CN105349487A - 一种基于外泌体的促人骨髓间充质干细胞增殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，主要涉及早代的人脐带间充质干细胞外泌体在促进人骨髓间充质干细胞生长中的应用，也即一种促进骨髓间充质干细胞生长的方法。同时本发明也涉及到了人脐带间充质干细胞外泌体的提取方法。利用早代人脐带间充质干细胞的外泌体与人骨髓间充质干细胞共培养，可明显促进人骨髓间充质干细胞的生长，缩短细胞倍增时间，增加细胞周期中S期的比例。

Description

一种基于外泌体的促人骨髓间充质干细胞增殖的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，主要涉及早代的人脐带间充质干细胞外泌体在促进人骨髓间充质干细胞生长中的应用，也即一种促进人骨髓间充质干细胞生长的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，经诱导后可分化为多种组织和细胞，由于其取材方便和不具有免疫排斥反应，是再生医学中一种较为理想的种子细胞(参见文献：Dominici,M.,LeBlanc,K.,Mueller,I.,Slaper-Cortenbach,I.,Marini,F.,Krause,D.,Deans,R.,Keating,A.,Prockop,D.,andHorwitz,E.(2006)Minimalcriteriafordefiningmultipotentmesenchymalstromalcells.TheInternationalSocietyforCellularTherapypositionstatement.Cytotherapy.8,315-317)。人骨髓间充质干细胞(humanbonemesenchymalstemcells，hBMSCs)在可以通过体外扩增的方式培养，但在体外培养中，随着培养代数的增加，hBMSCs逐渐显示出衰老的特征，即生长速度逐渐变慢，并逐渐丧失向各胚层分化的能力，细胞形态也由长梭形变得扁平粗大，继而失去临床应用价值(参考文献：SetheS,ScuttA,StolzingA.Agingofmesenchymalstemcells[J].AgeingResRev,2006,5(1):91-116)。每次从骨髓原代培养，能够用于细胞治疗的hBMSCs数量非常有限。

在实验室中通常在培养基中添加了胎牛血清(FBS)成分来促进骨髓间充质干细胞生长，但是该方法增加了收获细胞携带病原体、异种抗原的可能性，并常导致批间不稳定性产生。美国FDA明确禁止将FBS培养的细胞用于细胞治疗。因此，寻找新的可应用于临床细胞治疗的hBMSCs培养基添加物具有重要价值。

脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUMSCs)作为另一种组织来源的间充质干细胞，与hBMSCs相比，hUMSCs具有更强的增殖能力和分化潜能(参考文献：Weiss,M.L.,Medicetty,S.,Bledsoe,A.R.,Rachakatla,R.S.,Choi,M.,Merchav,S.,Luo,Y.,Rao,M.S.,Velagaleti,G.,andTroyer,D.(2006)Humanumbilicalcordmatrixstemcells:preliminarycharacterizationandeffectoftransplantationinarodentmodelofParkinson'sdisease.Stemcells.24,781-792)。因此，本发明人设想，采用人脐带间充质干细胞分泌的成分作为添加物，促进人骨髓间充质干细胞的生长，提高最终细胞得率和质量。

外泌体是近年来发现的一种干细胞分泌的重要成分。外泌体是一种直径在30-100nm之间的脂质双分子囊泡，可携带细胞特异性表达的核酸、脂质、蛋白质等。外泌体通过细胞胞吐的方式分泌，当外泌体在外环境中与靶细胞接触后，可以通过胞膜融合的方式将生物分子传递给靶细胞(参考文献：SimpsonRJ，LiraJW，MoritzRL，et.Exosomes：proteomicinsightsanddiagnosticpotential[J].ExpertRevProteomics，2009，6(3)：267-283)。外泌体作为干细胞分泌物中的重要成分此前有过相关报道，但用于促进细胞体外增殖的报道仅有一例：申请号CN201410705462.3，公开号为CN104382827A的中国专利申请人羊膜间充质干细胞外泌体的用途公开了羊膜间充质干细胞外泌体通过抗氧化应激、抗光老化作用促进HDF细胞的生长的应用方法。但是鉴于不同来源甚至不同培养方式的干细胞分泌的外泌体成分显著不同，不同细胞的培养基配方、生长依赖条件截然不同，无法将其报道的羊膜间充质干细胞外泌体促进HDF细胞生长作用简单类推至其他来源外泌体促进其他类型细胞的作用。因此，干细胞分泌的外泌体能否用于体外促BMSCs增殖生长，目前没有任何文献及专利进行公开报道。

发明内容

本发明的目的在于提供人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进人骨髓间充质干细胞生长试剂中的应用，本发明的另一目的在于提供一种促进骨髓间充质干细胞生长的方法，本发明的第三目的在于提供人脐带间充质干细胞外泌体的提取方法。

经过本发明人的研究，发现人脐带间充质干细胞分泌的外泌体成分具有促BMSCs生长作用，主要体现为细胞周期S期的比例的增加和细胞倍增时间减少。本发明人将标准化制备后的人间充质干细胞外泌体作为人骨髓间充质干细胞培养基的添加成分，促进人骨髓间充质干细胞增殖和质量提升，相关研究尚未有文献及相关专利涉及。

本发明提供了人脐带间充质干细胞外泌体在促进人骨髓间充质干细胞增殖中的作用，可缩短细胞倍增时间，增加细胞周期S期的比例。

本发明提到的人脐带间充质干细胞外泌体由早代(二代以内)的脐带间充质干细胞分泌，并通过一定的步骤提取，可以以液态在冰箱中长期保存(-20℃以下)并保持活性。使用时将外泌体添加入人BMSCs培养基，使外泌体在培养基中的终浓度为20μg/ml即可。

本发明的第一方面在于提供人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进人骨髓间充质干细胞生长试剂中的应用。

本发明所述的人脐带间充质干细胞外泌体由早代(第一代或第二代)的脐带间充质干细胞分泌的。

所述的分泌方法，可以参考文献：Rani,S.,Ryan,A.E.,Griffin,M.D.,andRitter,T.(2015)MesenchymalStemCell-derivedExtracellularVesicles:TowardCell-freeTherapeuticApplications.Moleculartherapy:thejournaloftheAmericanSocietyofGeneTherapy.23,812-823。

在本发明的一个优选实施例中，本发明所述的人脐带间充质干细胞外泌体，是通过以下方法制备得到的：

(1)采用第二代脐带间充质干细胞置于10cm培养皿中，加入10ml间充质干细胞培养基(可采用商品化培养基或自行配置培养基)，37℃、5％CO₂饱和湿度培养24h后收集上清；

所述的人脐带间充质干细胞培养基，优选配方为：含质量百分比5％UltraGRO(达科为公司)和含质量百分比0.032％医用肝素钠的α-MEM基础培养基(gibco公司)。(2)将收集的脐带间充质干细胞上清25ml于4℃，1000Χg离心10min，以去除死细胞等杂质，然后将去除杂质的上清于4℃，10000Χg离心20min以去除细胞碎片，然后将去除杂质的上清移至超速离心管，于4℃，120000Χg离心60min，去除上清，加入400μlPBS收集底部沉淀，最后通过0.22μm无菌滤膜过滤，分装后放于-80℃保存，并用BCA蛋白质定量试剂盒进行蛋白质浓度测定；

(3)通过透射电镜观察外泌体形态和westernblot方法检测外泌体标志蛋白CD9和CD63的表达情况，来对脐带间充质干细胞外泌体进行鉴定。

所述的促进人骨髓间充质干细胞生长试剂，包含人脐带间充质干细胞外泌体，还包含人骨髓间充质干细胞生长的常规培养基。

较优的，将本发明的脐带间充质干细胞分泌的外泌体用于人骨髓间充质干细胞共培养，即将人脐带间充质干细胞外泌体加入人骨髓间充质干细胞生长的常规培养基中。

在本发明的一个优选实施例中，使用时将上述人脐带间充质干细胞来源外泌体以终浓度10-20μg/ml(优选20μg/ml)添加入人BMSCs培养基即可。

所述的人BMSCs培养基为，含质量百分比5％UltraGRO(达科为公司)和含质量百分比0.032％医用肝素钠的α-MEM基础培养基(gibco公司)。

所述人脐带间充质干细胞来源外泌体以终浓度20μg/ml添加入人BMSCs培养基的具体步骤为：

在α-MEM基础培养基中按比例依次加入质量百分比5％的UltraGRO和质量百分比0.032％的医用肝素钠，再以20μg/ml的终浓度按比例加入人脐带间充质干细胞来源外泌体，最后将培养基放置于4℃保存，使用保质期为一个月。

本发明的第二方面在于提供一种促进骨髓间充质干细胞生长的方法。

(1)制备培养基：将上述人脐带间充质干细胞来源外泌体以终浓度10-20μg/ml(优选20μg/ml)添加入人BMSCs培养基。

(2)将人骨髓间充质干细胞(骨髓原代培养，骨髓来源于长征医院骨科，制备方法参考文献：Majumdar,M.K.,Banks,V.,Peluso,D.P.,andMorris,E.A.(2000)Isolation,characterization,andchondrogenicpotentialofhumanbonemarrow-derivedmultipotentialstromalcells.Journalofcellularphysiology.185,98-106)按每孔1000个细胞的浓度接种到96孔板，然后加入定量蛋白浓度后人脐带间充质干细胞外泌体，即加入上述步骤(1)得到的加入人脐带间充质干细胞来源外泌体的人BMSCs培养基，并设置空白对照组。

(3)培养条件：将细胞放置于37℃、5％CO₂饱和湿度二氧化碳培养箱，过6h、12h、24h、36h后细胞计数，绘制细胞生长曲线。如附图3所示，加入人脐带间充质干细胞外泌体后，细胞生长速度变快。

本发明的第三方面在于提供人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，所述的制备方法优选如下：

(1)采用第二代脐带间充质干细胞置于10cm培养皿中，加入10ml间充质干细胞培养基(可采用商品化培养基或自行配置培养基)，37℃、5％CO₂饱和湿度培养24h后后收集上清。

(2)将收集的脐带间充质干细胞上清25ml于4℃，1000Χg离心10min，以去除死细胞等杂质，然后将去除杂质的上清于4℃，10000Χg离心20min以去除细胞碎片，然后将去除杂质的上清移至超速离心管，于4℃，120000Χg离心60min，去除上清，加入400μlPBS收集底部沉淀，最后通过0.22μm无菌滤膜过滤，分装后放于-80℃保存，并用BCA蛋白质定量试剂盒进行蛋白质浓度测定。

(3)通过透射电镜观察外泌体形态和westernblot方法检测外泌体标志蛋白CD9和CD63的表达情况，来对脐带间充质干细胞外泌体进行鉴定。

本发明的有益效果如下：

本发明将人脐带间充质干细胞来源的外泌体用于促干细胞增殖，是一种非化学合成的添加物，成分确定且质量标准可控，外泌体性质稳定，可放置-20℃以下环境长期保存。

附图说明

图1为透射电镜观察人脐带间充质干细胞外泌体的基本形态；

图2为WesternBlot检测人脐带间充质干细胞外泌体的标志物CD63和CD9的表达情况；

图3为人脐带间充质干细胞外泌体对人骨髓间充质干细胞数量增加的促进作用；

图4为人脐带间充质干细胞外泌体对人骨髓间充质干细胞细胞周期S期的促进作用。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明进行更好的阐述，以便于对本发明更好的理解。

实施例1：脐带间充质干细胞的分离纯化

所使用的的主要材料和来源分别如下：

试剂：低糖DMEM(gibco公司产品)、间充质干细胞培养基(达克为公司产品)、胰蛋白酶(gibco公司产品)、BCA蛋白定量试剂盒(碧云天公司)、5ΧSDS上样缓冲液、CD63兔抗人抗体(BDpharmingen公司)、CD9兔抗人抗体(BDpharmingen)、HRP标记的羊抗兔IgG二抗(天根公司)、ECL化学发光检测试剂盒(碧云天公司)。

仪器：倒置显微镜(Olympus公司)、二氧化碳培养箱(Thermo公司)、净化工作台、台式离心机、透射电子显微镜(Philips公司)、化学发光凝胶成像系统(bioshine公司)。

脐带来源于长海医院妇产科。

一、人脐带间充质干细胞的培养：

获取脐带后将其装在含有无菌PBS或者DMEM培养基的无菌培养皿或瓶内，尽快操作。取新生儿的新鲜脐带，经磷酸盐缓冲液反复冲洗后，浸泡于含有青链霉素的L-DMEM(青链霉素浓度均为100IU/ml)约5分钟，剪成直径约1.5mm大小的组织块；间充质干细胞培养基，5％CO2、37℃饱和湿度培养；待7—10日后可见间充质干细胞爬出组织，移去组织块后以0.25％胰蛋白酶消化进行传代培养。

二、人脐带间充质干细胞上清的制备：

将培养的原代脐带间充质干细胞培养至P2代后置于10cm培养皿中，，每个培养皿中加入10ml间充质干细胞培养基，于37℃、5％CO₂饱和湿度培养24h后收集上清，此时用倒置显微镜观察，细胞密度应在80％以上。三、人脐带间充质干细胞外泌体的分离纯化：

将收集的脐带间充质干细胞上清25ml于4℃，1000Χg离心10min，以去除死细胞等杂质，然后将去除杂质的上清于4℃，10000Χg离心20min以去除细胞碎片，然后将去除杂质的上清移至超速离心管，于4℃，120000Χg离心60min，去除上清，加入400μlPBS收集底部沉淀，最后通过0.22μm无菌滤膜过滤，分装后放于-80℃保存，并用BCA蛋白质定量试剂盒进行蛋白质浓度测定。

四、电镜观察外泌体的基本形态：

取人脐带间充质干细胞外泌体20μl与等量2％的磷钨酸钠水溶液混合，制成混悬液后，用吸管递加至铜网膜上，室温放置5min后，用滤纸吸取多余的水分，将铜圈放在白炽灯下烘干，置于透射电镜下拍照，如图1所示囊泡状结构。

五、westernblot检测外泌体表面标记蛋白：

将BCA测定浓度后的外泌体，按20μg的上样量，用PBS补足到24μl，加入6μl的5ΧSDS上样缓冲液混合，煮沸5min，80V恒压电泳90min，350mA恒流电转移至PVDF膜，用含5％BSA的TBS封闭1h，分别与兔抗人CD9和兔抗人CD63一抗(1:500)于4℃反应过夜，用含0.5％吐温20的TBS洗膜三次后，与HRP标记的的羊抗兔二抗(1:1000)室温反应2h，通过化学发光凝胶成像系统检测，如图2所示，人脐带间充质干细胞外泌体CD9与CD63阳性表达。

实施例2：细胞增殖实验

一、细胞计数

将人骨髓间充质干细胞(骨髓原代培养，骨髓来源于长征医院骨科，制备方法参考文献：Majumdar,M.K.,Banks,V.,Peluso,D.P.,andMorris,E.A.(2000)Isolation,characterization,andchondrogenicpotentialofhumanbonemarrow-derivedmultipotentialstromalcells.Journalofcellularphysiology.185,98-106)按每孔1000个细胞的浓度接种到96孔板，然后加入定量蛋白浓度后的人脐带间充质干细胞外泌体，分别按最后定量到培养基中为10μg/ml和20μg/ml的终浓度添加，将其设为10μg/ml组和20μg/ml组，同时设置空白对照组，设置6h、12h、24h、36h四个计数时间点，每组每个时间点设置三个孔，将细胞放置于37℃、5％CO₂饱和湿度二氧化碳培养箱培养，将此时的时间设为0h，过6h、12h、24h、36h后细胞计数，绘制细胞生长曲线。如图3所示，加入人脐带间充质干细胞外泌体的10μg/ml组和20μg/ml与空白对照组相比，人骨髓间充质干细胞生长速度变快，并且，加入外泌体的20μg/ml组细胞生长速度要快于10μg/ml组，证明人骨髓间充质干细胞生长速度与外泌体浓度存在正相关性。

二、细胞周期检测

将人骨髓间充质干细胞按每孔20000个细胞的浓度接种到6孔板，然后加入定量蛋白浓度后的人脐带间充质干细胞外泌体，分别按最后定量到培养基中为10μg/ml和20μg/ml的终浓度添加，将其设为10μg/ml组和20μg/ml组，并设置空白对照组，于37℃、5％CO₂饱和湿度培养48h后，收集细胞，用细胞周期检测试剂盒(联科生物公司)反应30min后，用流式细胞仪(BD公司)检测细胞周期G1期、G2期和S期。如图4所示，加入人脐带间充质干细胞外泌体后，人骨髓间充质干细胞中，细胞周期S期的比例增加，并且，加入外泌体的20μg/ml组细胞S期比例要高于10μg/ml组，证明添加人脐带间充质干细胞外泌体到培养基与人骨髓间充质干细胞共培养，可以加快细胞的DNA复制，加快细胞的增殖。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进人骨髓间充质干细胞生长试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进人骨髓间充质干细胞生长试剂中的应用，其特征在于，所述的人脐带间充质干细胞外泌体是由第一代或第二代的脐带间充质干细胞分泌的。

3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进人骨髓间充质干细胞生长试剂中的应用，其特征在于，所述的人脐带间充质干细胞外泌体，是通过以下方法制备得到的：

A、采用第二代脐带间充质干细胞置于10cm培养皿中，加入10ml间充质干细胞培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度培养24h后收集上清；

B、将收集的脐带间充质干细胞上清25ml于4℃，1000Χg离心10min，以去除杂质，然后将去除杂质的上清于4℃，10000Χg离心20min以去除细胞碎片，然后将去除杂质的上清移至超速离心管，于4℃，120000Χg离心60min，去除上清，加入400μlPBS收集底部沉淀，最后通过0.22μm无菌滤膜过滤，分装后放于-80℃保存。

4.根据权利要求3所述的人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进人骨髓间充质干细胞生长试剂中的应用，其特征在于，所述的人脐带间充质干细胞培养基，配方为：含质量百分比5％UltraGRO和含质量百分比0.032％医用肝素钠的α-MEM基础培养基。

5.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进人骨髓间充质干细胞生长试剂中的应用，其特征在于，所述的促进人骨髓间充质干细胞生长试剂，包含人脐带间充质干细胞外泌体，还包含人骨髓间充质干细胞生长的常规培养基。

6.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进人骨髓间充质干细胞生长试剂中的应用，其特征在于，将脐带间充质干细胞分泌的外泌体用于人骨髓间充质干细胞共培养，即将人脐带间充质干细胞外泌体加入人骨髓间充质干细胞生长的常规培养基中。

7.根据权利要求6所述的人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进人骨髓间充质干细胞生长试剂中的应用，其特征在于，使用时将上述人脐带间充质干细胞来源外泌体以终浓度10-20μg/ml添加入人BMSCs培养基。

8.根据权利要求7所述的人脐带间充质干细胞外泌体在制备促进人骨髓间充质干细胞生长试剂中的应用，其特征在于，所述的人BMSCs培养基为，含质量百分比5％UltraGRO和含质量百分比0.032％医用肝素钠的α-MEM基础培养基。

所述人脐带间充质干细胞来源外泌体以终浓度10-20μg/ml添加入人BMSCs培养基的具体步骤为：

在α-MEM基础培养基中按比例依次加入质量百分比5％的UltraGRO和质量百分比0.032％的医用肝素钠，再以10-20μg/ml的终浓度按比例加入人脐带间充质干细胞来源外泌体，最后将培养基放置于4℃保存。

9.一种促进骨髓间充质干细胞生长的方法，具体步骤如下：

A、制备培养基：将上述人脐带间充质干细胞来源外泌体以终浓度10-20μg/ml添加入人BMSCs培养基；

B、将人骨髓间充质干细胞按每孔1000个细胞的浓度接种到96孔板，然后加入定量蛋白浓度后人脐带间充质干细胞外泌体，即加入上述步骤A得到的加入人脐带间充质干细胞来源外泌体的人BMSCs培养基；

C、培养条件：将细胞放置于37℃、5％CO₂饱和湿度二氧化碳培养箱。

10.人脐带间充质干细胞外泌体的制备方法，所述的制备方法如下：

A、采用第二代脐带间充质干细胞置于10cm培养皿中，加入10ml间充质干细胞培养基，37℃、5％CO₂饱和湿度培养24h后后收集上清；

B、将收集的脐带间充质干细胞上清25ml于4℃，1000Χg离心10min，以去除杂质，然后将去除杂质的上清于4℃，10000Χg离心20min以去除细胞碎片，然后将去除杂质的上清移至超速离心管，于4℃，120000Χg离心60min，去除上清，加入400μlPBS收集底部沉淀，最后通过0.22μm无菌滤膜过滤，分装后放于-80℃保存。