组构建体，包括所谓的融合蛋白，其中抗体的Fc部分重组地融合至非抗体蛋白。“抗体”还可以包括合成的构建体，包括所谓的酶偶联物，其中酶或其他蛋白被化学地偶联至抗体。

“碳水化合物”是指以通式C_m(H₂O)_n包含碳、氢和氧的天然或合成来源的一类有机分子。构成适用于执行本发明的某些实施方案的有机成核中心的物质种类包括但不限于，纤维素、淀粉和低溶解度糖。

“色谱支持物”是指固化色谱床，其可用于实施色谱。色谱支持物可以包括整料、膜或用多孔或无孔颗粒填充的柱。

关于本申请的某些实施方案所使用的“约束剂”(有时“优先排斥剂”、“沉淀剂”、“优先排斥溶质”或“约束共水合剂”)是指通过本文称为约束共水合的机制，导致生物目标物保留在水合表面上的试剂。在广义的文献中，一些这类试剂通常被称为优先排斥溶剂和沉淀剂。优先排斥物质可以包括但不限于，所谓的亲液盐、非离子型或两性有机聚合物、一些多糖和氨基酸。一组实例包括但不限于，所谓的沉淀盐如硫酸铵、柠檬酸钠和磷酸钾等。另一组包括非离子型有机聚合物如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和聚乙烯吡咯烷酮等。PEG具有结构式HO-(CH₂-CH₂-O)_n-H。实例包括但不限于，具有小于100至大于10,000道尔顿的平均聚合物分子量的组合物，但更常用为3,000至8,000道尔顿。另一组包括氨基酸如甘氨酸。不希望被任何特定理论限制，据信优先排斥是指这样的条件：其中溶剂以高至约4nm的距离紧贴围绕蛋白，在这个距离缺乏特定的约束剂。所以这一区域被称为优先水合的。当优先水合的表面相互作用时，它们共享一些水并将一些水还回整个溶剂。由于当约束剂保持存在时，它们不能再获得那些水，它们被约束以继续共享它们各自优先水合的水。这一条件被称为约束共水合。

“内毒素”是指存在于革兰氏阴性菌外膜中的毒性热稳定脂多糖物质，当细胞溶解时它们从细胞释放。

“外泌体”是指与干细胞相关的细胞器类型。

“因子VIII”(因子8)是凝固蛋白。

“纤维蛋白原”是凝固蛋白。

“水合(的)表面”或“高度水合的表面”或“亲水(的)表面”是指与水强烈相互作用的表面，可能通过氢键、电致伸缩或这两种机制的一些组合。这类相互作用可以通过化学基团介导，例如羟基、负电荷或正电荷、或不带电的极性基团。可水合的化学基团的存在可以是给定材料如颗粒或对流色谱材料的天然组合物的基本特征，或可通过添加或增强的化学修饰将可水合的化学基团固定在表面上，包括但不限于，碳水化合物和酰脲。所谓的疏水表面通常被认为是不高度水合的，但是尽管如此，包含强烈可水合的基团和疏水残基的表面可以被充分地水合以实施本发明。

“亲液盐”可以包括多种盐中的任意一种，包括但不限于，硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾和氯化钠。这类盐的有效浓度随盐的特性和由本发明所处理的生物产品的特性而变化。

“非离子型有机聚合物”是指由重复连接的缺乏带电基团的有机亚基组成的天然存在的或合成的碳氢化合物。其可以是直链的，以直链为主并具有一些支链的，或以支链为主的。适用于实施本发明的实例包括但不限于，葡聚糖、淀粉、纤维素、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。PEG具有结构式HO-(CH₂-CH₂-O)_n-H。实例包括但不限于，具有小于100至大于10,000道尔顿的平均聚合物分子量的组合物。商业PEG制剂的平均分子量通常以连字符后缀指示。例如，PEG-6000是指具有约6,000道尔顿平均分子量的制剂。这类试剂的有效浓度随试剂的特性和由本发明所处理的生物产品的特性而变化。

“有机成核中心”是指简单或复杂的非合成有机分子种类，其以，或至少部分地以，纳米颗粒和/或微颗粒形式的不溶固体存在。亚术语“成核中心”来源于晶体学领域，描述被材料围绕以在其表面生长的“种子”。由于大多数有机分子显示一定程度的水溶性，通过使用大于饱和溶液所需量的量满足不溶固体的需要。以过饱和量起作用的有机成核中心的非限制性实例包括高度极性的物质种类如碳水化合物、酰脲、氨基酸及其可能的组合。淀粉和纤维素是碳水化合物有机成核中心的实例。尿酸和尿囊素是酰脲有机成核中心的实例。

“有机溶剂”是指以液体状态存在的天然存在或合成的有机化合物。适用于实施本发明的实例包括但不限于，乙二醇、丙二醇、二甲亚砜、乙醇和苯氧乙醇。

“优先排斥”描述了这样的相互作用：通过这样的相互作用，与整个溶液中某些溶解物质的浓度相比，在紧贴围绕亲水(水合的)表面的区域缺乏相同的物质。优先排斥的溶质具体地包括所谓的沉淀盐、非离子型聚合物和氨基酸。

“合成颗粒”尺寸可以为小于100nm至大于100μm。它们可以是多孔的或无孔的。它们可以是聚合的，由例如聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、琼脂糖、纤维素、葡聚糖或其他聚合物组成，或者它们可以是无机的如二氧化硅。它们可以是整体均一结构，或它们可以是由以下组成的复合物：一种诸如金属合金或疏水聚合物的材料的内核，涂有高度水合的或允许附加化学基团的涂覆表面以产生高度水合的表面。“合成的颗粒”可以包括设计用于色谱应用的科技，或预期用于与色谱领域完全不同应用的颗粒。

“多核苷酸”是指由多个核苷酸单体共价连接成链组成的生物聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的实例。

“蛋白质”是指含有碳、氢、氧、氮且经常含硫的一类复杂有机大分子中的任意一种，其主要由通过肽键连接的一个或多个氨基酸链组成。蛋白质可以是天然来源或重组来源的。可以用非氨基酸部分修饰蛋白质，例如糖基化、PEG化或与其他化学部分偶联。蛋白质的实例包括但不限于抗体、凝固因子、酶和肽激素。

“干细胞”是指以其分化成任意类型组织的能力而闻名的一类细胞。

“过饱和淀粉”是指其处于具体蛋白制剂的主要条件下包含超过淀粉最大溶解度的量的淀粉溶液。在某些实施方案中，本发明提供了在样品的条件下，在所述样品中具有超过淀粉溶解度的量的淀粉样品，使得一部分所述淀粉以不溶解的形式存在于样品中，例如，10%淀粉，或20%淀粉，或更多或更少的量，取决于具体应用的要求。

“过饱和酰脲”是指其处于具体蛋白制剂的主要条件下包含超过酰脲最大溶解度的量的酰脲溶液。在某些实施方案中，本发明提供了在样品的条件下，在所述样品中具有超过酰脲溶解度的量的酰脲样品，使得一部分所述酰脲以不溶解的形式存在于样品中。

“表面活性剂(surfactant)”包括“表面活性剂(surfaceactiveagents)”，例如通常包含疏水部分和亲水部分，使得它们被称为两性的一类有机分子。在水溶液中足够浓度时，表面活性剂可以自我结合形成簇，疏水部分在中心聚集以最小化与水的接触，而亲水部分放射性向外以最大化与水的接触。在生物制剂的存在下，特别是在包含具有疏水性质或具有疏水性质区域的材料的那些生物制剂存在下，表面活性剂的疏水部分倾向于自发地与疏水材料的一些部分结合，并通过表面活性剂亲水部分的影响增加疏水材料的溶解度。它们也可以用于调节在同样溶解于水性溶剂中的不同疏水性材料之间发生的疏水性相互作用。适合于实施本发明某些实施方案的表面活性剂实例包括但不限于，非离子型表面活性剂如聚山梨酯表面活性剂(例如吐温20、聚氧乙烯(20)单月桂酸脱水山梨糖醇酯和吐温80，聚氧乙烯(20)单油酸脱水山梨糖醇酯)和Triton(例如，聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)，以及两性离子表面活性剂如CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐)、CHAPSO(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐)以及辛基葡糖苷(例如，(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(羟甲基)-6-辛氧基噁烷-3,4,5-三醇)。

“三方系统”或“3-相体系”是指用来沉淀目标物的系统，其主要由含有目标物的水性制剂、有机成核中心和优先排斥沉淀剂组成。一个实例是包含单克隆抗体、淀粉和PEG的细胞培养物上清液。

“两相系统”是指与本发明某些实施方案的3-相系统不同并用于沉淀目标物的系统，其主要由包含目标物的水性制剂和优先排斥沉淀剂组成。一个实例是包含单克隆抗体和硫酸铵的细胞培养物上清液。

“酰脲”是指天然或合成来源的环状或无环有机分子，其包含一个或多个脲部分或其衍生物。在某些实施方案中，本发明提供了酰脲如尿素、尿酸、乙内酰脲、尿囊素(allantoin)(CAS号97-59-6;尿囊素氯羟铝、尿囊素铝、尿囊素(hemocane)、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙醛基酰脲、乙醛酸二酰脲、2,5-二氧代基-4-咪唑烷基脲)、嘌呤和它们的衍生物。在某些实施方案中，本发明提供了通式R-CO-NH-CO-NH₂或R-CO-NH-CO-NH-CO-R'或R'R''NH-CO-NR'''R''''的有机分子，其中相关的“R基团”可以是H或任意有机部分。

“病毒”或“病毒子”是指超显微的(直径约20至300nm)新陈代谢迟钝的感染性试剂，其仅在活宿主(主要是细菌、植物和动物)的细胞内复制，由以下组成：RNA或DNA核心、蛋白衣壳以及(在更复杂的类型中)外包膜。实例包括但不限于dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒、(+)ssRNA病毒、(-)ssRNA病毒、ssRNA-RT病毒和dsDNA-RT病毒；腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、细小病毒、呼肠孤病毒、微小核糖核酸病毒、披膜病毒、正粘病毒、棒状病毒、逆转录病毒、肝DNA病毒、乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒和细菌噬菌体。术语病毒应理解为包括用作基因治疗载体、用作疫苗和作为抗生素替代品的病毒颗粒。其还应被理解为包括所谓拟病毒子，其可以被描述为已被重组修饰以保留其产生保护性免疫的能力而消除其引起感染的能力的病毒颗粒。

“血管性假血友病因子”是凝固蛋白。其与因子VIII结合，形成分子量为约200万道尔顿的所谓抗血友病因子。

实施某些实施方案的材料和方法的详述

用作有机成核中心的有效材料可以由以至少部分地不溶的量存在于制剂中的天然有机化合物组成。实例包括但不限于高极性的物质，如碳水化合物，包括但不限于：纤维素、淀粉和糖；酰脲，包括但不限于尿囊素和尿酸；和氨基酸，包括但不限于组氨酸。通常优选材料在水中不膨胀，或虽然材料膨胀，如纤维素，但产生有效的结果。通过使用单个约束剂将简化执行该方法，但两个或多个的组合可以有效地使用。一般而言，待沉淀的物质种类对于有机成核中心的固有亲和力应该是零，因为强的亲和力可能导致在消除沉淀剂后目标物的回收率较差。虽然弱亲和力可以提高由该方法实现的纯度，在减弱或延迟亲和因子的物质存在下执行回收步骤，可以最小化回收率损失。使用酰脲在抗体制剂中产生了减少聚集体的惊人效果，明显是由于它们对于较大物质种类和较小物质种类的不同亲和性。这代表本方法与传统方法的显著区别，传统方法倾向于优先富集聚集体。

有机成核中心的物理形式可以是颗粒、纤维或支链纤维。可以使用任意粒度的颗粒。越细的粒度转化为越高的每干克表面面积，这预期对应更高的每克共沉淀容量，并促成使用较少量的成核中心。较粗粒度可预期得到相反的趋势，但在通过过滤而不是离心分离促进除去上清液在某些情况下可能是有利的。对于使用颗粒材料的应用，优选无孔材料或具有太小孔隙而不允许目标物进入的材料，因为这将避免由于一部分目标物不能退出孔的潜在损失。

有机成核中心的数量应该是足以共沉淀所有的目标物的量。这可以很容易地通过实验来确定。有机成核中心的典型量范围可以为5％至20％，但该方法可以使用更低和更高的量来实施而不降低其有效性。一般而言，当预计样品材料批次之间变化时，使用适度大于实验确定的最小量的量是明智的。所谓的适度较大的量可以包括大10%，或大50%，或两倍于最小量，取决于样品组合物变化的水平。更大的量可能导致目标物不可接受的损失。

约束剂可以是通常用于沉淀蛋白或病毒的任意优先排斥溶剂，包括但不限于，尤其是硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠或磷酸钾；或PEG、PPG、PVP或葡聚糖等。如果仅使用一种约束剂时本方法通常更简单，但可以使用两种或更多种的组合有效地实施本方法。一般而言，所选择约束剂的有效水平与用于本发明以外沉淀所利用的水平相似，但细致实验通常揭示必要量更低。尽管如此，可以有效地使用较高水平，并且可以具有降低有机成核中心的必要量的效果，只要较高量的约束剂不导致纯化指数不可接受的降低。

所述约束剂可以作为液态浓缩物添加，以增加它在整个液体的分散效率。可以手动进行添加，或者通过使用泵自动方便地添加。或者约束剂可以作为粉末添加。这提供了降低最终处理体积的优势，但增加了添加必须发生的时间段，因为必须容许时间以允许约束剂溶解。作为总的出发点，作为液体浓缩液添加约束剂可以在30分钟内完成，而添加干粉可以在60分钟内完成。后续试验将揭示对于任何给定应用的具体限制。

本发明惊人的重要特征是，非离子聚合物约束剂经常比沉淀盐产生更好的结果。使用沉淀盐导致小分子污染物的共沉淀，包括pH指示剂染料和其他疏水性物质。使用非离子型聚合物约束剂避免了这一点，这可能是因为诸如PEG的非离子型聚合物的疏水性和强氢键潜力提高了这些污染物的溶解度，并阻止它们与有机成核中心的非特异性相互作用。

本方法可以用于粗产物的捕获、中间纯化或精制；例如，本方法可以在其他纯化方法之前或之后使用，只要顺序对纯化的总需求最有用。其他纯化方法可包括其他沉淀方法，但更可能是色谱方法，可能包含但不限于亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、所谓的混合模式色谱法。

抗体和病毒颗粒代表了本方法可应用于的两种公知类型的目标物，但对于可以通过传统的2-相体系有效地沉淀的任何目标物，它可以用来实现相同的好处。

尽管本方法将被最频繁地用于从不纯的混合物共沉淀目标制品，它也可以被应用于从制剂中共沉淀特定污染物而目标制品保持可溶。

考虑到一般而言，有机成核中心的均匀性将允许比用传统的2-相系统可以获得的分辨程度显著更高的分辨程度。换而言之，本发明将可能允许目标制品与通过2-相系统不能有效分离的污染物有效地分离。

尽管在通过优先排斥剂来驱动沉淀的系统中包含有机成核中心是最有益的，预期其将用其他沉淀剂如有机溶剂来提供显著的改善。

本发明的其它目的和优点将被部分地在下面的描述中陈述，并且将部分地从描述中显而易见，或者可以通过本发明的实践来获知。通过权利要求书中所指明的元件和组合的方式，可以实现并获得本发明的目的和优点。

应理解，无论是以上概述还是以下的详述都只是示例性和解释性的，而并非是对所要求保护的本发明的限制。

本技术利用尺寸范围为小于100nm至大于100μm的不溶性但水合的有机成核中心。这些成核中心特别地包括天然有机材料，以区别于设计或预定用于实施色谱的合成颗粒。水合是由极性表面残基与水相互作用所赋予的。这样的颗粒结合蛋白或其他目标制品。有机成核中心大的总累积表面积有利于蛋白质-表面相互作用的频率高于蛋白质-蛋白质相互作用。随后添加的非离子型有机聚合物如聚乙二醇(PEG)或其它所谓排斥溶质(约束剂)导致过量的水从相互作用的蛋白和表面转移到整体溶剂，其结果是蛋白被截留在表面上。未捕获的污染物被冲走。该结合保持稳定，直到通过除去排斥溶质而以目前纯化的状态除去PEG。

水合表面的高可用性有利于快速动力学(秒-分钟)，这在用排斥溶质沉淀(30分钟到数小时)中是非常有利的。

与由蛋白质-蛋白质表面相互作用引起的常规广义的沉淀和再增溶作用等温线相比，水合表面的均匀性有利于狭义的吸附及解离等温线。这转化为更高的分辨率，例如较高的纯化指数。

相比传统沉淀方法，使用有机成核中心提高了分级分离速度和分辨率，其使用排斥溶质，如非离子型有机聚合物如聚乙二醇，以及沉淀的盐如硫酸铵等。

适合于实施本发明的约束剂尤其包括非离子有机聚合物,例如分子量一般为600到6,000道尔顿的聚乙二醇(PEG)，但也可以为较低和较高的分子量。可以有效地使用其它非离子有机聚合物，例如但不限于聚丙烯乙二醇、葡聚糖等。适用于实施本发明的其它优先排斥剂可以包括选自硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠或柠檬酸钾、磷酸钾等的亲液盐；以及氨基酸如甘氨酸。实验数据表明，不同优先排斥剂赋予不同的选择性。因此，可能值得比较用排除盐相对于非离子型有机聚合物或氨基酸实现的结果，但一般而言用非离子性有机聚合物获得最好的结果，特别是当生物样品是粗制组合物如细胞培养物上清液时。使用优先排斥盐和这样的样品通常遭遇高度着色的疏水性物质在色谱载体上的堆积，其可导致操作压力的失控增加。使用非离子性有机聚合物作为优先排斥剂通常可以防止这样的问题，明显是因为该聚合物固有的疏水性。虽然可以用不同类别的优先排斥剂如盐与非离子有机聚合物的组合实施本发明，由于一些组合产生自发相分离还需小心。非离子型有机聚合物的另一个有价值的好处是它们的化学温和。高浓度的PEG具有稳定蛋白质的长期声誉，它们可以被活细胞良好耐受，许多FDA批准的人-可注射治疗制剂使用PEG作为非活性成分。

适用于实施本发明的色谱载体尤其包括具有高度水合表面的介质。许多对于吸附色谱未官能化的基于聚合物的介质具有密布羟基基团的表面，所述羟基与水强烈相互作用使得表面高度水合。已用高度水合的材料官能化的表面也是理想的，可能包括固定的糖、淀粉、其他碳水化合物和酰脲。带正电荷和负电荷的基团也往往是高度水合的，并可以用来在高盐条件下实施本发明，其中生物样品组分与载体之间的电荷相互作用被有效地阻止。具有一些疏水特性的表面可以是合适的，如果它们具有足以支配表面的整体极性特征，这将排除用于进行疏水相互作用色谱的大多数表面。虽然基于颗粒的色谱载体可以有足够的效率用来展示对原理的证明，该方法所起的作用如此边缘化，阻止了它的实际应用。在高流速时有用的容量和分级分离能力只有在用对流色谱载体如整料和膜时实现。整料一般比膜支持更高的容量和分辨率，而膜一般比整料支持更高的流速。可通过简单的实验来确定最适合特定应用的需要的方法。

可用本发明有效地纯化的生物制品包括：蛋白质包括抗体和凝血因子；病毒颗粒；细胞器如核糖体、线粒体和外泌体等。

可以通过添加干扰优先排斥剂维持目标制品结合的能力的试剂来实现对结合到载体上的生物制品的洗脱。这样的试剂包括优先表面活性剂、尿素、中性盐、多糖和离液盐如硫氰酸钠或硫氰酸钾、高氯酸钠或高氯酸钾和胍；或这些药剂可以与降低优先排斥剂的浓度一起使用，但在大多数情况下，减少优先排斥剂的简单方法将是优选的。

虽然色谱表面与目标制品之间除了共享水合的水之外其他化学相互作用被理解为是零，该方法的选择性和效率受pH值和电导率的显著影响。这与预期一致，因为pH值会影响制品的表面电荷，这会反过来影响其水合程度。电导率的影响目前尚不完全清楚，但是从实际的角度来看，包含显著浓度的氯化钠经常具有降低工作压力的常规效果，并允许向柱加载更高的容量。这点值得注意，因为它与离子交换色谱和疏水相互作用色谱的行为相反，从而突出了该方法的独特选择性。一般而言，选择性主要是目标制品尺寸的函数，保留的强度与制品的尺寸成正比例增加。这与蛋白质水合和尺寸成正比这一事实一致。实际的结果是，为实现结合所需的优先排斥剂浓度与制品尺寸成反比。在低至5％的PEG-6000浓度实现良好的病毒结合，而IgM抗体需要其两倍的浓度，且IgG抗体需要再高5％。

使用非离子有机聚合物的额外好处是，它提供与可能用于在使用本发明之后增加纯度的其他色谱法的直接兼容性。PEG是非离子的，从而避免干扰基于非疏水性配体的色谱法。实验结果已经证实，通过本方法纯化的抗体和病毒颗粒可以直接施加到阴离子交换和羟基磷灰石柱，在这两种情况下无需对样品进行中间平衡。这突出了这一点，即可以与一种或多种其他的方法一起实施本发明，通常包括其它的色谱法、沉淀法和液-液分配法。本领域普通技术人员能够开发对于这些方法的合适条件，并将它们与本发明整合以实现特定生物制品所需的纯化。

为准备将包含目标物的样品与高度水合的色谱表面接触，在某些实施方案中需要平衡色谱载体内的化学环境。这可以通过使平衡缓冲液流过柱以建立相应的条件来实现，特别是包括优先排斥溶质的浓度。在某些实施方案中，平衡缓冲液可以包括缓冲化合物以赋予适当的pH值控制。这样的化合物包括但不限于乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、MES、HEPES、BICINE、咪唑和Tris。平衡缓冲液的pH值可以为约pH4.0至约pH9.0。在适用于纯化单克隆IgM抗体的一个实施方案中，平衡缓冲液包含的Hepes浓度为约50mM，pH值为7.0，氯化钠浓度为200mM，以及PEG-6000浓度为12.5％。在适用于纯化IgG的另一个实施方案中，平衡缓冲液包含的Hepes浓度为约50mM，pH值为约7.0，氯化钠浓度为1.0M，以及PEG-6000浓度为15％。在适用于纯化病毒颗粒的另一个实施方案中，平衡缓冲液包含的MES浓度为约50mM，pH值为5.8，氯化钠浓度为600mM，以及PEG-6000浓度为6％。在适用于纯化抗体的另一个实施方案中，平衡缓冲液包含的Hepes浓度为约50mM，pH值为约7.0，硫酸铵浓度为1.5M。

在某些实施方案中，在实施本发明之前将制品制剂平衡到与柱平衡缓冲液相容的条件。在一个实施方案中，样品可以通过一条线路泵至柱上，同时优先排除溶质的浓缩溶液通过另一条线路泵至柱上，并且两条线路在紧邻柱之前混合，以减少制品暴露于优先排斥剂的柱前时间间隔，作为限制样品流到柱之前可能发生沉淀的程度的手段。在一个实施方案中，通过一条线路施加的优先排斥剂的浓度为混合物目标浓度的125％，优选排斥剂与样品的混合比例是80％试剂，20％样品。在某些实施方案中，这提供了相当有效的起点，仅需要确定最终混合物中所需优先排斥剂的量，以实现期望的制品结合特点。在手工操作的方法中，所述优先排斥剂的相对浓度和比例系数可以变化，以确定支持该最高容量和最低混合样品体积的条件。

在某些实施方案中，优先排斥剂是PEG-8000，或PEG-6000，或PEG-3500，或PEG-2000，或PEG-1000，或PEG-600。一般而言，聚合物越大，实现良好的结合所需的浓度越低。因为较低分子量的PEG倾向于具有不成比例的低粘度。由于较低的粘度一般有益于产生较低的工作压力且对机械系统的搅拌能力施加的应力较小，值得探讨这个选项。

在某些实施方案中，平衡缓冲液的配方可以与平衡的样品的配方基本上不同。例如可将1.2M氯化钠加入到样品中，而平衡缓冲液只含有200mM氯化钠以维持400mM氯化钠的净样品盐浓度的目标(在线稀释比例80:20)，然后立即用200mM氯化钠洗涤。由于更高的容量结合而有较高盐浓度时可以使用这种策略，但较低的盐浓度对于洗去污染物的特定子集更有效。除了盐浓度不同，这两个缓冲液也可能存在以下方面的差异：pH值或其他试剂的存在、不存在、或量。可通过任选性地使用第二洗涤缓冲液可实现类似的效果。

在本发明的某些实施方案中，加载样品后，用洗涤缓冲液(通常具有和平衡缓冲液相同的组成)洗涤柱，以从色谱载体除去未结合的污染物。

在该方法的某些实施方案中，然后仅通过降低优先排斥剂的浓度来从色谱载体洗脱产物，例如通过产生从Hepes/PEG至仅有Hepes的缓冲液的梯度。

在另一实施方案中，优先排斥剂的减少伴随着一种或多种洗脱增强物质的增加，其通过在梯度终点缓冲液中包含这类物质。这类试剂的例子可包括尿素、精氨酸或表面活性剂等。

适合于实施本发明的某些实施方案的约束剂尤其包括非离子有机聚合物,例如分子量一般为600到6,000道尔顿的聚乙二醇(PEG)，但也可以为较低和较高的分子量。高浓度的PEG具有稳定蛋白质的长期声誉，它们可以被活细胞良好耐受，许多FDA批准的人-可注射治疗配方使用PEG作为非活性成分。可以有效地使用其它非离子有机聚合物，例如但不限于聚丙烯乙二醇、葡聚糖等。适用于实施本发明的其它优先排斥剂可以包括选自硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠或柠檬酸钾、磷酸钾等的亲液盐；以及氨基酸如甘氨酸。实验数据表明，不同优先排斥剂赋予不同的选择性。因此，可能值得比较用排除盐相对于非离子型有机聚合物或氨基酸实现的结果。虽然可以用不同类别的优先排斥剂的组合，如盐与非离子有机聚合物的组合来实施本发明，由于一些组合会产生自发相分离而必须小心。

适用于实施本发明的某些实施方案的色谱颗粒尤其包括具有高度水合表面的介质。许多对于吸附色谱未官能化的基于聚合物的介质具有密布羟基基团的表面，所述羟基与水强烈相互作用，使得表面高度水合。已用高度水合的材料官能化的表面也是理想的，可能包括固定的糖、淀粉、其他碳水化合物和酰脲。带正电荷和负电荷的基团也往往是高度水合的，并可以用来在高盐条件下实施本发明，其中生物样品组分与载体之间的电荷相互作用被有效地阻止。具有一些疏水特性的表面可以是合适的,如果它们具有足以支配表面的整体极性特征，这将排除用于进行疏水相互作用色谱的大多数表面。

可以用多孔颗粒实施本方法的某些实施方案，但已经证明无孔颗粒是有利的。多孔颗粒提供了各种蛋白质，包括污染物和目标产物扩散到孔中的可能性，然后在过程的不同阶段逐渐漏出，影响纯度或产品回收率，或两者。

在某些实施方案中，颗粒的尺寸可以为小于100nm至大于200μm。这涵盖了从纳米颗粒到微颗粒，这两者已被证明是有效的。颗粒可以由任何材料构成，包括聚合物、矿物或金属，其中任何一个可以是表面组成与颗粒内部不同的复合结构。这尤其包括设计成由磁性分离器进行收集的铁芯颗粒，以及其中存在核心以在当以所谓的膨胀床模式实施该方法时产生高密度的合金芯颗粒。后者的实例可以包括，例如，涂有纤维素的碳化钨芯颗粒。

在某些实施方案中，颗粒的数量应该是足以容纳所有的目标物的结合的量。这可以很容易地通过实验来确定。典型量可以为5％至20％，但该方法可以使用更低和更高的量来实施而不降低其有效性。一般而言，当预计样品材料批次之间变化时，使用适度大于实验确定的最小量的量是明智的。所谓的适度较大的量可以包括大10%，或大50%，或两倍于最小量，取决于样品组合物变化的水平。更大的量可能导致目标物的不可接受的损失。

在某些实施方案中，所述约束剂可以作为液态浓缩物添加，以增加它在整个液体的分散效率。可以手动进行添加，或者通过使用泵自动方便地添加。或者沉淀剂可以作为粉末添加。这提供了降低最终处理体积的优势，但增加了添加必须发生的时间段，因为必须容许时间以允许沉淀剂溶解。作为总的出发点，作为液体浓缩液添加沉淀剂可以在30分钟内或更长完成，而添加干粉可以在60分钟内或更长完成。后续试验将揭示对于任何给定应用的具体限制。

可用本发明的实施方案有效地纯化的生物制品包括：蛋白质包括抗体和凝血因子；病毒颗粒；细胞器如核糖体、线粒体和外泌体等。一般而言，本发明有利于纯化可以通过用盐或非离子型有机聚合物沉淀来部分地纯化的任何产物。

尽管本发明的方法的某些实施方案将被最频繁地用于从不纯的混合物沉淀目标产物，它也可以被应用于从制剂中沉淀特定污染物，而目标产品保持可溶。

可以用非常简单到非常复杂的机械系统实施本发明，只要不脱离其基本特征。

因为本发明的某些实施方案涉及到共同沉淀的方法，为了实施它们，具有从该处测量其好处的给定起始点将是非常有用。实现这个的一种方法是，首先按照标准操作方法进行硫酸铵沉淀和/或PEG沉淀，以产生参考材料。然后进行本发明的盐和/或PEG配伍。例如，对于IgG抗体的情况，将淀粉与抗体制剂按20％的重量体积比混合。在将淀粉彻底分散(搅拌)在抗体制剂中之后，在30分钟的时间段内将30％PEG-6000加入其中至15％的PEG终浓度。离心样品以沉淀淀粉和共沉淀的抗体。通过用生理缓冲液重悬浮所述共沉淀物混合物以回收抗体，所述生理缓冲液为例如磷酸盐缓冲的或Hepes缓冲的盐水(100-150mMNaCl)，pH6.8-7.2。对于IgM，较低的PEG量通常满足，例如12.5%。对于病毒种类，更低的PEG量通常满足，例如5-7.5%PEG。通过标准实验室方法表征纯度、回收率和聚集体含量。

除了PEG通常比沉淀盐产生更好的效果，在某些实施方案中其提供了更广泛的机会以微调该方法的选择性，从而优化纯度和回收率。沉淀盐的高电导率抑制蛋白质之间电荷的相互作用，这使得不可能探索低电导率的影响，并使得系统对pH值变化作出具有更少响应性的行为。用PEG，电导率可以通过诸如氯化钠的非沉淀盐从零到非常高之间变化。在特别低的电导率值，pH值变化可能会提供显著机会来改变系统的选择性。

在某些实施方案中，通常会值得探讨用碳水化合物有机成核中心相对于用酰脲有机成核中心得到的结果的差异。例如，通过简单地用尿囊素取代淀粉并比较结果，要特别注意回收蛋白质的聚集体含量，允许对在本发明某些实施方案中某些有机成核中心的相对优点进行评估。由本发明的酰脲版本回收的抗体常常含有低1-2％的聚集体。由于与某些蛋白质弱结合，酰脲可倾向于产生比淀粉低的病毒回收率，但该效果可以通过在进行共沉淀的缓冲器中包括精氨酸或尿素来进行补偿。在将淀粉相对于尿囊素进行基本评价之后，值得评估从这两类的更广泛选择得到的结果。

通过指定的有机成核中心、沉淀剂、pH值和电导率条件，可进行实验以确定每体积样品所需的有机成核中心的量。在某些实施方案中，上述建议的20％的量将通常被证明过量。可以评估更大的量，但较少量通常将被证明足够。一般情况下，较小的量将证明是有利的，特别是如果该方法打算扩大规模。

不论材料和比例，在某些实施方案中，最终产品的纯度一般可以通过在初始共沉淀和回收步骤之间进行中间洗涤步骤来改善。这个洗涤步骤可以由以下组成：将所述第一共沉淀物重悬浮于含有与原共沉淀混合物的沉淀剂浓度相同的干净缓冲液中，然后弃去第二上清液。该操作稀释了在初始沉淀之后可能存在于共沉淀物间隙的液体中污染物。如果希望产生更高水平的纯度，可以重复该步骤。通过以过滤形式进行洗涤代替离心可以便于进行该步骤。

不论材料和比例，在某些实施方案中，通过进行第二回收步骤通常可以改善终产物的回收率。在移除包含再溶解的产物的初始回收缓冲液之后，可以加入另一份干净的缓冲液以重悬浮有机成核中心。这允许在第一回收步骤之后回收有机成核中心间隙中难以接近的再溶解产物。

如在上文讨论的多个点中所表明的，在某些实施方案中，可以离心或过滤形式执行本方法。

在一些实施方案中，本发明提供用于纯化大型生物化合物的方法，不限于任何特定的理论，相信其通过以下起作用：仅通过约束性共享所述大型生物化合物各自的水合鞘之间的水，在非反应性亲水性表面捕获它们。通过优先水合亲水表面的试剂如聚乙二醇(PEG)来诱导和稳定捕获。选择性与分子尺寸相关。保留随PEG尺寸和浓度而增加。在接近目标生物分子的等电点(pI)时结合增强。盐通过降低PEG尺寸而减弱保留。对于IgG，粗原料流的单步纯化系数为90％以上；对于病毒颗粒，单步纯化系数为99.8％。近生理pH值和电导率分级分离保护长期不稳定的生物制品如病毒和IgM的活性。整料上的病毒结合能力为约1万亿颗粒/mL。基于磁性纳米颗粒的版本实现比相应的阳离子交换颗粒高30倍的IgG结合容量。

如何将工艺的规模扩大至支持给定应用所需的程度对于本领域技术人员是显而易见的。

实施例

实施例1.IgM的纯化。搅拌100mL包含约50μg/mLIgM克隆529的澄清细胞培养物上清液。将4g土豆淀粉分散于溶液中。在30分钟的时间段，通过蠕动泵将含30%PEG-6000的50mMHepes,200mMNaCl,pH7.0，加入其中至10%的终浓度。再持续搅拌30分钟，然后离心并移除上清。通过在10%PEG50mMHepes,200mMNaCl,pH7.0中重悬浮来洗涤共沉淀的IgM-淀粉，然后离心并移除上清。通过添加50mL的50mMHepes,200mMNaCl,pH7.0，从淀粉解离并回收IgM。通过尺寸排斥色谱分析来自该方法的选择步骤的样品。在第一上清液中发现大部分的宿主蛋白和细胞培养物组分。在回收的级分中发现约90%的纯IgM，回收率为约70%。用来自水稻和玉米的淀粉重复试验。从玉米和水稻淀粉回收的IgM具有稍多的宿主蛋白污染物，并且水稻具有更多的高分子量聚集体。

实施例2.IgG的纯化。搅拌100mL包含约800μg/mL的IgG克隆her2的细胞培养物上清液。将2g土豆淀粉分散于溶液中。在30分钟的时间段，通过蠕动泵将含30%PEG-6000的50mMHepes,200mMNaCl,pH7.0，加入其中至15%的终浓度。再持续搅拌30分钟，然后离心并移除上清。通过在15%PEG50mMHepes,200mMNaCl,pH7.0中重悬浮来洗涤共沉淀的IgG-淀粉，然后离心并移除上清。通过添加50mL的50mMHepes,200mMNaCl,pH7.0，从淀粉解离并回收IgG。使用相同的溶液和终点，通过无淀粉的PEG沉淀另一份100mL的上清液。通过尺寸排斥色谱分析回收的抗体样品。从两种方法回收的IgG包含约2%的聚集体。与硫酸铵相比产生了相同的结果。重复试验，用尿囊素替代土豆淀粉。从用尿囊素共沉淀回收的IgG包含约0.2%的聚集体，比其他方法降低约10倍。随后用200mM精氨酸处理尿囊素释放了高度聚集的IgG级分。IgM的相关实验揭示了相同的趋势。用20g/L尿囊素的IgM回收率为75%，而用40g/l尿囊素的回收率为55%。这些结果显示尿囊素优先保留较大分子量的物质种类。这些还表明尿囊素可能具有聚集体抑制效果，可能是通过其表面的轻微氧化还原性质介导的。

实施例3.IgM的纯化。制备IgM细胞培养物上清液的三份稀释液：1×、2×、4×。将4克土豆淀粉加入100mL的每份溶液，并用10%PEG6000(50mMHepes,100mMNaCl,pH7.0稀释)共沉淀。从两份较低稀释液回收的抗体为约80%，而从4倍稀释液回收的抗体仅为25%。

实施例4.病毒的纯化。对包含噬菌体M13的大肠杆菌细胞培养物上清液样品进行一系列的实验。重复实施例1的条件，除了PEG浓度为4%和8%PEG-6000。分析型阴离子交换色谱揭示了所有制剂产生约90%纯度的噬菌体。用8%PEG估算的回收率为75%，但用4%PEG为小于25%。用30%和40%淀粉在6%PEG进行另一系列的实验。用30%淀粉的回收率为约80%，而用40%淀粉的回收率为至少90%。用6%PEG，20%淀粉但是400，600和800mMNaCl进行另一系列的实验。在盐浓度为600mM和高于600mMNacl时，估算的回收率为至少90%。在6%PEG，20%淀粉，600mMNaCl但是pH值为5、6、7、8、9进行另一系列的实验。在pH值6和更低时估算回收率为至少90%，并随着pH值上升而下降。最终操作条件为40%淀粉,6%PEG,600mMNaCl,pH6.0，产生了90%的纯度和90%的回收率。

实施例5.进行一系列的实验，其中在不同pH值和不同浓度的PEG-6000评价等电点为约5.5的纯化IgM单克隆抗体的结合性质。用334μLOH整料在4mL/min的流速进行所有这些实验。结果示于图1。在10%PEG，pH5.0实现IgM的100%结合。图1显示，pH9.5可以足以实现100%结合。在11%PEG，pH6.0和12%PEG，pH7.0实现100%结合。这些结果指示，结合在物质种类的等电点附近最强烈的。用等电点大于9.0的IgM和估算等电点为约7.0的另一个IgM重复试验。在两种情况下，在最低pH值条件下观察到最强的结合。这一实例表明，与IgG相同，IgM的溶解度在低pH值时最低，而无关等电点。如果IgM的等电点也在低pH值，那么将观察到图表中示出的模式。

实施例6.进行一系列的实验，其中以NaCl浓度的函数评估IgM的结合性质。用PEG-6000在334μLOH整料以4mL/min的流速进行所有实验。结果在图2中示出，随着盐浓度的增加，结合效率显著下降，需要增加PEG-6000浓度以实现在高盐浓度下的结合。用不同种类的盐进行实验，例如硫酸铵和硫氰酸钠。硫氰酸钠具有与NaCl大体上相同的效果，而硫酸铵对结合具有比NaCl更强的效果。这些结果共同表明盐的效果会影响PEG的有效尺寸。

实施例7.PEG尺寸的效果。进行一系列的实验，其中以PEG尺寸的函数评价IgM结合。在334μLOH整料以4mL/min的流速进行所有实验。结果在图3中示出，显示较大的PEG能够在较低浓度实现结合。

实施例8.通过约束共水合在淀粉改性的磁性纳米颗粒上来纯化单克隆IgG。将包含IgG的细胞培养物上清液与淀粉改性的磁性颗粒混合。通过蠕动泵在30分钟的时间段内将含50%PEG-6000的50mMHepes,50mMNaCl,pH7.0，输入其中至15%PEG的终浓度，然后在磁场中捕获颗粒并移除上清液。通过将颗粒再次分散于15%PEG-6000,50mMHepes,50mMNaCl,pH7.0来洗涤它们，然后再次在磁场中收集它们并移除上清。将颗粒再次分散于5倍颗粒体积的50mMHepes,50mMNaCl,pH7.0，在磁场中收集颗粒并回收包含IgG的上清液。实施例4示出了通过该方法获得的纯度。估算回收率为90%。一系列的其他实验揭示了，能够以相同组合物的蛋白A亲和纳米颗粒30倍的容量获得90%的回收率和类似的纯化性能。这些结果被解释为揭示了约束共水合色谱允许在纳米颗粒的表面积累多层产物层，而纯铜的吸附纳米颗粒仅允许结合单层抗体。

实施例9.PEG浓度的效果。用病毒(质量16.7MDa)、IgM(质量960kDa)、IgG(质量160kDa)和牛血清白蛋白(BSA,质量67kDa)在不同的PEG浓度进行一系列的实验，以评估生物分子尺寸的相对贡献。用PEG-6000在334μLOH整料进行所有实验。结果示于图5。具有最大质量的物质种类在最低PEG浓度结合，而较小的物质种类需要较大的PEG浓度以实现同样的结合。BSA在15%PEG-6000勉强开始结合。这些结果突出了本技术的尺寸选择性。使用不溶性淀粉或尿囊素作为基底代替OH整料进行的平行试验显示，同样的关系继续存在，而无论使用了哪种高度水合(亲水)的基底。

实施例10.IgM的动态结合能力。通过在12%PEG以恒定浓度供应IgM，直到IgM开始流过334μLOH整料柱(通过UV吸收增加来指示)，确定IgM单克隆抗体的动态结合能力。这发生在已经装载39mg的IgM的时间点。在多种条件下用其他IgM的更早实验指示，动态结合能力通常大于20mg/mL。

实施例11.病毒的动态结合能力。通过在6%PEG以恒定浓度供应噬菌体M13，直到噬菌体开始流过334μLOH整料柱(通过UV吸收增加来指示)，确定噬菌体M13的动态结合能力。这发生在已经装载9.9×10¹²个病毒颗粒的时间点。

实施例12.病毒感染性的保留。将在OH整料上以6%PEG-6000通过约束共水合色谱纯化的噬菌体M13和未纯化的噬菌体比较以测量相对生物活性。纯化的噬菌体的感染性为约95%。在这种实验类型内在的误差因子的情况下，应当理解这最可能反映了病毒活性的完全保留。

实施例13.病毒的结合效率和回收率。通过感染性和色谱的分析指示，上述的噬菌体M13的约束共水合色谱实现了来自原始未纯化原料流的大于90%的结合效率，并且基本上所有噬菌体M13在洗脱液中被回收。

实施例14.病毒纯化效率。对于大肠杆菌宿主蛋白的ELISA分析指示，通过约束共水合色谱的纯化在该单一纯化步骤中从噬菌体M13除去了99.8%的蛋白污染物。随后通过阴离子交换色谱步骤继续纯化，总计降低宿主细胞蛋白的99.99%。AccuBlue分析显示，约束共水合色谱移除了大于90%的DNA，并且随后的阴离子交换步骤将DNA又降低10倍。

实施例15.单克隆IgG的纯化。将具有约2μm平均通道尺寸的0.34mL的羟基整料附加至色谱。用50mMHepes,300mM氯化钠,15%PEG-6000,pH7.0溶液以4mL/分钟的流速平衡。然后通过在线稀释向柱供应125mL的样品，20%的样品，80%的稀释缓冲液以产生15%的PEG终浓度。装载完成后，用平衡缓冲液洗涤床以移除未结合的污染物。然后用渐降PEG梯度洗脱床。IgG在该梯度的最后四分之一中被洗脱。分析尺寸排斥色谱表明，抗体纯度大于95%，而聚集体含量与通过蛋白A亲和色谱纯化的参照IgG类似。

实施例16.用单克隆IgM比较不同高度水合的整料。在分开的试验中，比较了用羟基基团、阳离子交换基团(SO₃)和阴离子交换基团(QA)涂覆的0.34mL的整料。用50mMHepes,1M氯化钠,12.5%PEG-6000,pH7.0溶液以4mL/分钟的流速平衡各种整料。然后通过在线稀释向柱供应125mL的样品，20%的样品，80%的稀释缓冲液以产生12.5%的PEG终浓度。装载完成后，用平衡缓冲液洗涤床以移除未结合的污染物。然后用渐降PEG梯度洗脱床。终点缓冲液也包含1MNaCl，使得盐浓度在整个实验期间为同高的，从而抵消电荷相互作用的效果。

实施例17.从细胞培养物上清液(克隆A3,20μg/mLIgM,补充有20%血清)纯化单克隆IgM。将具有约2μm平均通道尺寸的8mL的羟基整料附加至色谱。用50mMHepes,300mM氯化钠,12.5%PEG-6000,pH7.0溶液以75mL/分钟的流速平衡。然后通过在线稀释向柱供应1250mL的含有IgM的细胞培养物上清液，20%的样品，80%的稀释缓冲液以产生12.5%的PEG终浓度。装载完成后，用平衡缓冲液洗涤床以移除未结合的污染物。然后用渐降PEG梯度洗脱床。IgG在该梯度的最后四分之一中被洗脱。分析尺寸排斥色谱显示，抗体纯度大于95%，回收率为63%。

实施例18.从细胞培养物上清液纯化单克隆IgM。将具有约2μm平均通道尺寸的8mL的羟基整料附加至色谱。用50mMHepes,300mM氯化钠,12.5%PEG-6000,pH7.0溶液以75mL/分钟的流速平衡。然后通过在线稀释向柱供应1250mL不同的含有IgM的细胞培养物上清液，20%的样品，80%的稀释缓冲液以产生12.5%的PEG终浓度。装载完成后，用平衡缓冲液洗涤床以移除未结合的污染物。然后用渐降PEG梯度洗脱床。IgG在该梯度的最后四分之一中被洗脱。分析型尺寸排斥色谱显示，抗体纯度大于95%。将IgM级分施加到10mL的羟基磷灰石柱(II型CHT,40μm)，并用线性梯度增加至300mM的磷酸钠洗脱。用水1:1稀释IgM级分，并在50mMHepes,pH7.0中以75mL/分钟的流速装载在8mlQA阴离子交换整料上，然后用10倍柱体积包含线性梯度递增至300mM的氯化钠的50mMHepes,pH7.0洗脱。分析型尺寸排斥色谱指示，3-步法支持60%的总回收率，而产生大于99%的纯IgM，没有可检测到的聚集体或片段。本实施例证明了，本发明与其他纯化方法组合产生了完整的纯化过程。以200mMNaCl重复试验。与300mM相比，回收率和纯度基本不变。

实施例19.纤维蛋白原的分级分离。用50mMHepes,2.0M甘氨酸,10mMEDTA,pH7.0平衡0.34mL的羟基整料。通过在线稀释向柱供应125mL的部分纯化的人纤维蛋白原，20%的样品，80%的稀释缓冲液以产生2.0M的甘氨酸终浓度。在样品应用期间一些污染物流过柱。装载完成后，用平衡缓冲液洗涤床以移除未结合的污染物。然后用渐降甘氨酸梯度洗脱床，产生宽的不均匀纤维蛋白原峰。操作压力在运行期间增加，通过用3M胍洗涤柱逆转这一效果。

实施例20.抗血友病因子(因子VIII-vWF复合物)的纯化。用8%PEG-6000,50mMHepes,200mMNaCl,pH7.0平衡0.34mL的羟基整料。将抗血友病因子与人血清白蛋白(HSA)的混合物施加到相同浓度的PEG-6000。HAS难以结合，并在装载期间被清除。用平衡缓冲液短暂地冲洗柱，以10mL的线性梯度至50mMHepes,200mMNaCl,pH7.0洗脱抗血友病因子。

实施例21.病毒纯化。用6%PEG-6000,50mMHepes,200mMNaCl,pH7.0平衡1mL的羟基整料。通过用12%PEG-6000,50mMHepes,600mMNaCl,pH7.0与50mMHepes,600mMNaCl,pH7.0的50:50混合物平衡来进行这一步骤。通过用12%PEG缓冲液在线稀释装载100mL的噬菌体M13，产生200mL于6%PEG中的病毒样品。大部分污染物流过整料，而用平衡缓冲液冲洗掉其残余物。然后用10mL线性梯度至50mMHepes,600mMNaCl,pH7.0来洗脱柱。分析型阴离子交换色谱证明90%回收90%的纯病毒，并且去除了90%的DNA。随后的分析显示病毒保持感染性。在阴离子交换整料上进行的第二纯化步骤实现大于99%的纯度，综合回收率为80%，DNA再降低1000倍。完整的2-步方法在2小时内完成。

实施例22.外泌体的优先排斥色谱纯化。用6%PEG6000,50mMHepes,200mMNaClpH7.0以8mL/min平衡1mL羟基整料。通过用8%PEG6000,50mMHEPES,200mMNaClpH7.0在线稀释得到6%当量的PEG6000浓度以装载由间充质干细胞分泌的外泌体制剂。然后用6%PEG6000洗涤整料，并用8mL线性梯度至50mMHEPES,200mMNaClpH7.0洗脱。通过在600nm观察吸光度在线检测外泌体的存在。离线检测使用动态光散射。两种检测方法均显示洗脱液中外泌体的存在，突出了本方法纯化细胞器的实用性。

实施例23.在羟基多孔微颗粒上纯化单克隆IgG。将10mLToyopearlHW75M颗粒分散于100mL包含IgG的细胞培养物上清液中。在1小时的过程中添加饱和的硫酸铵至1.5M的终浓度。将颗粒放置在过滤器上并吸出液体。然后将颗粒填充在柱中，用12.5%PEG-600050mMHepes,300mMNaCl,pH7.0洗涤，然后用10倍柱体积的递减PEG梯度洗脱。观察到聚集体比非聚集的抗体洗脱得更晚。分析型尺寸排斥色谱(SEC)显示IgG纯度大于95%。

实施例24.在无孔二氧化硅颗粒上纯化单克隆IgG。将5mL无孔二氧化硅10μm微球分散于100mL包含IgG的细胞培养物上清液中。在30分钟的过程中添加饱和的硫酸铵至1.5M的终浓度。将颗粒放置在过滤器上并抽掉液体。用1.5M硫酸铵冲洗仍在过滤仪器中保留的颗粒，然后将硫酸铵吸出。更换过滤容器，通过添加2倍床体积的50mMHepes,0.3Msodiumchloride,pH7.0从所述颗粒解离IgG，然后通过过滤器吸出。分析型SEC显示抗体纯度大于95%。

实施例25.在无孔二氧化硅微球上两步法纯化单克隆IgG。将5mL无孔二氧化硅10μm微球分散于100mL包含IgG的细胞培养物上清液中。在30分钟的过程中将含30%PEG-6000的50mMHepes,pH7.0，加入其中至15%的终浓度。将颗粒放置在过滤器上并吸出液体。用15%PEG,300mM氯化钠,50mMHepes,pH7.0洗涤保留在过滤仪器中的颗粒，然后将其吸出。更换过滤容器，通过添加2倍床体积的50mMHepes,0.3Msodiumchloride,pH7.0从所述颗粒解离IgG，然后通过过滤器吸出。分析型SEC显示抗体纯度大于95%。在羟基磷灰石柱(I型CHT,40μm)上分级分离这种材料以除去IgG片段和聚集体。分析型SEC显示材料没有聚集体，纯度为约99%。

实施例26.在羟基多孔微颗粒上纯化IgM单克隆抗体。将5mLSephadexG25超细粉分散于100mL包含IgM的细胞培养物上清液中。在15分钟的过程中将饱和的硫酸铵加入其中至1.2M的终浓度。将悬浮液施加到0.22μm过滤膜上并吸出液体。将颗粒重悬浮在1.2M硫酸铵中，并再次吸出液体。将颗粒重悬浮在12.5%PEG-6000,100mM氯化钠,50mMHepes,pH7.0中。更换过滤容器，用50mMHepes,100mM氯化钠,pH7.0重悬浮颗粒，通过过滤器吸出包含抗体的液体。分析型SEC显示材料纯度大于95%。

实施例27.3-步法纯化单克隆IgM。将10mL无孔10μm二氧化硅微球分散于100mL包含IgM的细胞培养物上清液中。在30分钟的过程中将30%PEG-6000in50mMHepes,pH7.0，加入其中至10%PEG的终浓度。将悬浮液施加到0.22μm过滤膜上并吸出液体。将颗粒重悬浮在10%PEG-6000,1MNaCl,50mMHepes,pH7.0中并吸出液体。更换过滤容器，通过添加25mL50mMHepes,1MNaCl,0.1%聚山梨醇酯-20从颗粒解离IgM，并通过过滤器吸出IgM。将IgM施加到羟基磷灰石柱(II型CHT,40μm)上，并用磷酸盐梯度洗脱。IgM级分没有聚集体和片段。用水1:1稀释羟基磷灰石洗脱液，并施加到用50mMHepes,pH7.0平衡的阴离子交换整料(QA,8mL)，然后用线性梯度至300mM氯化钠,50mMHepes,pH7.0洗脱。IgM纯度大于99%，并且没有聚集体。

实施例28.抗血友病因子(因子VIII-vWF复合物)的纯化。将1mL的10μm无孔二氧化硅微球分散于浓度为1mg/mL的人重组抗血友病因子和浓度为10mg/mL的人血清白蛋白(HSA)的10mL溶液中，。将包含30%PEG-6000的50mMHepes,100mMNaCl,pH7.0，加入其中至10%的终浓度。将悬浮液施加到0.22μm过滤器上并吸出液体。将颗粒重悬浮在10mL的50mMHepes,100mMNaCL,10%PEG-6000,pH7.0，并移除液体。更换过滤容器，并通过将颗粒重悬浮在50mMHepes,100mMNaCl,pH7.0中来从颗粒洗脱抗血友病因子。抗血友病因子没有HSA，回收率为67%。

实施例29.病毒纯化。将1mL的10μm无孔二氧化硅微球分散于20mL的噬菌体M13中。将包含12%PEG-6000的50mMHepes,600mMNaCl,pH7.0，加入其中至6%的终浓度。将悬浮液施加到0.22μm过滤器上并吸出液体。将颗粒重悬浮在10mL的50mMHepes,600mMNaCl,6%PEG-6000,pH7.0，并移除液体。更换过滤容器，并通过将颗粒重悬浮在50mMHepes,50mMNaCl,pH7.0中来从颗粒洗脱病毒。分析型阴离子交换色谱证明30%回收了80%纯的病毒，并且去除了90%的DNA。随后的分析显示病毒保持感染性。

实施例30.外泌体的纯化。将10mL的10μm无孔二氧化硅微球分散于100mL的由人干细胞分泌的外泌体制剂中。将包含30%PEG-6000的50mMHepes,200mMNaCl,pH7.0，加入其中至6%的终浓度。将悬浮液施加到0.22μm过滤器上并吸出液体。将颗粒重悬浮在10mL的50mMHepes,200mMNaCl,6%PEG-6000,pH7.0，并移除液体。更换过滤容器，并通过将颗粒重悬浮在50mMHepes,50mMNaCl,pH7.0中来从颗粒洗脱外泌体。差示光散射和多波长监测确认了洗脱液中外泌体的存在。

实施例31.使用无孔淀粉涂覆的磁性纳米颗粒纯化IgG。向1mL的Her2细胞培养物上清液样品中加入5mg的200nm或1μm的磁性纳米颗粒。将包含45%(w/v)PEG6000的50mMHEPES100mMNaClpH7.0加入到微量离心管中，至15%PEG6000的终浓度，并手动混合。通过施加磁场澄清悬浮液，使用微量吸管去除上清液。通过将珠悬浮在50mMHEPES,100mMNaClpH7.0中来从颗粒洗脱结合的IgG。分析型SEC显示IgG纯度大于95%。

实施例32.病毒的基于整料的CCC纯化。具有羟基化的表面和平均2μm通道的聚甲基丙烯酸酯整料被用于评价约束共水合实现选择性保留病毒的能力。整料中的质量传递通过对流发生，其不受扩散率限制的影响，所述扩散率限制阻塞用多孔颗粒填充的柱[Hahn,R.,Panzer,M.,Hansen,E.,Mollerup,J.,Jungbauer,A.,Monolithsforseparationofbiomolecules.Sep.Sci.Technol.,371545-1565(2002).;Strancar,A.,Podgornik,A.,Barut,M.,Necina,R.,Shortmonolithiccolumnsasstationaryphasesforbiochromatography.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.7649-85(2002);Jungbauer,A.,ChromatographicMediaforBioseparation,J.Chromatogr.A,10653–12(2005)]。通过扩展，色谱性能不受粘度影响。整料也缺乏空隙空间，在颗粒柱中主要在空隙空间产生湍流剪切力[Levy,M.S.,O’Kennedy,R.D.,Ayazi-Shamlou,P.,Dunnill,P.,BiochemicalengineeringapproachestothechallengesofproducingpureplasmidDNA.TrendsBiotechnol.,18296-305(2000);Lendero-Krajnc,N.,Smrekar,F.,Strancar,A.,Podgornik,A.,Adsorptionbehavioroflargeplasmidsontheanion-exchangemethacrylatemonolithiccolumns.J.Chromatogr.A.,12182413-2424(2011)]，并且它们的大通道降低了穿过床的压力降。噬菌体M13以弱柔性棒存在，长度为916nm，直径为7.2nm，分子量为约16.7MDa24。通过一个泵加载过滤的大肠杆菌上清液，并用通过另一个泵以相同流速输送的12%PEG-6000在线稀释。病毒在6%PEG混合物中的整料前(pre-monolith)停留时间计算为约1秒，不足以在病毒与整料表面接触之前发生显著沉淀。未保留的物质通过整料的时间为约5秒。大于90%来自2.5L样品的病毒被0.34mL整料保留，突出了快速结合动力学和高浓度指数。随后用6%PEG,600mMNaCl,50mMHepes,pH7.0洗涤整料，然后用线性梯度至50mMHepes,600mMNaCl,pH7.0洗脱。洗脱曲线使人联想到亲和色谱，几乎所有污染物从柱流过，并在2.5mL的级分中回收病毒(图6)。用纯化的噬菌体确定的动态结合能力为9.9×10¹²cfu/mL整料。宿主细胞ELISA证明了大肠杆菌蛋白减少99.8%。AccuBlue证明了DNA减少92%。CCC纯化的病毒的感染性与未纯化的病毒相当，突出了该分离方法和条件的温和影响。(参见图6)。

实施例33.IGM的基于整料的CCC纯化。OH整料也用于评估约束共水合实现选择性保留IgM的能力。这一类型的抗体是特别不稳定的，分子量为约1MDa25。通过在线稀释加载生长在补充有20%血清的细胞培养基中的单克隆IgM，以1份上清比4份12.5%PEG-6000，产生10%的PEG终浓度。随后用10%PEG,200mMNaCl,50mMHepes,pH6.0洗涤整料，然后用线性梯度至50mMHepes,200mMNaCl,pH6.0洗脱。CCC能够实现单克隆IgM的90%纯度和70%回收率，尽管最初抗体浓度仅为约20μg/mL(图7)。此后，我们用在相同条件下生长的多于20份IgM克隆实现类似的CCC结果。对于在无蛋白的细胞培养基中生长的更高产克隆，纯度增加至高达95%，回收率高达90%。对于不同的克隆，动态结合容量范围为20至38mgIgM/mL整料。有时，实际容量更多地由压力而不是表面可利用率确定，因为压力随样品整个上载的过程线性地增加。人们认为这是由于整料的通道因蛋白在其表面堆积而逐渐变窄，或如图6所示由病毒介导。(参见图7)。

本发明可以与其他纯化方法组合以实现更高水平的纯化。实例包括但不限于，常用于纯化蛋白或病毒的其他方法，例如沉淀法、亲和层析、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、固定化金属亲和层析，以及其他混合模式的色谱法。本领域普通技术人员能够开发针对不同方法的合适条件，并将它们与本发明整合以实现特定抗体的必要纯化。

所有本文引用的参考文献通过引用整体并入本文并用于所用目的，如同特别和单独指出通过引用将每一个单独的出版物或专利或专利申请以其整体并入本文并用于所用目的一样。对于通过引用并入的出版物和专利或专利申请的范围与本说明书中包含的公开之间的矛盾，说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。

所有表示成分、操作条件等的量以及在说明书和权利要求中使用的量的数字都应当理解为在所有情况下被术语“约”所修饰。因此，除非有相反的指示，在本说明书和所附的权利要求中所列举的数值参数是近似值，根据本发明试图获得的所需性能，其可以发生变化。

可以对本发明作出多种修饰和改变而不偏离其实质和范围，这对于本领域技术人员是显而易见的。本文描述的具体实施方案仅以示例的方式提供而不意图为任何方式的限制。意图本说明书和实施例仅是示例性的，本发明的真实范围和实质由所附权利要求所指示。

Claims (95)

1.用于纯化样品中生物来源的水合目标物的方法，其包括以下步骤：在不给所述目标物和不溶材料的水合表面之间提供明显的化学吸引的条件下，将所述样品与不溶材料的水合表面接触，和将所述样品与约束剂接触，所述约束剂的量足以使目标物的至少一部分被保留在所述不溶材料的水合表面上。

2.如权利要求1所述的方法，其中多于50％的所述水合目标物被保留在所述不溶材料的水合表面上。

3.如权利要求2所述的方法，其中基本上所有所述水合目标物被保留在所述不溶材料的水合表面上。

4.如权利要求1所述的方法，其中由于至少一种约束剂的存在，所述水合目标物的至少一个个体仅通过约束共水合被保留在水合表面上。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述目标物是蛋白质、抗体、凝血因子、细胞器、病毒、病毒样颗粒、基因治疗载体或细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是细胞培养物收集物、细胞培养物上清液、来自细胞培养物的含蛋白质的溶液、来自细胞培养物的含抗体的溶液、来自细胞培养物的含病毒的溶液，或来自纯化前期的包含目标物的溶液。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述目标物是蛋白质。

8.如权利要求5所述的方法，其中所述目标物是凝血因子。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述目标物是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM类型的多克隆抗体或单克隆抗体，或其片段或化合物重组构建体。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述目标物是原核细胞、真核细胞或干细胞。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述目标物是病毒、脂质包膜病毒、蛋白质衣壳病毒或病毒样颗粒。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述目标物是外来体、脂质体、线粒体、叶绿体、溶酶体或其他细胞器。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述不溶材料的水合表面具有一个或多个极性的化学部分。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述极性的化学部分选自羟基、胺、亚胺、酰脲、碳水化合物、氨基酸、肽、阳离子带电基团或阴离子带电基团。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述极性的化学部分是选自葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、单糖、二糖和多糖中的碳水化合物。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述极性的化学部分为选自尿素、尿酸、尿囊素和乙内酰脲中的酰脲。

17.如权利要求14所述的方法，其中所述极性的化学部分是选自组氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸和硒代半胱氨酸中的氨基酸。

18.如权利要求1所述的方法，其中所述约束剂选自盐、糖、非离子有机聚合物、无机聚合物、亲液盐、同时具有正电荷和负电荷的两性聚合物和氨基酸。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述约束剂是硫酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾、磷酸钾和氯化钠。

20.如权利要求18所述的方法，其中所述约束剂是水溶性不带电的直链或支链的非离子有机聚合物。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述约束剂选自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、淀粉、纤维素。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述约束剂是聚乙二醇。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述聚乙二醇具有100至10,000D的平均聚合物重量。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述聚乙二醇具有600至8,000D的平均聚合物重量。

25.如权利要求22所述的方法，其中以约2％至50％(w/v)的浓度提供所述聚乙二醇。

26.如权利要求25所述的方法，其中以约2％至25％(w/v)的浓度提供所述聚乙二醇，并且所述聚乙二醇具有高于约6,000D的平均聚合物重量。

27.如权利要求25所述的方法，其中以约15％至50％(w/v)的浓度提供所述聚乙二醇，并且所述聚乙二醇具有低于约6,000D的平均聚合物重量。

28.如权利要求25所述的方法，其中以约2％至25％(w/v)的浓度提供所述聚乙二醇，并且所述聚乙二醇具有约4,000D至约8,000D的平均聚合物重量。

29.如权利要求1所述的方法，其中所述不溶材料构成有机成核中心。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述有机成核中心包含碳水化合物、酰脲或肽。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述酰脲是尿囊素。

32.如权利要求30所述的方法，其中所述碳水化合物是淀粉或纤维素。

33.如权利要求30所述的方法，其中所述有机成核中心包括核心，目标物的外层通过化学或静电引力与所述核心结合或者通过约束共水合保留在所述核心上，其中目标物的该外层提供了不溶材料的水合表面。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述有机成核中心仅通过约束共水合保留目标物的多个层。

35.如权利要求30所述的方法，其中在将所述样品与所述约束剂接触的步骤之前，将所述样品与所述有机成核中心接触。

36.如权利要求35所述的方法，其还包括以下步骤：将含有污染物的上清液从有机成核中心分离，所述有机成核中心具有保留在所述有机成核中心的水合表面上的目标物。

37.如权利要求36所述的方法，其还包括以下步骤：通过将所述有机成核中心暴露于促进目标物从有机成核中心解离的条件下，以从所述有机成核中心回收所述目标物。

38.如权利要求37所述的方法，其中通过充分地降低约束剂的浓度从所述有机成核中心解离所述目标物。

39.如权利要求37所述的方法，其包括将所述有机成核中心与不包含所述约束剂的溶液接触的步骤。

40.如权利要求37所述的方法，其中所述促进目标物解离的条件包括将所述有机成核中心暴露于下述的盐的浓度，所述盐的浓度足以减少约束剂的有效性，从而将所述目标物保留在所述有机成核中心的水合表面。

41.如权利要求37所述的方法，其中所述促进目标物解离的条件包括将所述有机成核中心暴露于下述的糖的浓度，所述糖的浓度足以降低约束剂将所述目标物约束在所述有机成核中心的水合表面的能力。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述糖选自山梨糖醇、木糖醇和蔗糖，并且所述约束剂是聚乙二醇。

43.如权利要求37所述的方法，其中在从所述有机成核中心解离所述目标物之前，所述方法还包括一个或多个洗涤有机成核中心的步骤。

44.如权利要求37所述的方法，其中在从所述有机成核中心解离所述目标物的步骤中使用的溶液与用于回收所述目标物的溶液是基本相同的。

45.如权利要求1所述的方法，其中所述不溶材料包含颗粒。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述颗粒是纳米颗粒、微粒。

47.如权利要求45所述的方法，其中所述颗粒是磁性的、顺磁性的或高密度的。

48.如权利要求45所述的方法，其中所述颗粒包含选自以下的材料：具有聚合物涂层的金属芯颗粒、具有纤维素涂层的金属芯颗粒、玻璃颗粒、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯二乙烯基苯、亲硫的磁性颗粒、纤维素涂覆的碳化钨颗粒、二氧化硅颗粒、琼脂糖颗粒、纤维素颗粒和复合颗粒。

49.如权利要求45所述的方法，其中所述颗粒的尺寸为约100nm至约500μm。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述颗粒的尺寸为约100nm至约50μm。

51.如权利要求49所述的方法，其中所述颗粒的尺寸为约100nm至约4μm。

52.如权利要求49所述的方法，其中所述颗粒的尺寸为约100nm至约3μm。

53.如权利要求49所述的方法，其中所述颗粒的尺寸为约100nm至约1μm。

54.如权利要求49所述的方法，其中所述颗粒的尺寸为约200nm至约2μm。

55.如权利要求49所述的方法，其中所述颗粒的尺寸为约200nm至约500nm。

56.如权利要求49所述的方法，其中所述颗粒的尺寸为约500nm至约1μm。

57.如权利要求49所述的方法，其中所述颗粒的尺寸为约5μm至约50μm。

58.如权利要求45所述的方法，其中将靶样品与颗粒接触的步骤发生在将样品与约束剂接触的步骤之前。

59.如权利要求45所述的方法，其还包括以下步骤：从液相中分离颗粒，所述颗粒具有与其水合表面结合的目标物，和从所述颗粒解离所述目标物。

60.如权利要求45所述的方法，其中如果所述颗粒的水合表面包括带电荷部分，则选择输送到柱的缓冲液的pH值、电导率和盐浓度以阻止目标物与所述带电荷部分之间的直接相互作用。

61.如权利要求45所述的方法，其中如果所述水合表面包括带电荷部分，则选择输送到柱的缓冲液的pH值、电导率和盐的浓度，以在将所述样品与约束剂接触的步骤的至少一部分过程中阻止所述目标物与所述带电荷部分之间的直接相互作用，使得在所述一部分过程中所述目标物仅通过约束共水合被保留在水合表面上。

62.如权利要求59所述的方法，其中解离所述目标物的步骤包括用溶液洗涤所述颗粒，其中所述溶液：(i)不包含所述约束剂；(ii)包含所述约束剂，所述约束剂的量足以将所述目标物保留在所述颗粒的水合表面；(iii)包含引起所述目标物从所述颗粒的水合表面解离的试剂；(iv)(i)和(iii)的组合；或(v)(ii)和(iii)的组合。

63.如权利要求62所述的方法，其中所述在约束剂的存在下引起所述目标物从所述颗粒的水合表面解离的试剂选自表面活性剂、酰脲、糖、盐、螯合剂或离液剂。

64.如权利要求45所述的方法，其中在约1分钟至约5小时、2分钟至15分钟、2分钟至30分钟、10分钟至30分钟、2分钟至2小时或约2分钟至2小时的时间段内，将所述约束剂加入到所述样品和颗粒中。

65.如权利要求45所述的方法，其中在所述接触之后，通过离心、沉淀、倾滤、使混合物接受磁场或通过过滤，从液体组分中分离所述颗粒。

66.如权利要求65所述的方法，其中用包含所述约束剂的溶液洗涤所述分离的颗粒。

67.如权利要求59所述的方法，其中所述解离步骤是以将解离缓冲液加入到所述颗粒中的单独步骤进行的。

68.如权利要求59所述的方法，其中所述解离目标物的步骤是通过降低所述约束剂的浓度来递增进行的。

69.如权利要求45所述的方法，其中所述方法在执行用于从其他材料中分级分离所述目标物的方法之前或之后进行，并且所述用于分级分离的方法选自：高效液相色谱、亲和色谱、蛋白A色谱、蛋白G色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、固定化金属亲和色谱、沉淀法、聚乙二醇沉淀、辛酸沉淀、离心和超速离心。

70.如权利要求1所述的方法，其中所述不溶材料是对流色谱材料。

71.如权利要求70所述的方法，其中所述对流色谱材料选自整料、膜和无孔的颗粒。

72.如权利要求71所述的方法，其中所述对流色谱材料包括填充在柱中的无孔二氧化硅颗粒。

73.如权利要求71所述的方法，其中所述对流色谱材料是整料。

74.如权利要求73所述的方法，其中所述整料由选自聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯二乙烯基苯和二氧化硅中的材料组成。

75.如权利要求73所述的方法，其中所述整料包括约1μm至200μm的平均通道尺寸。

76.如权利要求75所述的方法，其中所述通道的尺寸为约1μm至5μm。

77.如权利要求75所述的方法，其中所述通道的尺寸为约10μm至20μm。

78.如权利要求75所述的方法，其中所述通道的尺寸为约50μm至200μm。

79.如权利要求73所述的方法，其中所述整料涂有聚合物。

80.如权利要求73所述的方法，其中所述整料被化学修饰以增加其表面的水合能力。

81.如权利要求70所述的方法，其中所述对流色谱材料的表面被羟基化、糖基化或多羟基化。

82.如权利要求72所述的方法，其中如果所述对流色谱材料的表面包括带电荷部分，则选择输送到柱的缓冲液的pH值、电导率和盐浓度以阻止目标物与所述带电荷部分之间的直接相互作用。

83.如权利要求72所述的方法，其中如果所述对流色谱材料的表面包括带电荷部分，则选择输送到柱的缓冲液的pH值、电导率和盐的浓度，以在将所述样品与约束剂接触的步骤的至少一部分过程中阻止所述目标物与所述带电荷部分之间的直接相互作用，使得在所述一部分过程中所述目标物仅通过约束共水合被保留在水合表面上。

84.如权利要求70所述的方法，其中在约束剂的存在下进行将所述样品与所述对流色谱材料的水合表面接触的步骤。

85.如权利要求70所述的方法，其中将所述样品与所述对流色谱材料的水合表面接触的步骤是通过以下步骤进行的：通过一个入口线路施加所述样品，同时通过另一条线路施加浓缩的约束剂，在紧邻所述对流色谱材料之前放置的混合器中混合两种液流，使得混合物的柱前滞留时间短到不足以形成足够的沉淀而堵塞对流色谱材料或干扰所述方法。

86.如权利要求84所述的方法，其中在将样品输送到对流色谱材料之前，所述样品与含有至少一种约束剂的缓冲液混合，并且其中在所述目标样品的这种输送之前，用约束剂平衡所述对流色谱材料。

87.如权利要求84所述的方法，其还包括以下步骤：用包含约束剂的溶液洗涤水合的对流色谱材料，所述约束剂的量足以除去未保留在不溶材料的水合表面上的污染物，并随后从所述对流色谱材料解离所述目标物。

88.如权利要求87所述的方法，其中解离所述目标物的步骤包括用溶液洗涤所述对流色谱材料，其中所述溶液：(i)不包含所述约束剂；(ii)包含所述约束剂，所述约束剂的量足以将所述目标物保留在所述对流色谱材料的水合表面；(iii)包含引起所述目标物从所述对流色谱材料的水合表面解离的试剂；(iv)(i)和(iii)的组合；或(v)(ii)和(iii)的组合。

89.如权利要求70所述的方法，其中所述方法在执行用于从其他材料分级分离所述目标物的方法之前或之后进行，并且所述用于分级分离的方法选自：高效液相色谱、亲和色谱、蛋白A色谱、蛋白G色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、固定化金属亲和色谱、沉淀法、聚乙二醇沉淀、辛酸沉淀、离心和超速离心。

90.如权利要求88所述的方法，其中所述在约束剂的存在下引起所述目标物从所述对流色谱材料的水合表面解离的试剂选自表面活性剂、酰脲、糖、盐、螯合剂或离液剂。

91.如权利要求1所述的方法，其中所述不溶材料具有在第一组条件下可与目标物结合，而在第二组条件下不与目标物结合的化学或官能部分，并且其中所述方法包括在第二组条件下于约束剂的存在下将目标物保留在不溶材料的水合表面上的步骤。

92.如权利要求91所述的方法，其中所述第一组条件和所述第二组条件的差异仅在于，在第二组条件下存在约束剂。

93.如权利要求91所述的方法，其中在所述第二组条件下将所述目标物保留在所述不溶材料的水合表面上的步骤之前，所述方法还包括在第一组条件下洗涤所述样品的步骤且同时所述目标物结合到不溶材料上。

94.如权利要求93所述的方法，其中所述第一组条件和第二组条件的pH值、导电率和盐浓度中至少一项有差异。

95.试剂盒，其包括有机成核中心和约束剂，所述试剂盒配置用于方便执行权利要求1-44中任一项所述的方法。