CN112322584A - 一种简便的外泌体提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简便的外泌体提取方法，包括以下步骤：(1)收集外泌体细胞上清液；(2)通过离心去除上清液中的细胞碎片；(3)将去除细胞碎片的上清液转移到超滤管中，使用超滤管富集外泌体；(4)使用PBS对超滤管中富集的外泌体进行洗涤；(5)对洗涤后的外泌体进行盐析，得到相对纯化的外泌体；(6)测定纯化后外泌体的浓度。该方法利用滤过膜截流外泌体，再通过盐析析出大分子量蛋白，解决了外泌体提取困难的问题：该方法可操作性强，真正解决了外泌体提取试剂昂贵、耗时、提取设备要求高、产物纯度不高等问题。因此，使用本发明所述提取方法大大简化了外泌体的提取方法、提高了外泌体的提取质量和提取效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种简便的外泌体提取方法。
背景技术
外泌体(Exosomes)是一种被大多数细胞分泌的微小膜泡；近年来，外泌体凭借其大小及双分子膜等优势在多种疾病模型中呈现出了较细胞水平更为卓越的治疗效果。随着外泌体研究增多，树突状细胞来源的外泌体的相关研究也日益增多。现有外泌体的提取方法主要有以下几种。
1.超速离心法：超离法是最常用的外泌体提取手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多，但过程费时，且回收率不稳定；此外，重复离心操作可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。
2.PEG-base沉淀法：聚乙二醇可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀提取外泌体，但是纯度和回收率低，杂蛋白较多(假阳性)，颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等。
3.超滤离心：由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度不高的问题。
4.磁珠免疫法：外泌体表面有其特异性标记物，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。
发明内容
为了克服上述外泌体提取方法的缺陷，本发明的目的在于提供一种简单、对技术要求不高的提取方法，运用滤网截流大分子蛋白和外泌体，加用盐析分离大分子游离蛋白质的理论，可以最大程度的提取及纯化外泌体。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种简便的外泌体提取方法，包括以下步骤：
(1)收集外泌体细胞上清液；
(2)通过离心去除上清液中的细胞碎片；
(3)将去除细胞碎片的上清液转移到超滤管中，使用超滤管富集外泌体；
(4)使用溶剂对超滤管中富集的外泌体进行洗涤；
(5)对洗涤后的外泌体进行盐析，得到纯化的外泌体；
(6)测定纯化后外泌体的浓度。
优选的，所述步骤(2)的离心条件为：于4℃下以3000g的转速离心20min。
优选的，所述步骤(3)中超滤管的离心条件为：于4℃下以3000g的转速离心30min。
优选的，所述步骤(4)使用的溶剂为PBS。
优选的，所述步骤(5)使用的盐析试剂为饱和硫酸钠。
有益效果：本发明提供了一种简便的外泌体提取方法，该方法利用滤过膜截流外泌体，再通过盐析析出大分子量蛋白，解决了外泌体提取困难的问题：该方法可操作性强，真正解决了外泌体提取试剂昂贵、耗时、产物纯度不高等问题。因此，使用本发明所述提取方法大大提高了外泌体的提取质量和提取效率。
附图说明
图1为本发明所述提取方法的流程示意图。
图2为采用本发明所述提取方法提取的外泌体的电镜图。
图3为WB结果图。
图4为采用BSA法测定外泌体浓度测得的标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种简便的外泌体提取方法，具体提取步骤如下所示：
(1)树突状细胞上清液获取：将树突细胞接种到4个10mm的培养皿，培养在37℃、5％二氧化碳培养箱中，当细胞增殖到80～90％时，用PBS冲洗培养皿2遍，每个培养皿添加7mL无胎牛血清的1640培养液，在培养箱中放置38小时。
(2)收取38小时后的细胞上清液，4℃，3000g，离心20min，将上清液转移到另一个离心管中，去除细胞碎屑。
(3)将液体转移到超滤管中，4℃，3000g，离心30min，将剩余的上清液转移到超滤管中直到所有的上清液全部转移到超滤管中，最后将细胞上清液浓缩到大约400μL；加入5mL PBS清洗，并且倒转超滤管的方向，有助于减少超滤膜上外泌体的残留，4℃，3000g，离心30min，最终将液体浓缩到400μL。
(4)将残留在超滤管中的剩余液体小心地吸入2mL Ep管中，加入饱和的硫酸钠进行盐析，待有白色沉淀析出，离心后取上清，加入5mL PBS稀释后重新装入第三步离心的超滤管中，3000g，30min，收集截流在超滤管上的残留液，即为所需的外泌体，图2为采用本发明所述提取方法提取的外泌体的电镜图。
TSP90、TG101和Alix是外泌体常见的标记物，WB结果(图3)显示采用本发明所述方法提取的上清液中存在外泌体，表明外泌体成功提取。
(5)用BSA法测定外泌体浓度，测得的标准曲线如图4所示，取30μL含外泌体的液体，加入30μL RIPA裂解液(内有蛋白酶抑制剂)，冰上孵育30min，加入96孔板，20μL每孔，3复孔，用BSA测定蛋白浓度，测得的结果如表1所示，从表1中可以看出，重复3次实验，每次提取的浓度在0.4μg/μL左右，说明采用本发明所述方法提取的外泌体浓度较高，且稳定性较好。
表1
| 组别 | 吸光度 | 吸光度 | 吸光度 | 浓度(μg/μL) |
| 组1 | 0.421 | 0.316 | 0.3685 | 0.387544319 |
| 组2 | 0.448 | 0.395 | 0.4215 | 0.469246185 |
| 组3 | 0.448 | 0.398 | 0.423 | 0.471558502 |
。
Claims (5)
1.一种简便的外泌体提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)收集外泌体细胞上清液；
(2)通过离心去除上清液中的细胞碎片；
(3)使用超滤管富集外泌体，使得上清液中的外泌体截流在超滤管中；
(4)使用溶剂对超滤管中富集的外泌体进行洗涤；
(5)对洗涤后的外泌体进行盐析，得到相对纯化的外泌体；
(6)测定纯化后外泌体的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种简便的外泌体提取方法，其特征在于，所述步骤(2)的离心条件为：于4℃下以3000g的转速离心20min。
3.根据权利要求1所述的一种简便的外泌体提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中超滤管的离心条件为：于4℃下以3000g的转速离心30min。
4.根据权利要求1所述的一种简便的外泌体提取方法，其特征在于，所述步骤(4)使用的溶剂为PBS。
5.根据权利要求1所述的一种简便的外泌体提取方法，其特征在于，所述步骤(5)使用的盐析试剂为饱和硫酸钠。
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