CN108865978A - 一种分离和纯化外泌体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，是一种分离和纯化外泌体的方法。从样品中分离获得含杂蛋白的外泌体悬液，利用羟基磷灰石分离纯化获得纯外泌体。本发明方法操作简单便捷、成本低，可快速高效地获得高纯度的外泌体颗粒，便于外泌体的蛋白质分析、外泌体DNA/RNA的提取、外泌体电镜分析、外泌体粒径分析等下游实验。具有很好的应用前景。

Description

一种分离和纯化外泌体的方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，是一种分离和纯化外泌体的方法。
背景技术
外泌体(exosomes)是一种含有复杂的蛋白质、脂质和核酸等活性生物分子的具有质膜双分子层结构的微囊泡，直径约为30-150nm，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，免疫抗原呈递，神经递质传递，脂类代谢及细胞信号转导等过程，并与多种疾病的发生、发展、治疗及预后密切相关。所以很多科研人员对外泌体的研究兴趣也日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。开发从细胞培养液或生物流体分离外泌体的有效的方法可以让研究者更好地了解微囊泡的成分。超速离心作为传统并有效的分离外泌体的方法，其复杂的操作流程，昂贵的仪器设备，限制了外泌体的下游研究。目前市场上也有一些外泌体提取试剂盒，多数采用多聚物沉淀，也有采用密度梯度离心的，然而，这样提取的外泌体，都包含很多杂蛋白。因此，去除杂蛋白是目前提取外泌体需要迫切解决的问题。专利(一种分离和纯化不同外泌体亚群的方法)中有阐述利用羟基磷灰石进行尺寸排阻色谱法进行分离，其经过不同浓度的磷酸盐进行梯度洗脱从而得到不同的集分，获取不同亚群的外泌体并对其进行分析，但其获取不同亚群的外泌体重悬液含大量杂蛋白，并非为纯净的外泌体，仅为含外泌体的混合液，因此现急需一种获得纯净的外泌体的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有外泌体分离技术的缺陷和不足，提供一种分离和纯化外泌体的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种分离和纯化外泌体的方法，从样品中分离获得含杂蛋白的外泌体悬液，利用羟基磷灰石分离纯化获得纯外泌体。
进一步的说，将含杂蛋白的外泌体悬液加入装有羟基磷灰石的纯化柱中，混匀摇动孵育20-60min后，用含有磷酸二氢钠的NaCl溶液洗涤1-3次；然后利用高浓度的磷酸二氢钠溶液洗脱，得到的洗脱液即为纯净的的外泌体溶液。
所述洗涤液为含有磷酸二氢钠的500mM NaCl溶液,其中磷酸二氢钠浓度为10mM。
所述洗脱时高浓度的磷酸二氢钠溶液浓度为10mM-200mM。
所述含杂蛋白的外泌体悬液与羟基磷灰石体积质量(ul/mg)比为5-7：1。
所述样品为细胞培养液、人体外血清、血浆或尿液。
所述含杂蛋白的外泌体悬液从细胞培养液样品中获得时：细胞培养液在4℃，12000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，过滤后滤液经外泌体提取淀试剂沉淀，即得含杂蛋白的外泌体悬液；
从生物体液样品中获得时：尿液样品在4℃，12000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，过滤后滤液经外泌体提取试剂沉淀，即得含杂蛋白的外泌体悬液；
从人体外血清、血浆样品中获得时，在4℃，3000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，过滤后滤液经外泌体提取试剂沉淀，即得含杂蛋白的外泌体悬液。
所述外泌体沉淀的重悬试剂为10mM的NaH2PO4。
再进一步的说基于羟基磷灰石分离和纯化外泌体的方法，主要包括如下步骤：
S1.从细胞培养液或生物体液中分离纯化获得含杂蛋白的外泌体悬液；
S11.具体优选地，步骤S1的外泌体重悬试剂为10mM的NaH2PO4。
S2.利用羟基磷灰石分离获得外泌体。
具体优选地，步骤S2的具体方法是：
S21.将步骤S1的含杂蛋白的外泌体悬液加入装有羟基磷灰石的纯化柱中，混匀摇动孵育后，用含有磷酸二氢钠的NaCl溶液洗涤2次；
S22.然后利用200mM的磷酸二氢钠溶液洗脱，得到的洗脱液即为纯净的的外泌体溶液。
其中，优选地，步骤S21所述含杂蛋白外泌体悬液300μL与50mg羟基磷灰石反应。
优选地，步骤S21所述孵育的时间为不低于30min。
优选地，步骤S21所述含有磷酸二氢钠的NaCl溶液洗涤是在5000rpm离心5min，洗涤2次。
优选地，步骤S22所述含有磷酸二氢钠的NaCl溶液的浓度为500mMNaCl、10mM磷酸二氢钠。
另外，优选地，步骤S1所述样品可以为细胞培养液或生物体液各种样本。
本发明可具有以下效果：
本发明则利用羟基磷灰石作为纯化柱填料进行外泌体纯化，去除外泌体中大量的污染蛋白质，其向外泌体重悬液中加入磷酸二氢钠，在磷酸二氢钠的存在下，能够使游离蛋白质不易与羟基磷灰石结合，而使结合复合蛋白的外泌体与羟基磷灰石结合，本发明操作更简单，用时更短，结果更稳定，可有效去除白蛋白和免疫球蛋白IgG等杂蛋白，只需普通离心机就可以分离得到较纯的完整外泌体。本发明得到纯的外泌体，可用于外泌体蛋白质组研究、外泌体体内外标记和传递研究等。
附图说明
图1为本发明所述的分离和纯化外泌体中洗脱液浓度确定的电泳图。
图2为本发明所述的分离和纯化外泌体中洗脱液洗脱方式一确定的电泳图。
图3为本发明所述的分离和纯化外泌体中洗脱液洗脱方式二确定的电泳图。
图4为本发明所述的分离和纯化外泌体中经外泌体提取试剂沉淀后外泌体重悬试剂确定的电泳图。
图5为本发明所述的分离和纯化外泌体中洗涤液浓度确定的电泳图。
图6为本发明所述的分离和纯化外泌体中用已定的外泌体沉淀重悬试剂、洗涤液、洗脱液获得外泌体后，Western blot验证外泌体存在的结果图。
图7为本发明所述的分离和纯化外泌体中用已定的洗涤液经不同的洗涤次数后，Western blot验证外泌体变化量的结果图。
图8为本发明所述的从人的血清中分离和纯化的外泌体电镜检测图。
图9为本发明所述的从人的血清中分离和纯化的外泌体粒径检测结果图。
图10为本发明所述的从细胞培养液LM3/BALL/Lncap/HepG2中分离和纯化的外泌体Western blot检测结果图。
图11为本发明所述的从细胞培养液BALL中分离纯化的外泌体电镜检测结果图。
图12为本发明所述的从细胞培养液BALL中分离纯化的外泌体粒径检测结果图。
图13为本发明所述的从尿液中分离纯化的外泌体Western blot检测结果图。
具体实施实例
本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备，其中羟基磷灰石为BioRad(CHTⅡ型)，一抗抗体ALIX购置于Santa公司，一抗抗体CD9、CD63、CD81购置于biolegend公司，二抗(HRP标记的山羊抗兔)购置于invitrogen公司。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均可从商业途径得到。
实施例1从人的血清、血浆中分离纯化总的外泌体的方法：
1)从样品中分离和纯化外泌体时洗脱液浓度的确定
(1)血浆的预处理：将冷冻的血浆样本(来自辽宁中医药大学)于室温下解冻，在4℃、3000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡。吸取500μL血浆于1.5mL离心管中，加入外泌体提取试剂盒(Cat#EXORG30A-1)中的外泌体提取试剂125μL，用移液器反复吹打混匀，4℃孵育30min(或过夜)，而后于4℃、1500g离心30min，弃上清，再经4℃、1500g再离心5min,以彻底去除上清液。沉淀加入950μL 10mM的NaCl，使其彻底溶解。此时获得的即为含杂蛋白的外泌体重悬液(记作样品1)。
(2)移液器吸取200μL CHT溶液(0.25mg/μL)到1.5ml离心管中，5000rpm，离心5min，去除上清，用PBS(pH＝7.4)500μL洗涤一次，5000rpm，离心5min，去除上清。
(3)将300μL步骤(1)获得的含杂蛋白的外泌体悬液加入已处理好的步骤(2)获得含CHT溶液(0.2mg/μL)的1.5mL离心管中，于室温下不间断的来回颠倒混匀1h。
(4)将上述颠倒混匀的装有混合液的离心管于4℃，5000rpm，离心5min，吸取上清液留样(记作样品2)。
(5)吸取500μL 50mM的NaCl加入步骤(4)离心管中进行充分洗涤，移液器反复吹打混匀2min后，4℃、5000rpm离心5min，弃上清。
(6)分别吸取200μL 10mM、25mM、50mM、100mM、150mM、200mM的NaH2PO4依次加入离心管中进行洗涤，每次都需用移液器反复吹打混匀5min后，4℃、5000rpm离心5min，吸出每次洗涤的全部上清留样(分别记作样品3、4、5、6、7、8)。
(7)用8％SDS-PAGE配置胶检测其处理后的样品中的蛋白质含量及分布：
①8％SDS-PAGE分离胶的配制：
成分 8％
H2O 4.7mL
30％Acr/Bise 2.6mL
1.5M Tris-HCL pH8.8 2.5mL
10％SDS 100μL
10％AP 100μL
TEMED 10μL
②8％SDS-PAGE浓缩胶的配制：
成分 4％
H2O 1.53mL
30％Acr/Bise 0.33mL
0.5M Tris-HCL pH6.8 0.63mL
10％SDS 25μL
10％AP 30μL
TEMED 3μL
上样前处理：
分别吸取各样品20μL于0.5mL离心管中，再分别加入5*loading buffer 5μL，移液器反复吹打混合均匀，于100℃加热煮沸10min，待冷却至室温后，分别取20μL进行电泳上样(参见图1)。
如图1所示，蛋白质在不同的磷酸盐浓度都能被洗脱，由1、2泳道可知，含杂蛋白的外泌体重悬液中的蛋白质几乎全被CHT反应掉。说明此时的羟基磷灰石的量(50mg)足够将300μL的外泌体重悬液中的蛋白质反应完全。在10mM NaH2PO4条件下洗脱时，白蛋白、IgG都被洗脱下来很多，第三泳道的蛋白条带清晰可见；在50mM NaH2PO4条件下洗脱时，白蛋白、IgG依旧被洗脱下来很多；第6、7泳道白蛋白条带很浅，而IgG条带反而很深。也由此说明，低浓度NaH2PO4利于白蛋白洗脱下来，而高浓度NaH2PO4则利于IgG洗脱下来。故50mM的NaH2PO4就是将白蛋白、IgG全部洗脱下来的分界点。
2)洗脱液洗脱方式的确定
首先选择几组不同的洗脱方式，确定NaH2PO4能将蛋白全部洗脱下来的最低浓度：
方式一：用25mM NaH2PO4洗脱反应后的CHT 3次，比较每次洗脱下来的蛋白质的量。
(1).血浆样品的处理方法同上1)中的(1)-(5)。
(2).吸取200μL 25mM的NaH2PO4加入离心管，移液器反复吹打混匀5min后，4℃、5000rpm离心5min，吸出全部上清留样，记作样品3'(参见图2)。此步骤再重复2次，分别记作样品4'、5'(参见图2)。
方式二：用50mM NaH2PO4洗脱反应后的CHT 3次，比较每次洗脱下来的蛋白质的量。
(1).血浆样品的处理方法同上1)中的(1)-(5)。
(2).吸取200μL 50mM的NaH2PO4加入离心管，移液器反复吹打混匀5min后，4℃、5000rpm离心5min，吸出全部上清留样，记作样品6'。此步骤再重复2次，分别记作样品7'、8'(参见图2)。
而后用8％SDS-PAGE配置胶检测其处理后样品中的蛋白含量及分布(参见图2)，如图2所示：3'、4'、5'泳道为25mM的NaH2PO4洗脱下来的白蛋白和IgG的分布。6'、7'、8'泳道为50mM的NaH2PO4洗脱下来的白蛋白和IgG的分布。可见，经25mM和50mM的NaH2PO4第一次洗脱下来的白蛋白和IgG最多，而且经过三次洗脱，几乎可将CHT上的白蛋白和IgG全部洗脱下来。
方式三：分别用10mM、25mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、200mMNaH2PO4洗脱反应后的CHT各1次，比较每次洗脱下来的蛋白质的量。
(1).血浆样品的处理方法同上1)中的(1)-(5)。
(2).分别吸取200μL 10mM、25mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、200mM的NaH2PO4依次加入离心管中，移液器反复吹打混匀5min后，4℃、5000rpm离心5min，吸出每次洗脱后的全部上清液留样(分别记作样品Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ)(参见图3)。
用8％SDS-PAGE配置胶检测其处理后样品中的蛋白含量及分布(参见图3)，结果如图3所示：白蛋白在Ⅷ、Ⅸ泳道时基本全被洗脱下来。而在50mM的NaH2PO4洗脱之后依然有其他蛋白质被洗脱下来，也由此说明，NaH2PO4的浓度越高，洗脱下来的蛋白质越多。
结合图2、3的结果得出洗脱时采用的NaH2PO4的浓度越高，洗脱下来的蛋白质越多，CHT上结合的外泌体才会全部被洗脱下来。故选择200mM的NaH2PO4作为洗脱液。
3)经外泌体提取试剂沉淀后外泌体重悬试剂的确定
(1)经10mM的NaCl配置重悬试剂：
①血浆样品的预处理方法同上，收集沉淀加入950μL 10mM的NaCl得含杂蛋白的外泌体重悬液记作样品1(参见图4)；
②移液器吸取200μL CHT溶液(0.25mg/μL)到1.5ml离心管中，5000rpm，离心5min，去除上清，用PBS(pH＝7.4)500μL洗涤一次，5000rpm，离心5min，去除上清。
③将300μL样品1加入已处理好的步骤(2)获得含CHT溶液(0.2mg/μL)的1.5mL离心管中，于室温下不间断的来回颠倒混匀1h。
④将上述颠倒混匀的装有混合液的离心管于4℃，5000rpm，离心5min，吸取上清液留样(记作样品2)(参见图4)。
(2)经10mM NaH2PO4配置重悬试剂：
①血浆样品的预处理方法同上，收集沉淀加入至950μL 10mM的NaH2PO4得含杂蛋白的外泌体重悬液(记作样品3)(参见图4)；
②移液器吸取200μL CHT溶液(0.25mg/μL)到1.5ml离心管中，5000rpm，离心5min，去除上清，用PBS(pH＝7.4)500μL洗涤一次，5000rpm，离心5min，去除上清。
③将300μL样品3加入已处理好的步骤(2)获得含CHT溶液(0.2mg/μL)的1.5mL离心管中，于室温下不间断的来回颠倒混匀1h。
④将上述颠倒混匀的装有混合液的离心管于4℃，5000rpm，离心5min，吸取上清液留样(记作样品4)(参见图4)。
如图4所示，外泌体重悬试剂为10mM的NaCl时，与CHT反应后，上清中几乎无剩余蛋白，即重悬液中的杂蛋白与CHT反应完全。外泌体重悬试剂为10mM的NaH2PO4时，与CHT反应后，上清中还有部分蛋白剩余。目的在于，在10mM NaH2PO4存在的条件下，使含杂蛋白的外泌体重悬液与羟基磷灰石反应的时候，减少部分蛋白的结合，而不影响外泌体与CHT的反应。故选择10mM NaH2PO4作为外泌体沉淀的重悬试剂。
4)洗涤液浓度的确定
(1)血浆样品的处理方法同上，收集沉淀经10mM NaH2PO4配置的外泌体重悬试剂重悬，此重悬液记作样品1(参见图5)。
(2)移液器吸取200μL CHT溶液(0.25mg/μL)到1.5ml离心管中，5000rpm，离心5min，去除上清，用PBS(pH＝7.4)500μL洗涤一次，5000rpm，离心5min，去除上清。
(3)将300μL样品1加入已处理好的步骤(2)获得含CHT溶液(0.2mg/μL)的1.5mL离心管中，于室温下不间断的来回颠倒混匀1h。
(4)将上述颠倒混匀的装有混合液的离心管于4℃，5000rpm，离心5min，吸取上清液留样(记作样品2)(参见图5)。
(3)吸取500μL 50mM NaCl加入离心管中进行充分洗涤，移液器反复吹打混匀2min后，4℃、5000rpm离心5min，吸出全部上清留样(记作样品3)(参见图5)。
(4)分别吸取500μL含10mM NaH2PO4的不同浓度NaCl溶液加入离心管中进行充分洗涤，每个浓度依次洗涤1次。移液器反复吹打混匀2min后，4℃、5000rpm离心5min，吸出全部上清留样(分别记作样品4、5、6、7、8)(参见图5)，其中，不同浓度NaCl溶液分别为50mM、100mM、500mM、1M、2M。
(5)吸取500μL的200mM NaH2PO4加入离心管中进行充分洗脱，移液器反复吹打混匀2min后，4℃、5000rpm离心5min，吸出全部上清留样(记作样品9)(参见图5)。
如图5所示，由1、2泳道的蛋白条带可知，含杂蛋白的外泌体悬液与CHT反应后的上清液中还剩余有大量的白蛋白及IgG，即在10mM NaH2PO4存在的含杂蛋白的外泌体重悬液中，大量的白蛋白与IgG不与CHT结合。而由1、6泳道的蛋白条带可知，含10mM NaH2PO4的500mM NaCl洗涤液即可将CHT结合的蛋白质几乎全部洗涤下来。而由1、9泳道的蛋白条带可知，200mM NaH2PO4洗脱下来的蛋白质很少，但不确定其中就一定存在外泌体，故需做Western Blot做进一步的验证。
对上述获得的最佳的外泌体重悬试剂、洗涤液、洗脱液，处理样本后经WesternBlot进行验证：
(1)冷冻的血浆样本(来自辽宁中医药大学)于室温下解冻，在4℃，3000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡。将获得的上清液分别取500μL置于1.5mL离心管中依次编号为A、B、C，各离心管分别加入外泌体提取试剂盒(Cat#EXORG30A-1)中的外泌体提取试剂125μL，用移液器反复吹打混匀，4℃孵育30min(或过夜)，并于4℃、1500g离心30min，弃上清，4℃、1500g再离心5min,以彻底去除上清液。各离心管收集的沉淀分别加入950μL 10mM的NaH2PO4，使其彻底溶解。此时获得的即为含杂蛋白的外泌体重悬液(分别记作A1/B1/C1)。
(2)移液器吸取200μL CHT到1.5mL离心管中，5000rpm，离心5min，去除上清，用平衡液500μL洗涤一次，5000rpm，离心5min，去除上清。
(3)分别吸取300μL含杂蛋白的外泌体悬液(A1/B1/C1)加入已处理好的含CHT的3个1.5mL离心管中，于室温下不间断的来回颠倒混匀1h。
(4)将装有混合液的离心管于4℃，5000rpm，离心5min，弃上清。
(5)吸取500μL洗涤液(含10mM NaH2PO4的500mM NaCL)到离心管中，吹打混匀，2min后于4℃，5000rpm，离心5min，弃上清。
(6)吸取150μL洗脱液(200mM NaH2PO4)到离心管中，吹打混匀，2min后于4℃，5000rpm，离心5min，留取上清(记作A4/B4/C4)。
通过BCA法检测A1/B1/C1及A4/B4/C4的蛋白浓度而对比含杂蛋白的外泌体重悬液经纯化后其杂蛋白的减少量(参见表1)。
表1为从人的血清中分离纯化的外泌体，经已定的洗涤液洗涤后CHT上洗脱下来的蛋白含量表
序号 1 2 3 4 5 6
样品号 A1 A4 B1 B4 C1 C4
浓度(μg/μL) 13 5.2 8.8 4.2 12.8 4.7
由表1可知，未经洗涤液洗涤时，A1、B1、C1蛋白质总浓度分别为13μg/μL、8.8μg/μL、12.8μg/μL,经含10mM NaH2PO4的500mM NaCl洗涤液洗涤1次后，A1蛋白浓度降低到5.2μg/μL；B1蛋白浓度降低到4.2μg/μL；C1蛋白浓度降低到4.7μg/μL。由此可见，含10mM NaH2PO4的500mM NaCl洗涤液可有效洗涤结合在CHT上的杂蛋白。
为确保在能够大量洗涤掉白蛋白及IgG的条件下而不损失CHT对外泌体的结合，对洗涤后的CHT进行了洗脱，通过Western Blot实验对其获得的外泌体进行验证(参见图6)，
用10％SDS-PAGE配置胶跑电泳：
①10％SDS-PAGE分离胶的配制：
成分 10％
H2O 4mL
30％Acr/Bise 3.3mL
1.5M Tris-HCL pH8.8 2.5mL
10％SDS 100μL
10％AP 100μL
TEMED 10μL
②10％SDS-PAGE浓缩胶的配制：
上样前处理：
分别吸取各样品20μL于0.5mL离心管中，再分别加入5*loadingbuffer 5μL，移液器反复吹打混合均匀，于100℃加热煮沸10min，待冷却至室温后，分别取20μL进行电泳上样。
电泳：浓缩胶设置80V恒压30min，分离胶设置150V恒压35min，。
转膜:使用NC膜进行湿转，250mM恒流转印1.5h。
封闭：4％脱脂奶粉封闭1h。
洗涤：TBST洗涤3次，5min/次。
铺一抗：严格按购买的抗体说明书进行定量操作。
洗涤：TBST洗涤3次，5min/次。
铺二抗：严格按购买的抗体说明书进行定量操作。
洗涤：TBST洗涤3次，5min/次。
显色：ECL显色。
如图6所示，2、4、6泳道对比1、3、5泳道的蛋白条带更深，说明用10mM NaH2PO4重悬的外泌体重悬液与CHT反应后，经含10mM NaH2PO4的500mM NaCl洗涤1次后，CHT与外泌体的结合并未受影响。最后用200mMNaH2PO4洗脱液将CHT上的外泌体洗脱下来。而经WesternBlot检测ALIX抗体条带清晰可见。也说明洗涤液中500mM NaCl的离子强度并不影响外泌体膜。
故选择含10mM NaH2PO4的500mM NaCl作为洗涤液的最佳浓度。
5)洗涤液(10mM NaH2PO4的500mM NaCl)洗涤次数的确定
方式一：含10mM NaH2PO4的500mM NaCl洗涤液洗涤1次，其余操作方法及用量同上(记作样品A1)。
方式二：含10mM NaH2PO4的500mM NaCl洗涤液洗涤2次，其余操作方法及用量同上(记作样品A2)。
方式三：含10mM NaH2PO4的500mM NaCl洗涤液洗涤3次，其余操作方法及用量同上(记作样品A3)。
含杂蛋白的外泌体重悬液经纯化后，使用10mM NaH2PO4的500mM NaCl洗涤不同的次数，通过BCA法检测A、A1、A2、A3的蛋白浓度，对比经不同洗涤次数后，其杂蛋白的减少量(参见表2)：
表2
序号 1 2 3 4
样品号 A A1 A2 A3
浓度(μg/μL) 15.98 8 4.16 3.82
由表2可知，随着洗涤液洗涤次数的增加，CHT上结合的蛋白质随之减少。未经洗涤液洗涤时，A蛋白质总浓度为15.98μg/μL，经含10mM NaH2PO4的500mM NaCl洗涤液洗涤1次后，蛋白质浓度降低到8μg/μL；经含10mM NaH2PO4的500mM NaCl洗涤液洗涤2次后，蛋白质浓度降低到4.16μg/μL；经含10mM NaH2PO4的500mM NaCl洗涤液洗涤3次后，蛋白质浓度降低到3.82μg/μL。即此洗涤液洗涤2次与3次后蛋白质浓度很接近，故选择用此洗涤液洗涤2次即可。
为确保经不同洗涤次数后，外泌体依然存在于CHT上，用150ul 200mM的NaH2PO4进行洗脱，经Western Blot进行验证，Western Blot实验方法步骤同以上。如图7所示，对比A、A1、A2、A3条带变化，其带型基本相同，即含10mM NaH2PO4的500mM NaCL洗涤液洗涤不同的次数后，并不影响CHT与外泌体的结合，但随着洗涤次数增加，其CHT上的蛋白含量明显减少。又因洗涤液洗涤2次与3次后蛋白质浓度很接近，故选择洗涤2次作为最佳洗涤次数。
通过电镜检测，结果如图8所示，外泌体结构完整，粒径比较均一。
为了了解从血清中分离纯化得到的外泌体的分布情况，我们用纳米颗粒跟踪分析仪来检测，粒径为78.8nm的粒子数占98.1％。结果如图9所示，检测结果为2.4E+11particles/ml，而我们用SBI ExoQuick试剂盒从相同的血清中提取外泌体进行粒径检测，结果为2.3E+11particles/ml，经对比说明，本发明从血清中分离纯化外泌体是可行、有效的。
实施例2
根据上述优化条件得出一套完整的从血清、血浆中分离纯化获得较纯净的外泌体方法。具体步骤如下：
(1)冷冻的血浆样本(来自辽宁中医药大学)于室温下解冻，在4℃，3000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，去除大的囊泡，而后吸取157μL血浆于1.5mL离心管中，加入外泌体提取试剂盒(Cat#EXORG30A-1)中的外泌体提取试剂45μL，用移液器反复吹打混匀，4℃孵育30min(或过夜)，并于4℃、1500g离心30min，弃上清，4℃、1500g再离心5min,以彻底去除上清液。收集的沉淀中加入300μL 10mM的NaH2PO4，使其彻底溶解。此时获得的即为含杂蛋白的外泌体重悬液。
(2)移液器吸取200μL CHT到1.5mL离心管中，5000rpm，离心5min，去除上清，用平衡液500μL洗涤一次，5000rpm，离心5min，去除上清。
(3)将300μL含杂蛋白的外泌体悬液加入已处理好的含CHT的1.5mL离心管中，于室温下不间断的来回颠倒混匀1h。
(4)将装有混合液的离心管于4℃，5000rpm，离心5min，弃上清。
(5)吸取500μL洗涤液(10mM NaH2PO4的500mM NaCl)到离心管中，吹打混匀，2min后于4℃，5000rpm，离心5min，弃上清。
(6)重复步骤(5)再洗涤一次。
(7)吸取150μL洗脱液(200mM NaH2PO4)到离心管中，吹打混匀，2min后于4℃，5000rpm，离心5min，留取上清，该上清中即富含纯净的外泌体。
(8)外泌体的保存：纯化后的外泌体保存于-80℃的超低温冰箱中，以备后续实验正常使用。
实施例3
从细胞培养液、尿液中分离纯化总的外泌体的方法，包括如下具体步骤：
(1)10～15ml细胞培养液(细胞培养液分别为LM3/BALL/Lncap/HepG2)在4℃，2000rpm离心5min，去除悬浮细胞，上清液在4℃，12000g离心20min，弃沉淀，留上清液通过0.22微米孔径滤膜过滤去除较大的微泡，吸取5ml细胞培养液于15ml离心管中，再向离心管中加入外泌体提取试剂盒(Cat#EXORG24B-1)中的外泌体提取试剂750μL，用移液器反复吹打混匀，4℃放置至少30min(或过夜)。
(2)按外泌体提取试剂盒(Cat#EXORG24B-1)中说明书的操作步骤操作，收集的沉淀加入300ul 10mM的NaH2PO4获得含杂蛋白的外泌体重悬液。
(3)移液器吸取200μL CHT到1.5ml离心管中进行预处理，方法同上。
(4)将已获得的外泌体重悬液加入已处理好的含CHT的离心管中，用移液器反复吹打混匀，并于室温下不间断的来回颠倒混匀1h。
(5)将装有混合液的离心管于4℃，5000rpm，离心5min，弃上清。
(6)吸取500μL洗涤液(含10mM NaH2PO4的500mM NaCl)到离心管中，吹打混匀，并转移至1.5mL离心管中，2min后于4℃，5000rpm，离心5min，弃上清。
(7)重复步骤(6)再洗涤一次。
(8)吸取150μL洗脱液(200mM NaH2PO4)到离心管中，吹打混匀，2min后于4℃，5000rpm，离心5min，留取上清，该上清中即富含纯净的外泌体。
(9)外泌体的保存：纯化后的外泌体保存于-80℃的超低温冰箱中，以备后续实验正常使用。
对上述获得的外泌体，通过Western Blot实验进行验证(参见图10)，如图10所示，从LM3/BALL/Lncap/HepG2几种细胞培养液分离纯化后获得的液体均可验证出ALIX,CD9,CD63的外泌体Marker条带，而且清晰可见。并通过电镜检测，如图11所示，外泌体结构比较完整，粒径比较均一，而且丰度很高。
将从细胞培养液BALL中分离纯化得到的外泌体进行粒径检测，粒径为108.1nm的粒子数占98.3％。如图12所示，经稀释后检测结果为2.3E+6particles/ml，原始浓度为2.3E+11particles/ml，而用SBI ExoQuick试剂盒从相同的血清中提取外泌体进行粒径检测，结果为2.0E+11particles/ml。经对比说明本发明从细胞培养液BALL中分离纯化外泌体是可行、有效的。

Claims (8)

1.一种分离和纯化外泌体的方法，其特征在于：从样品中分离获得含杂蛋白的外泌体悬液，利用羟基磷灰石分离纯化获得纯外泌体。
2.按权利要求1所述的分离和纯化外泌体的方法，其特征在于：将含杂蛋白的外泌体悬液加入装有羟基磷灰石的纯化柱中，混匀摇动孵育20-60min后，用含有磷酸二氢钠的NaCl溶液洗涤1-3次；然后利用高浓度的磷酸二氢钠溶液洗脱，得到的洗脱液即为纯净的的外泌体溶液。
3.按权利要求2所述的分离和纯化外泌体的方法，其特征在于：所述洗涤液为含有磷酸二氢钠的500mM NaCl溶液,其中磷酸二氢钠浓度为10mM。
4.按权利要求2所述的分离和纯化外泌体的方法，其特征在于：所述洗脱时高浓度的磷酸二氢钠溶液浓度为10mM-200mM。
5.按权利要求2所述的分离和纯化外泌体的方法，其特征在于：所述含杂蛋白的外泌体悬液与羟基磷灰石体积质量(ul/mg)比为5-7：1。
6.按权利要求1或2所述的分离和纯化外泌体的方法，其特征在于：所述样品为细胞培养液、人体外血清、血浆或尿液。
7.按权利要求1或2所述的分离和纯化外泌体的方法，其特征在于：所述含杂蛋白的外泌体悬液从细胞培养液样品中获得时：细胞培养液在4℃，12000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，过滤后滤液经外泌体提取试剂沉淀，即得含杂蛋白的外泌体悬液；
从生物体液样品中获得时：尿液样品在4℃，12000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，过滤后滤液经外泌体提取试剂沉淀，即得含杂蛋白的外泌体悬液；
从人体外血清、血浆样品中获得时，在4℃，3000g离心15min，弃沉淀，留上清液过0.22μm滤膜，过滤后滤液经外泌体提取试剂沉淀，即得含杂蛋白的外泌体悬液。
8.按权利要求7所述的分离和纯化外泌体的方法，其特征在于：所述外泌体沉淀的重悬试剂为10mM的NaH2PO4。
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